嗜水气单胞菌孔蛋白OmpF重组表达及其免疫原性分析

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创伤弧菌OmpU与嗜水气单胞菌OmpⅡ外膜蛋白二联表达及其初步免疫原性

创伤弧菌OmpU与嗜水气单胞菌OmpⅡ外膜蛋白二联表达及其初步免疫原性郭松林;陆盼盼;冯建军;林鹏【摘要】从发病的养殖鳗鲡中分离出创伤弧菌(Vibrio vulnificus)和嗜水气单胞菌(Aeromona shydrophila),提取其基因组DNA,再通过PCR法克隆创伤弧菌外膜蛋白OmpU和嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpⅡ的基因全长.采用融合PCR法体外连接这2个基因表达膜外片段的序列并成功构建了二联表达载体(pGEX-2T-Vibr-Aero-his).在大肠杆菌(BL21)的吸光度A600为0.6~1.0时,采用1.0 mmol/L IPTG诱导剂,16℃过夜诱导表达.表达产物经离心柱亲和层析纯化后获得分子量为82.2 ku的外膜蛋白.蛋白经透析复性后免疫于鳗鲡以测定其血清抗体效价.结果表明,重组蛋白注射组的鳗鲡血清抗体效价在免疫后第14天和第21天显著(P<0.05)高于PBS对照组,第28天和第42天达到极显著(P<0.01)水平.【期刊名称】《集美大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(022)003【总页数】7页(P1-7)【关键词】创伤弧菌;迟缓爱德华氏菌;OmpU;OmpⅡ;表达产物;免疫原性【作者】郭松林;陆盼盼;冯建军;林鹏【作者单位】集美大学水产学院, 福建厦门361021;鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心, 福建厦门361021;集美大学水产学院, 福建厦门361021;鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心, 福建厦门361021;集美大学水产学院, 福建厦门361021;鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心, 福建厦门361021;集美大学水产学院, 福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】S917养殖鳗鲡时常发生由细菌性病原引起的病害，使鳗鲡养殖户蒙受巨大经济损失。

嗜水气单胞菌(Aeromona shydrophila)和创伤弧菌(Vibrio vnlnificus)是引起养殖鳗鲡发病的2种主要病原菌，人工养殖的日本、欧洲和美洲鳗鲡均可因其引发肝脏溃疡、肾肿大、败血症、烂尾或烂鳃等传染性疾病[1-2]。

嗜水气单胞菌3种疫苗免疫的青鱼外周血免疫指标的变化

病的发生Ｌ］４。研究表明革兰氏阴性菌的外膜蛋白道出血病的青鱼肝脏。将菌株ＢＢ１在Ｂ培养Ｃ０ＨＩ
（ＯＭＰ和脂多糖（Ｐ）具有良好的免疫原性［。基３）ＬＳ均６］２℃条件下培养２４ｈ后，心法集菌并以ＰＳ离Ｂ
题不断发生［，２严重制约了青鱼养殖业的健康发展。旨在为全菌灭活疫苗以及菌体成分疫苗在鱼病防治］
目前国内对鱼类细菌性疾病的控制主要以抗生素等中的应用提供理论依据。
化学药物为主，细菌对抗生素易产生抗药性ｌ，但＿而３］
且使用抗生素会产生残留等不良后果种已经被证实是预防鱼类疾病最有效的１１供试菌株及其培养．
途径，包括全菌灭活疫苗，菌体成分亚单位疫苗等，用于本研究的嗜水气单胞菌（号为ＢＢ１编Ｃ０）它们均能在不同程度上提高鱼类的抗病性，少疾分离自湖北省荆州市某青鱼养殖示范区域患典型肠减
均明显优于ＦＡＨ组（０）＿５。可见３免疫原均能通过促进青鱼血细胞增殖、高吞噬细胞的吞噬活性、种提产生特异性抗体等方式增强机体的免疫保护力。
关键词
青鱼；嗜水气单胞菌；外膜蛋白；脂多糖；凝集抗体效价；吞噬活性
ｓ９３４文献标识码Ａ文章编号１０ —４１２１）１００ —６００２２（０２０ —１００

鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白ompF基因的分子克隆、生物信息学与免疫原性分析

鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白ompF基因的分子克隆、生物信息学与免疫原性分析王二龙;秦振阳;汪开毓;陈德芳;王均;贺扬【摘要】为筛选潜在的保护性抗原基因研制鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)基因工程疫苗,实验利用特异性引物扩增分离自斑点叉尾(鲴)(Ictalurus punctatus)的Y.ruckeri外膜蛋白ompF基因并对其进行分子克隆,应用相关软件和程序对其核苷酸及氨基酸序列进行生物信息学分析,并进行了ompF蛋白的表达和免疫原性检测.结果显示,ompF基因全长1 095 bp(GenBank登录号KP159420),包含一个编码364个氨基酸的完整开放阅读框,其氨基酸序列具有极高保守性,与Y.ruckeri外膜穿孔蛋白ompF(GenBank登录号ADK27779.1)亲缘关系最近,序列一致性为99.2％,进化树聚为一支;具有1个革兰氏阴性菌穿孔蛋白保守结构域,存在1个信号肽和1个跨膜区,是一种跨膜蛋白;具有12个与免疫相关的抗原决定簇区域.SDS-PAGE分析发现该蛋白主要以包涵体形式表达在沉淀,经Western-bolt显示ompF 蛋白具有较好的免疫原性.以上结果表明ompF基因可作为Y.ruckeri基因工程疫苗的候选抗原基因.【期刊名称】《南方水产科学》【年(卷),期】2016(012)003【总页数】11页(P24-34)【关键词】鲁氏耶尔森氏菌;外膜蛋白;ompF基因;分子克隆;生物信息学;免疫原性【作者】王二龙;秦振阳;汪开毓;陈德芳;王均;贺扬【作者单位】四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学,动物疫病与人类健康四川省重点实验室,四川成都611130;四川农业大学动物科技学院,四川成都611130;四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学动物医学院,四川成都611130【正文语种】中文【中图分类】S941.42鲁氏耶尔森氏菌(Yersiniaruckeri)，隶属肠杆菌科、耶尔森氏菌属，呈革兰氏阴性短杆状，是冷水性鲑科鱼类红嘴病(Enteric redmouth disease，ERM)的主要病原菌[1]。

嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因的原核表达及免疫保护性研究

嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因的原核表达及免疫保护性研究郑宗林;郑曙明;DelbertM.GatlinIII;汪开毓【摘要】The expression of outer membrane protein A (OmpA) from Aeromonas hydrophila (PDK06) in Escherichia coli, the antigenicity and immunoprotection in Ictalurus punctatus were analyzed. According to ompA gene sequence published in GenBank (AF146597), no signal peptide primers were designed and the DNA fragment of about 1 000 bp was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) from genomic DNA of A. hydrophila PDK06, isolated from disease I. punctatus. The se-quence was sub-cloned into pET-32a ( +) and the recombinant plasmid was named pET-32a ( +) -pompA which was further transferred into host bacteria E. coli BL21 (DE3) with IPTG induction for expression. The immune effect of the pompA with adjuvants ( FIA) against I. punctatus infected A. hydrophila were detected. The results showed the no signal peptide ompA gene of A. hydrophila was 960 bp in length, encoding a protein comprising 319 amino acids, of which the putative relative molecular mass was 53. 67 kDa. The FIA can improve the serum lysozyme activity, ACH50 activity and head kidney macrophage respiratory burst activity. The antibody level of the vaccinated fish without FIA were the highest at 4 weeks p. v. , while the antibody level of the vaccinated fish with FIA peaked at 5 weeks p. v. , which indicated FIA can significantly improve serum antibody levels of I. punctatus. The cumulative mortalities of the vaccinated fish were 93.33%(PBS), 93. 33% (FIA), 50. 00% (pompA), and 13. 33% (FIA +pompA), respectively, which correspond to an RPS of 46. 43% and 85. 71% for pompA and FIA + pompA, respectively. The result of serum bactericidal activity sugges-ted that the survival rates of A. hydrophila of the vaccinated fish were significantly lower than the survival rate of the control, and the bacterial survival rate of the FIA+pompA vaccinated fish was the lowest. These indicated that pompA can be a sub-unit vaccine candidate vaccine, and FIA was a suitable adjuvant to enhanced the performance of pompA.%为评价嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila, Ah)PDK06株外膜蛋白A(ompA)的原核表达产物是否具有抗原性及其对斑点叉尾 ( Ictalurus punctatus)的免疫保护力, 根据GenBank上嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因序列(GenBank登录号: AF146597)设计去信号肽引物, 扩增获得一段约1 000 bp的序列, 经鉴定正确后, 构建重组表达质粒pET-32a( +) -pompA; 然后将该质粒转入BL21 (DE3)后用IPTG诱导表达, 经纯化后得到pompA重组蛋白; 最后将pompAompA蛋白与弗氏不完全佐剂( FIA)混合免疫斑点叉尾 , 评价其免疫效果. 结果显示:克隆的嗜水气单胞菌pompA基因全长为960 bp, 编码319个氨基酸, 融合表达的重组蛋白相对分子质量约为53, 670 kDa;FIA能够提高斑点叉尾的溶菌酶活性、 ACH50活性、头肾巨噬细胞呼吸暴发活性; pompA组抗体水平在第4周达到峰值, FIA免疫组抗体水平在第5周达到峰值, 且FIA能够显著提高斑点叉尾的抗体水平; 攻毒后各组累计死亡率分别为93. 33%( PBS)、 93. 33%( FIA)、50. 00%( pompA)和13. 33%( FIA+pompA) , pompA和FIA+pompA组相对保护率分别为46. 43%和85. 71%; 免疫组靶器官中的细菌数量显著低于对照组, 且FIA+pompA细菌含量最低. 说明pompA可以作为一个亚单位疫苗候选疫苗, 而FIA佐剂能较好的增强亚单位疫苗的免疫效果.【期刊名称】《淡水渔业》【年(卷),期】2015(045)005【总页数】9页(P3-10,28)【关键词】嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila);ompA;亚单位疫苗;斑点叉尾(Ictaluruspunctatus);免疫效果【作者】郑宗林;郑曙明;DelbertM.GatlinIII;汪开毓【作者单位】水产动物繁育和健康养殖研究中心, 西南大学荣昌校区, 重庆荣昌402460;Department of Wildlife and Fisheries Sciences and Faculty of Nutrition, Texas A&M University System, College Station, Texas 77840-2258, USA;四川农业大学动物医学院, 成都 625014;水产动物繁育和健康养殖研究中心, 西南大学荣昌校区, 重庆荣昌 402460;Department of Wildlife and Fisheries Sciences and Faculty of Nutrition, Texas A&M University System, College Station, Texas 77840-2258, USA;四川农业大学动物医学院, 成都625014【正文语种】中文【中图分类】S917.4嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)广泛存在于自然界的淡水、污水和土壤中，通过污染的水和相关产品感染人类。

嗜水气单胞菌胞外蛋白酶ECPase54的纯化及特性分析

南京农业大学学报　1996,19(3):88～94 J ournal of N anj ing A gricultur al Univer sity嗜水气单胞菌胞外蛋白酶ECPase54的纯化及特性分析李焕荣　陈怀青　陆承平**(南京农业大学动物医学院,南京210095)摘要　嗜水气单胞菌(A h)J-1株的液体培养物上清在56℃或与乙二胺四乙酸(EDT A)或丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PM SF)作用,其胞外蛋白酶(ECP ase)的活力有不同程度的下降。

将酪蛋白掺入丙烯酰胺聚合后,加A h J-1上清作SD S-PA G E,37℃原位消化,染色,显示上清中存在至少5种分子量不同的蛋白酶。

A h J-1株的培养上清经硫酸铵沉淀、D EAE-纤维素离子交换层析和Sephadex G-200分子筛层析,获得一种纯化的蛋白酶。

不经2-巯基乙醇处理后,分子量约为54000,而经2-巯基乙醇处理的样品,分子量为35000,且酶活性丧失。

该酶对热稳定,EDT A可抑制其活性,PM SF对其无影响。

此酶属于热稳定金属蛋白酶(T SM P),建议命名为ECPase54。

它的最适pH为7.5,米氏常数(K m)为1.77m g/ml,对Ver o细胞有毒性,腹腔注射能致死小白鼠。

关键词　嗜水气单胞菌;胞外蛋白酶;纯化;特性分析中图分类号　S852.61PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF EXTRACELLULAR PROTEASEECPASE54FROM AEROMONAS HYDROPHILALi Huanrong,Chen Huaiqing and Lu Cheng ping(Colleg e of Veter inary M edicine,Nanjing Agric Univ,Nanjing210095) ABSTRACT　A t lea st fiv e ex tr acellular pr oteases(ECPase)in A eromonas h y d rop hila str ain J-1culture su-per natant w er e assa yed by in situ pr oteo ly tic act ivity on SDS-PA G E containing0.1%casein.O ne of the ECPases fr om the supernatant w as pur ified by ammonium sulfate precipit atio n,a nion-ex chang e chr o-mato gr aphy on DEA E-cellulo se and Sephadex G-200g el filt ration chr o matog ra phy.SDS-P A GE of the pu-rified pr otease indicated that2-M E reduced sample migr ated at35000,w hile non-reduced sample migr ated at54000.T his pr ot ease was accor dingly desig nat ed ECPase54.T he activit y o f ECP ase54w as inhibited by EDT A,but not by P M SF o r by heating at56℃fo r30min.It sho w ed that the ECPase54w as a ther-mostable metallo pr o tease(T SM P).T he ECPase54w ith optimum pH7.5and K m1.45mg/ml po ssessed pro tyo ly tic and cy tot ox ic activ ities.It also elicit ed lethal t ox icit y to mice.Key words　A er omonas hy dr op hila;ex tr acellular pro tease;purificatio n;character ization 嗜水气单胞菌可引致人和多种动物发病,在公共卫生上占有一定地位。

嗜水气单胞菌毒力因子研究进展_李绍戊

文章编号：１００５－３８３２（２０１３）０５－００６１－０４嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila ，ＡＨ）隶属于弧菌科（Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）气单胞菌属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ），是一种广泛分布于自然界中的革兰氏阴性菌［１］。

作为一种普遍存在于淡水、污水及土壤中的条件致病菌，嗜水气单胞菌可感染多种水生动物和其他动物［２］，临床主要特征为急性出血性败血症［３，４］。

致病性嗜水气单胞菌是我国淡水养殖鱼类爆发性传染病的主要病原之一［５］，给养殖业带来了巨大经济损失，严重制约了行业的健康可持续发展。

目前，国内外学者对嗜水气单胞菌各方面特性进行了系统研究，并取得了一定进展，发现该菌有多种毒力因子，主要包括外毒素（ｅｘｏｔｏｘｉｎ）、胞外蛋白酶（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒｐｒｏｔｅａｓｅ）、结构蛋白和信号相关蛋白等［６］。

