《DNA甲基化酶》PPT课件
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DNA甲基化的特征 PPT
DNA甲基化的特征
一.DNA甲基化与羟甲基化
1.胞嘧啶 2.第五个C原子上 3.甲基或羟甲基的修饰
二.DNA甲基化分布
1. DNA甲基化发生在CpG dinucleotides
低频率! 42% GC ，
在人基因组中的频率为1%，而含有 理论值上为（0.21 * 0.21 = 4.41
%）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2. CpG island
Gene: CpG transcription start sites (TSS), cis-
regulatory elements
四. DNMTs-功能
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
四. DNMTs-结构
五.TET家族蛋白-功能 (5mC
5hmC)
五.TET蛋白-结构
I.不被甲基化
II.长度为500-2000bp
III.常分布在看家基因和特异性基因启动子区
二.DNA甲基化的分布
1 基因内甲基化抑制转录延伸，但与基因表达为正相关。 2 CpG island 不被甲基化可能与使得基因维持可以转录状态有关
二.DNA甲基化分布的特殊情况
1.在非CpG环境下的低水平甲基化 （功能未知）
ES cells, oocytes, and brain （不发生DNA复制）
2.启动子中CpG island 发生甲基化
imprinted and pluripotency-related genes （长期转录
沉默）
三.DNA羟甲基化的分布
cell： ES cells(0.03%) , Purkinje neurons(0.59%)
Demethylation :
一.DNA甲基化与羟甲基化
1.胞嘧啶 2.第五个C原子上 3.甲基或羟甲基的修饰
二.DNA甲基化分布
1. DNA甲基化发生在CpG dinucleotides
低频率! 42% GC ，
在人基因组中的频率为1%，而含有 理论值上为（0.21 * 0.21 = 4.41
%）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2. CpG island
Gene: CpG transcription start sites (TSS), cis-
regulatory elements
四. DNMTs-功能
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
四. DNMTs-结构
五.TET家族蛋白-功能 (5mC
5hmC)
五.TET蛋白-结构
I.不被甲基化
II.长度为500-2000bp
III.常分布在看家基因和特异性基因启动子区
二.DNA甲基化的分布
1 基因内甲基化抑制转录延伸，但与基因表达为正相关。 2 CpG island 不被甲基化可能与使得基因维持可以转录状态有关
二.DNA甲基化分布的特殊情况
1.在非CpG环境下的低水平甲基化 （功能未知）
ES cells, oocytes, and brain （不发生DNA复制）
2.启动子中CpG island 发生甲基化
imprinted and pluripotency-related genes （长期转录
沉默）
三.DNA羟甲基化的分布
cell： ES cells(0.03%) , Purkinje neurons(0.59%)
Demethylation :
DNA甲基化和癌症PPT培训课件
DNA甲基化位点
CpG岛或富含CpG岛的区域
CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持 或高于正常概率，这些区段被 称作CpG岛。
CCAGGCCTGGCCTTGACAGGCGGGCGGAGCAGCCAGTGCGAGACAGGGAGGCCGGTGCGGGTGCGGGAACC TGATCC GGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGGAGGGGCCGGCGCCCGCCTTCCTCCCCGGGGCCCTC CGGCG TCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCC TCGCC CCGCGCGACCCGCTG
表观遗传学/Epigenetics
定义 ‘Epi’genetics - ‘On’ or ‘over’ the genetic information encoded in the
DNA 基因型不变的情况下，影响表型并能遗传的现象， 称为表观遗传或后生遗传。
表观遗传学研究的是在基因组DNA序列不变的 情况下，在表型上具有的稳定的、可遗传(或潜 在的可遗传性)的变化。
President？
TV host？
基因
环境
表观遗传学
表型
相同的基因型
?