本文将上述各因素按照与毒力相关的分泌物质（毒力相关因子和辅助因子）和致病相关的表面分子（结构分子）两类进行简要的综述。

１毒力相关的分泌物质致病性嗜水气单胞菌毒力相关的分泌物质主要有外毒素和胞外蛋白酶两种。

外毒素又包括溶血素（ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）、气溶素（ａｅｒｏｌｙｓｉｎ）和肠毒素（ｃｙｔｏｌｙｔｉ－ｃｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）等几种物质。

1.1溶血素水产动物感染嗜水气单胞菌在临床上表现出败血症状［７］，在感染动物体内、外均可检测到溶血活性，因此，溶血素是嗜水气单胞菌的主要毒力因子之一［８］。

龚晖等研究表明，在单因子条件下嗜水气单胞菌溶血素与其胞外产物（ＥＣＰｓ）的溶血特性存在嗜水气单胞菌毒力因子研究进展李绍戊，卢彤岩（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江哈尔滨１５００７０）摘要：嗜水气单胞菌是一种广泛分布于自然界中的革兰氏阴性菌，是一种人－兽－鱼共患病的条件致病菌。

其危害的产生与其外毒素、胞外蛋白酶及表面分子等毒力因子的分泌、表达相关。

研究其毒力因子有利于深入了解该菌的致病机理，探索有效的防治方法。

单壁碳纳米管载嗜水气单胞菌外膜蛋白亚单位疫苗的评价

单壁碳纳米管载嗜水气单胞菌外膜蛋白亚单位疫苗的评价当前,中国水产养殖业规模已经达到世界水产养殖业的70%,且比重呈现逐年递增的趋势。

与此同时,病原菌的传播与侵染给水产养殖业造成的损失也越来越严重。

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophilia）作为一种常见的条件致病菌能够使鱼类患败血症,引发出血性败血症、眼眶蜂窝织炎和眼球破裂等症状,最终导致鱼类死亡。

此外,它还是人-畜-鱼共患致病菌,严重时甚至可能危害到人类的生命健康。

疫苗免疫被认为是抑制嗜水气单胞菌感染最有效的途径之一,但是疫苗存在佐剂、运送、免疫方式等问题,使其规模化生产与使用受到限制。

因此,当前迫切需要筛选有效的免疫保护性候选蛋白以及一种良好的疫苗递送佐剂以控制该疾病的传播。

课题组前期研究发现,在缺铁环境下高表达的嗜水气单胞菌外膜蛋白能够显著增强斑马鱼的免疫能力,提示铁离子相关外膜蛋白可能作为细菌的疫苗候选蛋白,但是这些候选蛋白的免疫效果可能因为佐剂以及免疫宿主方式等问题受到限制。

因此寻找一种更持续、稳定和高效的佐剂是当前此类渔用疫苗开发研究的热点问题。

近年来,纳米材料中的单壁碳纳米管（Single-walled carbon nanotube,SWCNTs）通过功能化修饰后可以与蛋白共价结合,而且具有的细胞穿透性好、低毒或无毒等优点,在生物医学领域得到较好的发展,并在水产养殖疫苗中得到初步的应用。

通过佐剂的添加提高药物在受体内的药效与作用时间,同时利用纳米材料的穿透细胞膜效应,制备针对水产生物的高效简便疫苗是当前疫苗开发的新思路。

为了筛选嗜水气单胞菌高效疫苗亚单位候选蛋白并研究碳纳米管结合免疫候选蛋白对斑马鱼的免疫保护效果,本论文根据课题组前期的研究结果,挑选了7个嗜水气单胞菌外膜蛋白（6个铁离子相关差异蛋白P55870、A0KGK5、A0KIY3、A0KPP0、A0KLQ6、A0KH89以及1个文献报道已明确免疫效果的外膜蛋白A0KHR9（OmpAII）为对照）,通过原核重组获得高表达和纯化蛋白,借助化学合成技术构建碳纳米管载外膜蛋白系统,结合细菌攻毒以及宿主免疫因子检测等试验,比较外膜蛋白与碳纳米管载外膜蛋白,分别在腹腔注射与浸泡免疫模式对斑马鱼的免疫保护效果。

嗜水气单胞菌外膜蛋白原核表达及其免疫保护性研究

第35卷第6期陕西科技大学学报 V o l.35N o.6 2017年12月 J o u r n a l o f S h a a n x iU n i v e r s i t y o f S c i e n c e&T e c h n o l o g y D e c.2017* 文章编号:2096-398X(2017)06-0125-06嗜水气单胞菌外膜蛋白原核表达及其免疫保护性研究刘望,杨佳杰,杨静,薛茜,张苗,刘欢*(陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021)摘要:嗜水气单胞菌是我国水产养殖鱼类重要病原菌,抗生素防治易产生耐药性等问题,亟需开发新型防治手段.外膜蛋白O m p A和O m p T S是嗜水气单胞菌主要的免疫原蛋白,为了得到免疫效果更佳的亚单位疫苗,利用大肠杆菌将O m p A和O m p T S进行融合表达,并对表达产物进行纯化,检测其对斑马鱼的免疫保护效果.结果表明:成功扩增获得大小分别为1032b p和1068b p的O m p A和O m p T S基因序列,随后进行O v e r l a p P C R,得到大小为2100b p的融合片段O m p A-O m p T S.成功构建重组表达质粒p E T28a-O m p A-O m p T S,将其转入B L21(D E3),重组蛋白的表达条件为:菌体培养2h后添加I P T G1mM,16℃下培养16h.经纯化后得到重组蛋白O m p A-O m p T S;最后将O m p A-O m p T S蛋白与弗氏不完全佐剂(F I A)混合免疫斑马鱼,免疫保护率可达82.1%,表明该融合蛋白可作为候选亚单位疫苗进行进一步的开发.关键词:嗜水气单胞菌;外膜蛋白;原核表达;免疫保护性中图分类号:S917.1 文献标志码:AT h e p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o na n d i m m u n o p r o t e c t i o na n a l y s i so f o u t e rm e m b r a n e p r o t e i n s o f A e r o m o n a s h y d r o p h i l aL I U W a n g,Y A N GJ i a-j i e,Y A N GJ i n g,X U E Q i a n,Z H A N G M i a o,L I U H u a n* (S c h o o l o fF o o d a n dB i o l o g i c a l E n g i n e e r i n g,S h a a n x iU n i v e r s i t y o f S c i e n c e&T e c h n o l o g y,X i'a n710021,C h i-n a)A b s t r a c t:A e r o m o n a s h y d r o p h i l a i s o n e o f t h e i m p o r t a n t f i s h p a t h o g e n i nC h i n a,a n d a n t i b i o t-i c s t r e a t m e n t f o r t h i s d i s e a s e c a n c a u s e t h e d r u g-r e s i s t a n c e.T h e r e f o r e,i t's a nu r g e n t n e e d f o rd e v e l o p i n g n e w p r e v e n t i o nm e t h o d sn o w.I no r d e r t oo b t a i nt h es u b u n i tv a c c i n ew i t hb e t t e r i mm u n o p r o t e c t i v e e f f e c t,t h e t w oo u t e rm e m b r a n e p r o t e i n s,O m p Aa n dO m p T Sw e r e f u s i o ne x p r e s s e d i n E s c h e r c h i a c o l i a n dt h e p r o d u c t sw e r e p u r if i e da n d i t s p r o t e c t i v ee f f i c i e n c y o nt h e z e b r a f i s h a g a i n s t A e r o m o n a s h y d r o p h i l a w e r e t e s t e d.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e o m p A*收稿日期:2017-08-10基金项目:国家自然科学基金项目(31301059);陕西省科技厅自然科学基础研究计划面上项目(2017J M3010);陕西省科技厅自然科学基础研究计划青年项目(2013J Q3011);陕西省大学生创新创业训练计划项目(1326);陕西科技大学博士科研启动基金项目(B J12-24)作者简介:刘望(1991-),男,陕西西安人,在读硕士研究生,研究方向:食源性病原微生物通讯作者:刘欢(1983-),女,陕西西安人,讲师,博士,研究方向:食源性病原微生物,l i u h u a n@s u s t.e d u.c n陕西科技大学学报第35卷(1032b p)a n do m p T S(1068b p)g e n e sw e r e s u c c e s s f u l l y c l o n e da n d t h e f u s i o n f r a g m e n t, O m p A-O m p T S(2100b p),w a s o b t a i n e db y o v e r l a p P C R.T h e n t h e r e c o m b i n a n t e x p r e s s i o np l a s m i d,p E T28a-O m p A-O m p T S,w a s c o n s t r u c t e d a n d i n t r o d u c e d i n t o t h e h o s t s t r a i n,e s c h e-r i c h i a c o l i B L21(D E3).T h e c o n d i t i o n s f o r f u s i o n p r o t e i n e x p r e s s i o nw e r e t h a tw i t h t h e a d d i-t i o no f1mMI P T Ga f t e r2h o f t h e s t r a i n g r o w t h a t16℃f o r16h.T h e r e c o m b i n a n t p r o t e i n, O m p A-O m p T Sw a s p u r i f i e d a n dm i x e dw i t h t h ea d j u v a n t(F I A)t ob e i n j e c t e d t o t h e z e b r af i s ht ot e s ti t s p r o t e c t i o ne f f e c tag a i n s t A e r o m o n a sh y d r o p hi l a.T h ei mm u n o p r o t e c t i v i t yr e a c h e d87.5%,i n d i c a t i n g t h a t t h i s f u s i o n p r o t e i nc a nb e a c a n d i d a t ev a c c i n e f o r f u r t h e rd e-v e l o p m e n t.K e y w o r d s:A e r o m o n a s h y d r o p h i l a;o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n;p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n;i m-m u n o p r o t e c t i o n0 引言嗜水气单胞菌(A e r o m o n a s h y d r o p h i l a)是一种条件致病菌,主要存在于海水㊁淡水㊁河流㊁湖泊等水环境以及污泥㊁土壤㊁人类粪便中,是我国水产养殖鱼类爆发性传染病的主要病原[1],可以感染草鱼㊁鲤鱼㊁鲫鱼以及罗非鱼等多种水产养殖鱼类,此外,嗜水气单胞菌还可以感染人和动物等[2],能引发人类的中耳炎㊁败血症及创伤面感染㊁腹膜炎以及急性肠胃炎等疾病[3,4].近年来,世界各地均陆续报道从食品㊁医疗用品以及急性胃肠炎患者粪便中检测出嗜水气单胞菌[5,6],在国外,嗜水气单胞菌已经被列入食品卫生检验的对象和医院腹痛腹泻病原菌检测的一项内容.因此,嗜水气单胞菌相关疾病的爆发不仅给水产养殖业造成巨大损失,还直接对人类健康造成了威胁,受到水产㊁兽医学界的重视[7].目前,防治该病的主要方法仍是使用抗生素,但是随着抗生素的反复使用,细菌产生耐药性,抗菌治疗的效果不明显,导致患病鱼的平均死亡率达40%~50%,给水产养殖业造成了严重的经济损失.因此,寻找免疫保护性抗原是预防该病暴发的重要手段.国内外学者已对嗜水气单胞菌进行了系统研究,发现嗜水气单胞菌可产生多种毒力因子,得到认可的毒力因子包括外毒素㊁胞外蛋白酶㊁脂多糖㊁外膜蛋白等.外膜蛋白(O u t e r m e m b r a n e p r o-t e i n s,O m p s)是存在于细菌外膜中所有蛋白的总称,在维持外膜结构㊁保证物质运输等方面有着重要作用[8].同时,由于其位于细胞的最外面而在细菌适应环境变化及致病性过程中亦扮演着重要角色.当细菌进入一个新的环境时,其外膜蛋白的合成会跟着变化[9].有许多研究结果表明,细菌的主要外膜蛋白的免疫原性很强,是重要的保护性抗原,利用致病菌的OM P做免疫原还可使鱼产生对不同血清型菌株感染的交叉保护力[10-12].本研究选取嗜水气单胞菌外膜蛋白o m p A基因和o m p T S基因在大肠杆菌中进行融合共表达,分离和纯化,并与弗氏不完全佐剂(F r e u d's i n-c o m p l e t e a d j u v a n t,F I A)结合,考察其对斑马鱼的免疫保护效果,旨在为研制嗜水气单胞菌基因工程奠定基础.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与质粒大肠杆菌D H5α㊁B L21(D E3)㊁嗜水气单胞菌L S01㊁表达质粒p E T28a均由本实验时保存. p M D19T购自T a K a R a公司.1.1.2 主要试剂和仪器(1)主要试剂:L B培养基,购自上海生工生物工程有限公司;T a q D N A聚合酶㊁P f u高保真聚合酶㊁蛋白质分子标准量M a r k e r㊁D N A分子标准量M a r k e r㊁D N A回收试剂盒及质粒抽提试剂盒,购自北京天根生化科技有限公司;T4D N A连接酶及限制性内切酶,购自T a K a R a公司.(2)主要仪器:恒温培养箱,L R H-250,上海一恒科学仪器有限公司;摇床,T H Z-C-1,太仓市仪器设备厂;P C R仪,M y C y c l e r t h e r m a l c y c l e r;核酸电泳仪,p o w e rP a c T MH C,伯乐生命医学产品有限公司;凝胶成像系统,F R980,上海复日科技有限公司.1.1.3 引物表1为本研究中使用的引物,参照G e n B a n k 上公布的基因序列设计,由上海捷瑞生物工程有限㊃621㊃第6期刘望等:嗜水气单胞菌外膜蛋白原核表达及其免疫保护性研究公司合成.下划线为限制性内切酶识别位点.表1 实验中所使用的引物引物名称序列(5'-3')A F C CG T C G A C A T G A A A A T G G C T C C T T C C C T GA R T C T T T T T C A T T T A C T T C T G A A C T T C T T G T A C GT S F T T C A G A A G T A A A T G A A A A A G A C A A T T C T G G CT S R G GC T C G A G T T A G A A G T T G T A T T G C A G G G C A A C 1.2 方法1.2.1 o m p A和o m p T S基因的克隆及o m p A-o m p T S融合基因的构建将-80℃保存的嗜水气单胞菌接种于L B液体培养基,30℃恒温培养24h,取1m L培养菌液按照天根细菌D N A提取试剂盒提取基因组D N A,以其为模板,分别利用引物对A F/A R和T S F/T S R进行基因扩增,分别克隆获得o m p A和o m p T S基因.P C R反应体系为50μL:2×T a q M a s t e rM i x25μL,D N A模板3μL,上下游引物各3μL,补加d dH2O至50μL.