不同的表型
什么是表观遗传学？
表观遗传学： 基因序列无变化
基因功能发生变化 可遗传并且是可逆的
表观遗传学机制： DNA甲基化
组蛋白修饰 RNA调控（RNA干扰，
microRNA, long noncoding RNA等)
存在很大差异。
现象3： 肿瘤抑制基因被过量地甲基化而导致失去活性，而基因 的DNA序列并不发生变化。
DNA甲基化与癌症PPT课件
• 细胞生长抑制因子对细胞生长的调控存在多种机 制，其中由pRb 参与的G1 / S 检测点调控尤其重
要。正常情况下：
结合 p16蛋白 CDK4 /6
阻止
CDK 复合物与 周期蛋白D结合
促使
pRb不 能磷酸化
起到抑制细胞 生长的作用
阻止细胞从G1 期进入S 期
结合
未磷酸化
E2F
的pRb
2.DNA甲基化与肿瘤细胞对生长抑制信号不敏 感机制
使p53发生蛋白 质水平的降解
MDM2 表达上升
结合p53
1.DNA甲基化与肿瘤细胞逃避细胞死亡机制
• BNIP3，是一个凋亡相关因子，它定位于线粒体， 可以诱导细胞在缺氧情况下发生凋亡
BNIP3 启动子 区高甲基化
引起BNIP3 表达沉默
导致细胞逃避 缺氧时的凋亡
2.DNA甲基化与肿瘤细胞对生长抑制信号不敏 感机制
• DNA甲基化发生时：
p16 基因的启 动子区域甲基化
p16 蛋白表达 受到抑制
TGFβ生长抑制信 号通路失去作用
在丙肝病毒感染的肝细胞中，发现 了丙肝病毒的核心蛋白(core protein)可引起p16基因启动子的甲 基化，p16表达水平下降从而促进了 细胞的分裂，在丙肝诱导的肝癌中 起着重要的作用。
• 近几年的研究发现，特定基因的DNA高甲基 化在这些过程中均发挥重要作用
1.DNA甲基化与肿瘤细胞逃避细胞死亡机制
• p53基因是一个重要的抑癌基因，可以促使损伤细 胞发生凋亡
INK4a /ARF 基因启 动子区域的甲基化
使细胞逃离p53 引起的凋亡
使p14ARF 表达下降
（p14ARF的作用 是抑制MDM2表达）
EGCG) 在实验中均表现出了对肿瘤的抑制作用。
要。正常情况下：
结合 p16蛋白 CDK4 /6
阻止
CDK 复合物与 周期蛋白D结合
促使
pRb不 能磷酸化
起到抑制细胞 生长的作用
阻止细胞从G1 期进入S 期
结合
未磷酸化
E2F
的pRb
2.DNA甲基化与肿瘤细胞对生长抑制信号不敏 感机制
使p53发生蛋白 质水平的降解
MDM2 表达上升
结合p53
1.DNA甲基化与肿瘤细胞逃避细胞死亡机制
• BNIP3，是一个凋亡相关因子，它定位于线粒体， 可以诱导细胞在缺氧情况下发生凋亡
BNIP3 启动子 区高甲基化
引起BNIP3 表达沉默
导致细胞逃避 缺氧时的凋亡
2.DNA甲基化与肿瘤细胞对生长抑制信号不敏 感机制
• DNA甲基化发生时：
p16 基因的启 动子区域甲基化
p16 蛋白表达 受到抑制
TGFβ生长抑制信 号通路失去作用
在丙肝病毒感染的肝细胞中，发现 了丙肝病毒的核心蛋白(core protein)可引起p16基因启动子的甲 基化，p16表达水平下降从而促进了 细胞的分裂，在丙肝诱导的肝癌中 起着重要的作用。
• 近几年的研究发现，特定基因的DNA高甲基 化在这些过程中均发挥重要作用
1.DNA甲基化与肿瘤细胞逃避细胞死亡机制
• p53基因是一个重要的抑癌基因，可以促使损伤细 胞发生凋亡
INK4a /ARF 基因启 动子区域的甲基化
使细胞逃离p53 引起的凋亡
使p14ARF 表达下降
（p14ARF的作用 是抑制MDM2表达）
EGCG) 在实验中均表现出了对肿瘤的抑制作用。
表观遗传学-DNA甲基化59页PPT
招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
表观遗传学-DNA甲基化
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
表观遗传学-DNA甲基化
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
DNA甲基化的特征ppt课件
2. CpG island
I.不被甲基化
II.长度为500-2000bp
III.常分布在看家基因和特异性基因启动子区域
最新课件
3
二.DNA甲基化的分布
1 基因内甲基化抑制转录延伸，但与基因表达为正相关。 2 CpG island 不被甲基化可能与使得基因维持可以转录状态有关
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4
二.DNA甲基化分布的特殊情况
第一次卵裂前
几次卵裂后
最新课件
11
不发生Reprogramming of DNA methylation：
•1. imprinted loci •2. repeats intracisternal A particles (IAPs), L1Md_A elements, LTR ERV1 elements •3. CpG islands
意义： DNA甲基化使得减数分裂 相关的基因沉默，去甲基 化可以使其恢复功能。
最新课件
13
八.Global demethylation in erythropoiesis
最新课件
14
最新课件
15
Purkinje neurons
最新课件
16
感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络， 如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！
TET3 1与受精卵表观重编程有关 oocytes
1丧失干细胞特性？ CXXC domain？ 2发育延迟和低生育力
1造血缺陷
1增加发育失败的概率 CXXC domain？ 2受精卵着床前不能去 除5hmC
最新课件
9
五.TET蛋白-结构
最新课件
10
六.Reprogramming of DNA methylation during preimplantation development
I.不被甲基化
II.长度为500-2000bp
III.常分布在看家基因和特异性基因启动子区域
最新课件
3
二.DNA甲基化的分布
1 基因内甲基化抑制转录延伸，但与基因表达为正相关。 2 CpG island 不被甲基化可能与使得基因维持可以转录状态有关
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4
二.DNA甲基化分布的特殊情况
第一次卵裂前
几次卵裂后
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11
不发生Reprogramming of DNA methylation：
•1. imprinted loci •2. repeats intracisternal A particles (IAPs), L1Md_A elements, LTR ERV1 elements •3. CpG islands
意义： DNA甲基化使得减数分裂 相关的基因沉默，去甲基 化可以使其恢复功能。
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八.Global demethylation in erythropoiesis
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Purkinje neurons
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TET3 1与受精卵表观重编程有关 oocytes
1丧失干细胞特性？ CXXC domain？ 2发育延迟和低生育力
1造血缺陷
1增加发育失败的概率 CXXC domain？ 2受精卵着床前不能去 除5hmC
最新课件
9
五.TET蛋白-结构
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10
六.Reprogramming of DNA methylation during preimplantation development
DNA甲基化检测技术ppt课件
MS-HRM检测方法及步骤
4. DNA样本的甲基化修饰：
可使用FFPE Tissue Kit (QIAGEN) 对DNA甲基化修饰及回收；
3. PCR扩增：
a. 上样体系 b. PCR-HRM反应程序
MS-HRM检测方法及步骤
a. 上样体系：
反应体系组分(20μL) 10×PCR Buffer(15 mM mgcl2)
癌
与DNA 修复与转录激活有关 周期素依赖性蛋白激酶抑制剂
乳腺癌、卵巢癌 GIT 、头与颈部瘤、NHL、肺癌
钙/钙调素-依赖的丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶; 凋亡抑制 肺癌
E-cadherin ER GSTP1 hMLH1
MGMT P15
增强增殖、侵袭与转移 激素抵抗 失去对致癌物活性代谢产物的解毒作用 缺损DNA错配修复,基因点突变
DNA甲基化的形式：
DNA甲基化主要形成5-mC和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌 呤（7-mG）
CpG 岛（CpG Island）
在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译 区和第一个外显子区，CpG序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为 鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。
DNA甲基化与肿瘤的关系
MGMT基因在许多肿瘤中被认为是抗肿瘤药物治疗的预测标记。MGMT启 动子肿瘤特异性甲基化，可以抑制MGMT蛋白的活性，从而使得肿瘤细胞对 烷化类的抗肿瘤药物敏感，因而被广泛用于肿瘤化疗治疗。
Figure： Kaplan–Meier Estimates of Overall Survival, According to MGMT Promoter Methylation Status.