反应条件:94℃预变性4m i n,94℃50s,55℃30s,72℃1m i n,共30个循环,最后72℃延伸7m i n.反应产物以1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统检测扩增结果.随后以回收到的o m p A和o m p T S基因序列为模板,以引物对A F/T S R进行O v e r l a p P C R,反应条件除延伸时间增加至2m i n钟外,其他条件同上.产物检验后割胶回收并用试剂盒纯化,最后以物质的量之比3∶1(插入片段/载体)的比例克隆入p M D19-T载体,转化大肠杆菌D H5α,在含氨苄青霉素(100μg/m L)的L B平板上挑取含有重组质粒p M D19T-o m p A-o m p T S的阳性克隆,利用T载体通用引物M13进行菌落P C R鉴定后进行基因测序.1.2.2 重组表达质粒p E T28a-o m p A-o m p T S的构建分别对重组质粒p M D19T-o m p A-o m p T S和表达质粒p E T28a进行质粒提取,并根据引物中设计的酶切位点,分别利用S a l I和X h o I对所抽提的质粒进行双酶切消化,琼脂糖凝胶电泳分析并将酶切后的融合基因o m p A-o m p T S与表达质粒p E T28a进行连接,转化大肠杆菌B L21(D E3),在含卡那霉素(100μg/m L)的L B平板上挑取含有重组质粒p E T28a-o m p A-o m p T S的阳性克隆,利用p E T系列载体T7通用引物进行菌落P C R鉴定后进行基因测序.1.2.3 重组表达载体p E T28a-o m p A-o m p T S在大肠杆菌中的表达和纯化将构建好的含有重组表达质粒p E T28a-o m-p A-o m p T S的大肠杆菌B L21置于添加卡那霉素的L B培养基中过夜活化培养.次日按照体积比1∶100加入到1m L同样的培养液中,37℃振荡培养.当菌种O D600达到0.6~0.8时,加入I P T G,不同温度下进行诱导表达,随后收集菌体进行S D S-P A G E分析.将诱导表达后以包涵体形式存在的融合蛋白进行超声破碎,沉淀用含2m o l/L尿素的包涵体洗涤液洗涤,洗涤后离心倒去上清,重复3次;再用含6m o l/L盐酸胍缓冲液溶解重组蛋白,将溶解后的溶液用0.45μm孔径的滤膜过滤,过滤后的溶液经N i柱亲和纯化,纯化的蛋白于4℃进行梯度尿素复性透析至P B S,复性产物经S D S-P A G E进行检测.1.2.4 重组融合蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化将纯化后的O m p A-O m p T S融合蛋白用P B S 重悬,将其浓度调整至2m g/m L,然后与弗氏不完全佐剂F I A按照1∶1的比例混合,在10m L无菌注射器中进行乳化.乳化时先用移液器乳化5 m i n,然后用注射器反复推进,直至水相与油相完全融到一起,形成油包水的乳白色液滴.取一滴滴入水中,如果液滴不扩散则说明乳化完全,若扩散则需继续乳化.将乳化好的样品放4℃冰箱保存备用.1.2.5 免疫将健康斑马鱼随机分成4组,其中2个组为免疫组(O m p A-O m p T S+F I A㊁O m p A-O m p T S),2个组为对照组(F I A㊁P B S),每组20条,平行设置3组.亚单位疫苗O m p A-O m p T S免疫剂量为2μg/ g鱼,与佐剂按照1∶1进行混合,每尾鱼背部肌肉注射配比好的佐剂疫苗,对照组注射等量的F I A 或P B S.2周后免疫组用等量的亚单位疫苗加强免疫一次(不包含佐剂).1.2.6 攻毒试验将嗜水气单胞菌L S01菌株接种于新鲜培养基中,于30℃过夜培养.以7.5×107C F U/m L为攻毒浓度,每尾背部肌肉注射0.2m L,攻毒后连续观察7d,记录死亡情况.以相对保护率表示免疫效果:相对保护率(R P S)=[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%.2 结果与讨论2.1 o m p A和o m p T S基因的克隆与鉴定以嗜水气单胞菌L S01基因组D N A为模板,用设计的引物对A F/A R和T S F/T S R分别进行P C R扩增,通过凝胶电泳分析发现,成功获得大小㊃721㊃陕西科技大学学报第35卷分别为1032b p和1068b p的o m p A和o m p T S 基因片段(如图1所示).P C R产物纯化后构建T-A克隆进行测序,在N C B I上进行序列比对分析,确定二者分别为嗜水气单胞菌O m p A和O m p T S 蛋白编码基因的开放阅读框编码序列区,其编码的蛋白质分别包含345个和356个氨基酸残基.图1 o m p A和o m p T S基因克隆P C R电泳图2.2 序列同源性分析在对O m p A和O m p T S蛋白编码基因进行测序后,将两个基因编码的氨基酸序列分别与N C B I 数据库中已登录的嗜水气单胞菌及其他气单胞菌属氨基酸序列进行比对分析:结果发现嗜水气单胞菌L S01的O m p A基因和O m p T S基因编码的蛋白与嗜水气单胞菌A T C C7966外膜蛋白O m p A 和O m p T S的同源性为99%,表明嗜水气单胞菌O m p A和O m p T S高度保守.同时,O m p T S与其他气单胞菌属(温和气单胞菌,豚鼠气单胞菌)中的O m p T S亦具有较高的保守性,同源度均达到82%以上.而O m p A与其它气单胞菌属中的O m p T S 氨基酸组成的同源性亦可达到65%以上(如图2㊁图3所示).可见,O m p A和O m p T S不止在嗜水气单胞菌中具有较高的保守性,且在气单胞菌属中亦具有较高的保守性,因此,以这两种蛋白构建的亚单位疫苗可能对多种气单胞菌属的病原菌实现多效价的免疫保护作用.图2 O m p A氨基酸序列同源性比对分析图3 O m p T S氨基酸序列同源性比对分析2.3 融合基因o m p A-o m p T S的克隆在成功克隆得到了嗜水气单胞菌L S01中外膜蛋白O m p A和O m p T S编码基因后,进一步地,通过O v e r l a p P C R将O m p A和O m p T S编码基因进行融合连接.结果显示,以O m p A和O m p T S编码基因为模板,利用引物对A F/T S R成功扩增得到大小为2100b p的特异性D N A片段(如图4所示),对产物进行回收和测序后证实其为融合基因o m p A-o m p T S .图4 o m p A-o m p T S融合基因O v e r l a p P C R电泳图2.4 重组表达质粒p E T28a-O m p A-O m p T S的构建及鉴定克隆得到融合基因o m p A-o m p T S后,通过限制性内切酶消化后与表达质粒p E T28a进行重组连接,并转化至宿主大肠杆菌B L21(D E3)中,于含有卡那霉素的抗性平板上培养,挑选克隆子,并利用p E T28a表达载体通用引物进行菌落P C R验证,结果如图5所示.可以看到,挑选的7个克隆中有6个扩增得到大小为2300b p左右(即融合片段与通用引物在表达载体自身克隆片段之和)的特异性片段,即为阳性克隆,对其进行保种并进行测序分析,测序结果显示阳性克隆株中含有成功连接了融合片段o m p A-o m p T的重组表达质粒. 2.5 O m p A-O m p T S融合蛋白诱导表达分析将p E T28a-O m p A-O m p T S质粒转化大肠杆菌B L21(D E3)得到B L21/p E T28a-O m p A-㊃821㊃第6期刘望等:嗜水气单胞菌外膜蛋白原核表达及其免疫保护性研究图5 含重组表达质粒p E T 28a -O m p A -O m p T S 阳性克隆菌株的P C R 鉴定O m pT S 重组菌,随后对其重组蛋白的表达条件进行了优化.结果发现重组表达菌株在培养2h 后添加I P T G1mM ,16℃下培养16h 经诱导后,与未经诱导重组菌全蛋白电泳条带相比,在相对分子质量约80k D a 处有一条表达量较高的蛋白条带,大小与O m p A -O m p T S 融合蛋白相符,说明O m pA -O m pT S 融合蛋白成功表达(如图6所示).MW :蛋白质分子量标准;1:I P T G 诱导后的p E T 28a/B L 21;2:诱导16h 后的p E T 28a -o m p A -o m p T S /B L 21;3:诱导前的p E T 28a -o m p A -o m p T S /B L 21重组质粒图6 O m p A -O m pT S 融合蛋白重组表达S D S -P A G E 电泳分析2.6 O m p A -O m pT S 融合蛋白的纯化为了进行后续的免疫保护效果的测定,首先需要对重组表达蛋白进行分离纯化.将诱导表达后以包涵体形式存在的融合蛋白进行超声破碎,沉淀经洗涤后用盐酸胍缓冲液溶解重组蛋白,经N i 柱亲和纯化的蛋白进行梯度尿素复性,随后S D S -P A G E 进行检测.结果显示,纯化后可获得大小约为80k D a 的目的蛋白(如图7所示).图7 O m p A -O m pT S 融合蛋白的纯化2.7 融合蛋白O m p A -O m pT S 免疫保护性分析在利用纯化后的融合蛋白O m p A -O m p T S ㊁混合F I A 佐剂的融合蛋白以及对照分别对斑马鱼进行免疫后,用嗜水气单胞菌L S 01进行鱼体攻毒实验.试验鱼攻毒后第1天便出现死亡,第2天开始,F I A 和P B S 对照组出现大量死亡的情况,而免疫组O m p A -O m p T S 及O m p A -O m p T S+F I A 组斑马鱼的死亡情况则明显减少(如图8所示).P B S ㊁F I A ㊁O m p A -O m p T S 和O m p A -O m pT S+F I A 组连续观察7d 的累计死亡率分别为100%㊁93.33%㊁31.7%和16.7%.O m p A -O m p T S 和O m p A -O m p T S +F I A 组对于斑马鱼在抵抗嗜水气单胞菌攻毒时的相对保护率分别为68.3%和图8 嗜水气单胞菌攻毒斑马鱼累计死亡率㊃921㊃陕西科技大学学报第35卷82.1%.可见,经融合蛋白O m p A-O m p T S免疫后的斑马鱼可以较好地抵制嗜水气单胞菌的侵染,具有较好的免疫保护效果.3 结论嗜水气单胞菌是水产养殖,尤其是淡水鱼类一种重要的条件致病菌,每年因其感染所引起的病害给我国水产养殖业造成了巨大的经济损失.传统的抗生素防治手段因易造成耐药性和药物残留等问题已被国家禁止在水产养殖过程中使用.疫苗由于具有较好的免疫活性和环境友好等优点已成为目前病害防治领域研究的热点.很多研究表明,外膜蛋白具有良好的免疫原性,是研制基因工程疫苗的良好材料[13-15].本研究选取p E T28a作为表达载体,将通过O v e r l a p P C R进行融合的两个外膜蛋白O m p A和O m p T S进行重组表达.成功获得可高效表达融合蛋白的重组表达质粒,通过对融合蛋白分离和纯化后获得融合蛋白O m p A-O m p T S,并对其进行斑马鱼免疫保护性实验,结果发现该融合蛋白O m p A-O m p T S在不添加佐剂时对斑马鱼的免疫保护率达到68.3%,与F I A佐剂混合后免疫保护率可达82.1%,可较好地抵御嗜水气单胞菌病害的发生.本研究为嗜水气单胞菌亚单位疫苗的设计与开发奠定了一定的理论基础.但鉴于嗜水气单胞菌不同分离菌株间的毒力和致病性差异较大,该融合蛋白对斑马鱼的免疫保护效果只进行了针对L S01菌株攻毒的检测,而对于其它嗜水气单胞菌菌株的保护效果则需进一步的实验分析.同时,本研究只进行了两个外膜蛋白的融合表达,后续可进一步地筛选嗜水气单胞菌其它具有较高免疫原性的蛋白进行亚单位疫苗的构建,以期得到免疫效果更佳优良的疫苗.参考文献[1]V i v a s J,C a r r a c e d oB,R i a n oJ,e t a l.B e h a v i o r o f a l l A e r o-m o n a s h y d r o p h i l a a r o Al i v ev a c c i n e i nw a t e rm i c r o c o s m s [J].A p p l E n v i r o n M i c r o b i o l,2004,70:2702-2708. 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嗜水气单胞菌侵袭机制及其胞外蛋白酶的研究