DNA甲基化25931ppt课件
精品ppt
18
精品ppt
19
哺乳动物基因组中约有 5%- 10%是 CpG位点 ，其中约有 70%为 mCpG。
CpG 位点不是均匀分布，而是呈现局部聚集倾 向，形成一些 GC 含量较高、CpG 双核苷酸相 对聚集的区域，即 CpG 岛。
精品ppt
20
CpG岛
CpG岛主要位于基因的启动子区，少量位于基因 的第一个外显子区；其甲基化状态直接影响基因表 达。
基因组里跳来跳去，把基因组搞得一团糟，会引起很 多问题，如肿瘤、精神疾病等。
精品ppt
16
酵母与果蝇基因组中未能检测到任何甲基化 CpG，这两种生物并不依赖DNA甲基化的方 式来控制基因活性，它们采用其它的机制来 达到同一目的。
脊椎动物与高等植物普遍利用DNA甲基化作 为重要的调控机制。
精品ppt
17
DNA甲基化的分子机理
指在 DNA 甲基转移酶 (DNMTs)的作用下， 以 S -腺苷甲硫氨酸 ( SAM )为甲基供体，将 甲基添加在 DNA分子中的碱基上。
常见的 DNA 甲基化发生在 DNA 链上的胞 嘧啶第 5位碳原子和甲基间的共价结合，胞 嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶 ( 5mC) 。
精品ppt
6
骡和駃騠
基因印记
前者又称马骡，是公驴与母马杂交的后代，体大、耳小而尾 部蓬松; 后者又叫驴骡，是公马与母驴杂交的后代，相对来说 体小、耳大而尾毛较少。这个现象表明，来源于不同性别亲 本的遗传物质在后代表达的功能可以有差别。这就是基因印 记。
Hinny 駃騠
精M品puplte
7
类胰岛素生长因子
甲基化的 CpG 双核苷酸通过募集转录抑制因子或 者阻碍转录激活因子的结合抑制基因的表达。
《解读DNA甲基化》幻灯片
中国测序论坛
影响DNA甲基化的因素
1、DNA甲基转移酶（DNMT）
2、组蛋白甲基化 3、RNA干扰
中国测序论坛
1、DNA甲基转移酶〔DNMT〕
• DNA甲基化是由DNMT催化完成的，哺乳动物细胞中有活性的 DNMT有3种，他们是DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。
• 甲基化形式的遗传是通过维持型甲基化酶DNMT1；甲基化形式的改 变那么是通过重新甲基化酶DNMT3a和DNMT3b，两类酶确保了在 生命过程中既相对稳定又可适时调节的表观遗传学遗传，在胚胎发育 中起重要作用。
中国测序论坛
5、DNA甲基化与肿瘤
• 肿瘤细胞的特征：
癌基因低甲基化 ——被激活；
抑癌基因高甲基化 ——被沉默
肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，其特点是总体的 甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。
•
低甲基化可诱导原癌基因和转座子成分活化，基因印迹缺失以
及染色体不稳定性增加，最终诱发肿瘤
•
在整体低甲基化的水平下，某些抑癌基因发生高甲基化，导致
a) 研究证明细菌DNA复制起始与DNA甲基化以及 DNA与细菌质膜的相互作用有关。DNA便甲基化 作为一种标签决定了复制起始点与细胞膜的结合， 控制了复制起始，使得DNA复制与细胞分裂保持一 致。
b) DNA错配修复〔mismatch repair〕作为细胞增殖 过程中纠正DNA复制错误的重要手段，对保证 DNA复制的忠实性与基因组的稳定性起重要作用。 复制后双链DNA在短期内〔数分钟〕保持半甲基化 状态，错配修复系统从而能够区分“旧链〞与“新 链’〞，为校正新链中掺入的错误碱基提供了理想
• DNMT1和DNMT3b共同维持DNA甲基化和基因沉默。
DNA甲基化酶
5. 其它甲基化酶
DNMT1 1988年克隆出的真核生物的甲基转移酶.
具有催化作用的c端和调节功能的N端.