嗜水气单胞菌侵袭机制及其胞外蛋白酶的研究致病性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）是我国淡水养殖鱼类的重要病原对其侵袭机制和毒力因子的研究有重要的意义。

本文对我国分离的致病性嗜水气单胞菌AhJ-1株在体内、体外的侵袭机制以及其重要的毒力因子—胞外蛋白酶的产生条件，蛋白酶的致病性，蛋白酶的结构与功能之间的关系，蛋白酶的同源性以及结构预测进行了研究，并建立了一种检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。

1 用HEp-2细胞和异育银鲫作为细胞和动物模型，对嗜水气单胞菌AhJ-1株的侵袭机制进行了体内和体外研究。

采用庆大霉素裂解培养法对嗜水气单胞菌鱼源株AhJ-1对HEp-2细胞的侵袭特性进行了研究．结果显示，AhJ-1在4℃时不具有侵袭力，在37℃时对HEp-2细胞的侵袭率达到0.2％；细菌在细胞内能增殖；细胞松弛素D和酪氨酸蛋白激酶抑制剂能抑制AhJ-1的侵袭，而酪氨酸蛋白磷酸化酶抑制剂却能促进AhJ-1对HEp-2细胞的侵袭，Ca2+通道阻断剂对AhJ-1的侵袭力影响不大。

表明AhJ-1对HEp-2具有侵袭力，且与温度有关，信号转导，细胞骨架参与了侵袭过程．将绿色荧光质粒转化到AhJ-1株中，通过浸泡的方式对人工创伤、去除粘液，以及正常异育银鲫进行感染，结果发现创伤组和去除粘液组在感染后24h，其各器官的含菌量均高于对照组，说明伤口、皮肤是嗜水气单胞菌的感染途径，天然屏障在鱼类免疫中起重要作用。

2 对体外培养嗜水气单胞菌的胞外蛋白酶（ECPase）产生条件进行了优化。

结果发现，其产量与碳源、氮源、培养温度、培养基初始pH值等有关。

蔗糖能促进蛋白酶的产生，NH4+抑制蛋白酶的产生。

其最佳产酶条件为：pH7.5的0.02mol／L KCl，0.06mol/LK2HPO4，5g·L-1的蔗糖和5g·L-1的胰蛋白胨水，28℃，150r·min-1摇床培养65h。

嗜水气单胞菌外膜蛋白TolB的原核表达及生物信息学分析

河南农业科学，2024，53（2）：136‐143Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi:10.15933/ki.1004-3268.2024.02.015嗜水气单胞菌外膜蛋白TolB 的原核表达及生物信息学分析陈甜梦，蔡彤璇，王嘉璐，田牧野，赵宝华，刘东（河北师范大学生命科学学院，河北石家庄050024）摘要：为筛选TolB 作为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila ）渔用疫苗候选抗原，从嗜水气单胞菌中克隆了外膜蛋白tolB 基因并异源表达，采用生物信息学方法预测TolB 的理化性质和结构特征。

结果显示，tolB 基因片段（去除信号肽）全长1263bp ，编码1条含有420个氨基酸残基的多肽，分子质量45.78ku 。

成功在大肠杆菌E .coli BL21（DE3）中异源表达TolB 蛋白，其为稳定的亲水性外膜蛋白。

TolB 蛋白家族在不同菌株间具有同源性，尤其在气单胞菌间亲缘关系更近。

TolB 蛋白二级结构以无规则卷曲为主，具有潜在的B 细胞、细胞毒性T 淋巴细胞（CTL ）和辅助T 细胞（Th ）抗原表位；相互作用网络主要为Tol-Pal 系统蛋白。