三、依赖于甲基化的限制系统
依赖于甲基化的内切酶
E.coli中至少有3种依赖于甲基 化的限制系统 它们识别的序列各不相同， 但只识别经过甲基化的序列
mcrA, mcrBC, mrr
• 都限制由 CG甲基化酶(MSssI)作用的DNA
2.Dcm甲基化酶
DNA cytsine methylase
识别CCAGG或CCTGG序列 在第二个C上C5位置上引入甲基
EcoRII / BstNI CCA(T)GG 二者识别序列相同，但切点不同 EcoRII受dcm甲基化作用影响
BstNI可避免这一影响
受影响酶有： Acc65I GGTACC AlwNI ApaI GGGCCC EcoRII EaeI 等
3. 用于研究细胞DNA中位点特异性甲基 化的水平及分布 哺乳动物m5CG、植物的m5CG，m5CNG 肠道细胞的Gm6ATC C m5/4 CGG MspI可切割，HpaII不可切割 Gm6ATC Sau3AI 可切割，MobI不可切割
其它
4. 对基因组作图的影响 在哺乳动物DNA CpG序列出现的频率大约只有预计的1/5 含CpG序列的识别序列极其稀少
第二节 甲基化酶 Methylase
methyltransferase
Methylation
原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员， 用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。
一、DNA甲基化酶
甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺 序。甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基 化，保护DNA不被限制性内切酶切开。
甲基化原理ppt课件
3、高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM） 在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片 段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化 的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发 生改变，从而导致熔解温度的变化（图1）。
2、亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP） 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的 随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产 就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后 可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
尽管这些甲基化图谱的绘制方 法略有不同，但他们都采用了 亚硫酸氢盐转化，将未甲基化 的胞嘧啶转化成尿嘧啶，并在 随后的扩增步骤中转化成胸腺 嘧啶。虽然很有效，但这种方 法需要一些手工操作来确保完 全的转化，并通过计算分析来 绘制图谱。
另外，两个独立的研究小组，分别为哈佛大 学的George Church等，以及加州大学的 Kun Zhang连同弗吉尼亚联邦大学的Yuan Gao等，也将传统的甲基化工具如DNA的重 亚硫酸盐转化与目标基因组捕获技术和高通 量测序相结合，定量测定人基因组中的甲基 化。
.
11
DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移 到特定的碱基上的过程。DNA甲基化可以发生在
腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上生成5甲基胞嘧啶(5mC)
2、亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP） 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的 随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产 就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后 可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
尽管这些甲基化图谱的绘制方 法略有不同，但他们都采用了 亚硫酸氢盐转化，将未甲基化 的胞嘧啶转化成尿嘧啶，并在 随后的扩增步骤中转化成胸腺 嘧啶。虽然很有效，但这种方 法需要一些手工操作来确保完 全的转化，并通过计算分析来 绘制图谱。
另外，两个独立的研究小组，分别为哈佛大 学的George Church等，以及加州大学的 Kun Zhang连同弗吉尼亚联邦大学的Yuan Gao等，也将传统的甲基化工具如DNA的重 亚硫酸盐转化与目标基因组捕获技术和高通 量测序相结合，定量测定人基因组中的甲基 化。
.
11
DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移 到特定的碱基上的过程。DNA甲基化可以发生在
腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上生成5甲基胞嘧啶(5mC)
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依赖于甲基化的内切酶
E.coli中至少有3种依赖于甲基 化的限制系统 它们识别的序列各不相同， 但只识别经过甲基化的序列
精品医学
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mcrA, mcrBC, mrr
• 都限制由 CG甲基化酶(MSssI)作用的DNA
• Mrr也限制m6A
• McrBC 切割两套位点（G/A）mC， 这两套位点之间间隔2kb，最适为 55～103bp，需GTP
如:BclI, ClaI, MboI, XbaI 等这;甲基化
敏感的限制性内切酶.
不敏感的有 BamHI, Sau3AI, BglII, PvuI等.