综上，TolB 具有成为嗜水气单胞菌亚单位疫苗有效候选抗原的特性。

关键词：嗜水气单胞菌；TolB ；原核表达；蛋白质纯化；生物信息学中图分类号：S94；Q816文献标志码：A文章编号：1004-3268（2024）02-0136-08Expression and Bioinformatics Analysis of Aeromonas hydrophilaOuter Membrane TolB ProteinCHEN Tianmeng ，CAI Tongxuan ，WANG Jialu ，TIAN Muye ，ZHAO Baohua ，LIU Dong（College of Life Science ，Hebei Normal University ，Shijiazhuang 050024，China ）Abstract ：The purpose of this study is to evaluate the application of TolB as the candidate vaccine antigento prevent Aeromonas hydrophila infection in fish.Outer membrane protein gene tolB from A .hydrophila was cloned and expressed in Escherichia coli BL21（DE3）.Physicochemical properties and advanced structures of TolB protein were analyzed by bioinformatics.The results indicated that tolB gene had an open reading frame of 1263bp （exclude signal peptide ），encoding a protein （TolB ）of 420amino acidswith molecular mass of 45.78ku.TolB was successfully expressed and purified from Escherichia coliBL21（DE3）.TolB was a stable and hydrophilic outer membrane protein.TolB had homology among different bacteria ，and was more closely related in Aeromonas .The secondary structure of TolB was dominated by random coil.TolB had potential B ，CTL and Th cell antigen epitopes and interacted with other Tol‐Pal system proteins.In conclusion ，TolB could be used as an effective vaccine candidate antigen agaisnt A .hydrophila .Key words ：Aeromonas hydrophila ；TolB ；Prokaryotic expression ；Protein purification ；Bioinformatics 收稿日期：2023-06-15基金项目：河北省自然科学基金项目（C2019205044）；河北省高等学校科学技术研究项目（ZD2018070）；河北省教育厅优秀青年基金项目（YQ2014026）；河北师范大学重点基金项目（L2016Z03）作者简介：陈甜梦（2000-），女，河北石家庄人，在读硕士研究生，研究方向：微生物生物化学。

单壁碳纳米管载嗜水气单胞菌外膜蛋白亚单位疫苗的研制及免疫效果评价

单壁碳纳米管载嗜水气单胞菌外膜蛋白亚单位疫苗的研制及免疫效果评价姜倩雯1,2，张丽珊1,2，李小艳1,2，武瑶1,2，赵怡扬1,2，徐慧铭1,2，林向民1,2*(1. 福建农林大学生命科学学院，福建福州 350002；2. 福建农林大学，福建省农业生态过程与安全监控重点实验室，福建福州 350002)摘要：为了筛选细菌的疫苗候选蛋白，本实验根据课题组前期的研究，挑选了2个嗜水气单胞菌外膜蛋白(A0KLQ6和A0KH89)，以A0KHR9(OmpAII)为对照，通过比较外膜蛋白与碳纳米管载外膜蛋白通过腹腔注射与浸泡免疫模式，比较和评价斑马鱼的免疫反应与免疫保护效果。

结果显示，腹腔注射组和浸泡组与普通蛋白组对比，碳纳米管载蛋白能够显著提高斑马鱼免疫相关基因表达量。

腹腔注射组在5 μg剂量下免疫A0KHR9、A0KLQ6和A0KH89蛋白分别获得61.60%、65.39%和84.96%相对免疫保护率(relative immune protection rate，RPS)，在5 μg剂量下免疫碳纳米管载蛋白SWCNTs-A0KHR9、SWCNTs-A0KLQ6和SWCNTs-A0KH89分别获得68.10%、77.50%和90.43%的RPSs。

浸泡组在40 mg/L 剂量下免疫A0KHR9、A0KLQ6和A0KH89蛋白分别获得30.80%、25.85%和37.80%的RPSs，在40 mg/L最高剂量下免疫碳纳米管载蛋白疫苗SWCNTs-A0KHR9、SWCNTs-A0KLQ6和SWCNTs-A0KH89分别获得63.60%、73.74%和68.49%的RPSs。

研究表明，铁离子限制下嗜水气单胞菌外膜蛋白A0KLQ6和A0KH89等能够作为抗嗜水气单胞菌的亚单位疫苗候选蛋白，而单壁碳纳米管载蛋白通过注射免疫与浸泡免疫均能显著提升免疫疗效，是一种疫苗的适宜纳米载体。

以上研究为寻找高效的嗜水气单胞菌亚单位疫苗候选蛋白及佐剂提供了理论依据。

嗜水气单胞菌外膜蛋白原核表达及其免疫保护性研究

嗜水气单胞菌外膜蛋白原核表达及其免疫保护性研究刘望;杨佳杰;杨静;薛茜;张苗;刘欢【期刊名称】《陕西科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(035)006【摘要】Aeromonas hydrophila is one of the important fish pathogen in China,and antibiot-ics treatment for this disease can cause the drug-resistance.Therefore,it′s an urgent need for developing new prevention methods now.In order to obtain the subunit vaccine with better immunoprotective effect,the two outer membrane proteins,OmpA and OmpTS were fusion expressed in Escherchia coli and the products were purified and its protective efficiency on the zebra fish against Aeromonas hydrophila were tested.The results showed that the ompA (1032 bp) and ompTS (1068 bp) genes were successfully cloned and the fusion fragment, OmpA-OmpTS (2100 bp),was obtained by overlap PCR.Then the recombinant expression plasmid,pET28a-OmpA-OmpTS,was constructed and introduced into the host strain,esche-richia coli BL21 (DE3).The conditions for fusion protein expression were that with the addi-tion of 1 mM IPTG after 2 h of the strain growth at 16 ℃ for 16 h.The recombinant protein, OmpA-OmpTS was purified and mixed with the adjuvant (FIA ) to be injected to the zebra fish to test its protection effect against Aeromonas hydrophila.The immunoprotectivity reached 87.5%,indicating that this fusion protein can be a candidate vaccine for further de-velopment.%嗜水气单胞菌是我国水产养殖鱼类重要病原菌,抗生素防治易产生耐药性等问题,亟需开发新型防治手段.外膜蛋白OmpA和OmpTS是嗜水气单胞菌主要的免疫原蛋白,为了得到免疫效果更佳的亚单位疫苗,利用大肠杆菌将OmpA和OmpTS进行融合表达,并对表达产物进行纯化,检测其对斑马鱼的免疫保护效果.结果表明:成功扩增获得大小分别为1032 bp和1068 bp的OmpA和OmpTS基因序列,随后进行Overlap PCR,得到大小为2100 bp的融合片段OmpA-OmpTS.成功构建重组表达质粒pET28a-OmpA-OmpTS,将其转入BL21(DE3),重组蛋白的表达条件为:菌体培养2 h后添加IPTG 1 mM,16℃下培养16 h.经纯化后得到重组蛋白OmpA-OmpTS;最后将OmpA-OmpTS蛋白与弗氏不完全佐剂(FIA)混合免疫斑马鱼,免疫保护率可达82.1%,表明该融合蛋白可作为候选亚单位疫苗进行进一步的开发.【总页数】6页(P125-130)【作者】刘望;杨佳杰;杨静;薛茜;张苗;刘欢【作者单位】陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021;陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021;陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021;陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021;陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021;陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安710021【正文语种】中文【中图分类】S917.1【相关文献】1.嗜水气单胞菌外膜蛋白原核表达及其免疫保护性研究 [J], 刘望;杨佳杰;杨静;薛茜;张苗;刘欢;;;;;;2.嗜水气单胞菌外膜蛋白(OMP)的原核表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护研究[J], 胡春霞;李梅;李卫芬;许梓荣;沈文英3.嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因的原核表达及免疫保护性研究 [J], 郑宗林;郑曙明;DelbertM.GatlinIII;汪开毓4.鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的原核表达、免疫保护及抗血浆杀菌作用研究 [J], 荣娜;简思杰;孙薇;康超;伍娜娜;刘祥5.嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpK的原核表达、抗原性分析及抗血浆杀菌作用研究[J], 荣娜;康超;孙薇;简思杰;伍娜娜;刘祥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