MboⅠ 和 Sau3AⅠ 识别和切割位点相同，但其差异就在 于前者对甲基化敏感。
精品医学
9
一般哺乳动物DNA 不会在A-N6上甲基化
当需要在敏感位点上完全切割DNA时， 必须从dam- E.coli中提取DNA
真核生物中目前只发现5-甲基胞嘧啶（M5C）。 M5C占整个胞嘧啶中的2～7%（果蝇和某些昆虫例 外）。M5C大多以M5CpG的形式存在，不同物种 或同一物种的不同组织中，M5C出现的频率也不尽 相同。
精品医学
3
将限制性内切酶和甲基化酶同时作用，可使有几种可 能识别顺序的限制性内切酶只对其中一种识别顺序有 效。
精品医学
20
大多数常用的E.coli受体都含这三个限 制系统
三个都不限制Dam, EcoKI , EcoRI修饰的位点
McrA限制HpaII(CCGG)甲基化修饰的位点
精品医学
21
四、甲基化对限制性内切酶酶切的影响
1. 修饰酶切位点
① HincII GTCGAC GTCAAC GTTGAC GTTAAC
• 用AluI(AG↓CT)和HaeIII(GG↓CC)部
分消化基因组DNA • 用M.EcoRI甲基化酶处理， • 然后加上合成的EcoRI接头 • 当再用EcoRI来切割时只有接头上的
位点可被切割
精品医学
24
2. 产生新酶切位点
TCGATCGA AGCTAGCT TaqI TaqI M.TaqI TCGA*TCGA* *AGCT*AGCT
12
受影响酶有： Acc65I GGTACC AlwNI ApaI GGGCCC EcoRII EaeI 等
不受影响酶有： KpnI GGTACC BanII Bg1I BstNI NarI GGCGCC 等
精品医学
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3. EcoKI甲基化酶
识别AAC(N)6GTGC TTG(N)6CACG A N6位置
精品医学
M.TaqI甲基化 TCGA中的A， 所以M.TaqI处理 DNA后， GTCGAC将不 受HincII切割
22
② BamHI GGATCC
M.MspI m5CCGG 如果BamHI前面为CC或后面为GG， 那么M.MspI处理的DNA抵抗BamHI的 切割
精.Dcm甲基化酶
1. DNA cytsine methylase
识别CCAGG或CCTGG序列 在第二个C上C5位置上引入甲基
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EcoRII / BstNI CCA(T)GG 二者识别序列相同，但切点不同 EcoRII受dcm甲基化作用影响
BstNI可避免这一影响
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精品医学
5
二、甲基化酶的种类
在真核和原核生物中存在大量的 甲基化酶，
在E.coli中大多数都有三个位 点特异性的DNA甲基化酶
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6
1.Dam甲基化酶
DNA Adenine methylase
GATC 腺嘌呤N6位置 引入甲基
精品医学
7
PvuII BamHI BclI BglII XhoII
DpnI
精品医学
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3. 用于研究细胞DNA中位点特异性甲基 化的水平及分布 哺乳动物m5CG、植物的m5CG，m5CNG 肠道细胞的Gm6ATC C m5/4 CGG MspI可切割，HpaII不可切割 Gm6ATC Sau3AI 可切割，MobI不可切割
其它
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4. 对基因组作图的影响
但识别位点少(1/8kb) 研究较少 而dam（1/256bp） dcm(1/512bp)
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4. SssI甲基化酶
来自原核生物Spiroplasma
CG序列中的C在C5位置上甲基化
可在未甲基化或半甲基化链上起作用
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15பைடு நூலகம்
许多酶对此甲基化敏感 AatII ClaI XhoI SalI等
第二节 甲基化酶 Methylase
methyltransferase
Methylation
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原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员， 用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。
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一、DNA甲基化酶
甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺 序。甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基 化，保护DNA不被限制性内切酶切开。
MboI Sau3AI 识别位点中含GATC序列
ClaI(1/4) XbaI (1/16) TaqI (1/16)
MboII (1/16) HphI(1/16) 部分识别序列含GATC序列 4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列
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有些限制酶对Dam甲基化敏感 不能切割相应的序列
不敏感的有BamHI EcoRI SphI KpnI
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SssI甲基化的DNA 受E.coli
McrA, McrBC, Mrr 系统的限制
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5. 其它甲基化酶
DNMT1 1988年克隆出的真核生物的甲基转移酶. 具有催化作用的c端和调节功能的N端.
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三、依赖于甲基化的限制系统
例如限制性内切酶AvaⅠ的识别顺序是： 5’……CPyCGPuG……3’ 3’……GPuGCPyC……5’
Py可以是任何一种嘧啶，pu可以是任何一种嘌呤。因此 可以有4种识别顺序。如果同时使用甲基化酶TaqⅠ和甲 基化酶HpaⅡ，则AvaⅠ的识别顺序将只是 5’……CCCGAG……3’。
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如果有一个DNA片段，有AvaⅠ的3个识别顺序，当用 AvaⅠ处理后可得4个片段。可是，如果先用TaqⅠ甲 基化酶和HpaⅡ甲基化酶使DNA顺序中的有些碱基甲 基化，然后再用AvaⅠ去切，结果只有1个识别顺序可 被AvaⅠ作用，只产生2个DNA片段。