嗜水气单胞菌脂肪酸生物合成途径相关蛋白的耐药性

嗜水气单胞菌脂肪酸生物合成途径相关蛋白的耐药性胡文杰;张香玉;吴倩;林梅贵;黄小芳;林向民【摘要】Widely exists in water and soil,Aeromonas hydrophila is a commonpathogen for human,livestock and fish.It was previously observed in our lab that the expression of the proteins associated with the fatty acid biosynthesis in A.hydrophilarose under the stress of chlortetracycline.But the specific properties and functions were not understood.Therefore,this study was designed to clone and express those potentially important proteins,including acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyl transferase subunit alpha (AccA),acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyl transferase subunit beta (AccD),3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase I (FabB),and malonyl coAacyl carrier protein transacylase (FabD) for further investigation.By comparing the survival rates of high-expression strains of A.hydrophila under chlortetracycline stress,the drug-resistance relating to the proteinsin the fatty acid biosynthesispathway was analyzed.The results showed that the high-expression proteins,AccD,FabB and FabD,could indeed significantly increase the survival rate of the pathogen under chlortetracycline stress,while AccA did so only during the initialstage.Consequently,a critical role of these proteins involving the bacterial drug-resistance was clearly demonstrated.With the finding,further study to unveil the mechanism of antibiotic-resistance of the pathogen is in order.%嗜水气单胞菌Aeromonash ydrophila是一种广泛存在于水体与土壤的人-畜-鱼共患病原菌.本课题组前期研究发现生物被膜状态下嗜水气单胞菌在抗生素金霉素的胁迫下,脂肪酸生物合成途径中相关蛋白表达上升,但具体特性与功能尚不明确.为进一步探究这些蛋白在抗生素胁迫下的变化规律与功能,设计引物克隆乙酰辅酶A 羧化酶羧基转移酶α亚基(AccA)、乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶β亚基(AccD)、酰基载体蛋白质合成酶(FabB)以及丙二酸单酰辅酶A酰基载体蛋白酰基转移酶(FabD).通过比较各高表达菌株在金霉素作用下的生存率,来分析相关蛋白的耐药特性.结果表明,高表达AccD、FabB和FabD蛋白能够显著提高细菌在抗生素胁迫下的生存率,而高表达AccA蛋白则只在前期提高细菌存活率.此研究揭示脂肪酸生物合成途径相关蛋白在细菌的耐药过程中起重要作用,也为后续研究嗜水气单胞菌的耐药机制提供了实验依据.【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2017(032)001【总页数】6页(P1-6)【关键词】嗜水气单胞菌;脂肪酸生物合成;耐药性【作者】胡文杰;张香玉;吴倩;林梅贵;黄小芳;林向民【作者单位】福建农林大学生命科学学院,福建福州 350002;福建农林大学福建省农业生态过程与安全监控重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学生命科学学院,福建福州 350002;福建农林大学福建省农业生态过程与安全监控重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学生命科学学院,福建福州 350002;福建农林大学福建省农业生态过程与安全监控重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学生命科学学院,福建福州 350002;福建农林大学福建省农业生态过程与安全监控重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学生命科学学院,福建福州 350002;福建农林大学福建省农业生态过程与安全监控重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学生命科学学院,福建福州 350002;福建农林大学福建省农业生态过程与安全监控重点实验室,福建福州 350002【正文语种】中文【中图分类】Q93嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila(Ah)隶属于弧菌科气单胞菌属，为革兰氏阴性菌[1]，广泛存在于水体和土壤中，是一种人-畜-鱼共患病原菌[2]。

嗜水气单胞菌溶血素A片段基因的克隆、表达及其产物的免疫学特性的开题报告

嗜水气单胞菌溶血素A片段基因的克隆、表达及其产物的免疫学特性的开题报告一、研究背景与意义嗜水气单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的病原体，对人类和动物造成的感染威胁较大。

其中，溶血素是一种重要的毒素，具有强烈的细胞毒性和溶血性。

因此，研究嗜水气单胞菌溶血素的结构和功能，对于深入了解其毒力机制、开发有效的防治方法具有重要的理论和实际意义。

本课题将以嗜水气单胞菌溶血素A片段为研究对象，通过基因克隆和表达，获取其产物并进行免疫学特性的分析，为深入研究嗜水气单胞菌毒力机制提供重要的实验基础。

二、研究内容和方法1. 儿茶酚胺反应PCR技术对嗜水气单胞菌溶血素A片段基因进行扩增，并进行测序和分析。

2. 将扩增后的溶血素基因克隆到表达载体中，构建表达载体。

3. 采用大肠杆菌BL21（DE3）作为表达基因的宿主菌，通过IPTG诱导表达，获取所需的溶血素产物。

4. 对表达产物进行Western blot和SDS-PAGE分析，检测其表达的稳定性和纯度。

5. 利用ELISA技术检测表达产物的免疫学特性，包括抗原性和免疫原性等方面的分析。

三、进度安排第一周：收集文献并撰写开题报告。

第二周：进行PCR扩增和酶切分析。

第三周：构建表达载体和转化宿主菌。

第四周：IPTG诱导表达，获取表达产物。

第五周：进行纯化和Western blot分析。

第六周：利用ELISA技术进行免疫学特性分析。

第七周：撰写实验结果，进行数据统计和分析。

第八周：完成实验结果的解释和结论撰写，并进行报告答辩。

四、预期成果本研究将成功克隆和表达嗜水气单胞菌溶血素A片段，获取其产物并进行免疫学特性的分析。

结果将进一步研究嗜水气单胞菌毒力机制和防治策略的制定，对于提高对嗜水气单胞菌感染的治疗效果和预防效果具有重要的意义。

嗜水气单胞菌转录调控蛋白基因的克隆与序列分析

嗜水气单胞菌转录调控蛋白基因的克隆与序列分析李雪;胡秀彩;兰云;沈晓静;吕爱军;朱爱华【摘要】Transcriptional activator protein(AhyR)gene of Aeromonas hydrophila strain Zf1 was amplified by PCR using the designed primers, resulting in a 1 063 bp DNA sequence. The sequencing analyses revealed AhyR gene encoding a protein of 260 amino acids which has autoinducer binding domain(18-168 aa)and LuxR-type helix-turn-helix(HTH)domain for DNA binding(176-241 aa). Moreover, AhyR protein was predicted containing 13 phosphorylation sites(ie., 15S, 30T, 62S, 144S, 145S, 156S, 161Y, 173S, 184T, 188T, 200S, 227S and 231Y). The homology modeling of 3D structure of AhyR protein was carried out based on the template retrieved from chain A of quorum sensing control repressor(PDB:3SZT_A). AhyR protein showed the homology of 28.40%with the standard model, and the physiological activity subunit LuxR-type HTH domain profile was located in the outer surface of the C-terminal. The quality of the resulting protein structure was further checked by the Ramachandran plot.%根据嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）转录调控蛋白（AhyR）基因序列设计特异性引物，采用PCR方法克隆嗜水气单胞菌Zf1菌株AhyR基因，测序目的基因大小为1063 bp。