ES细胞培养

ES 细胞培养

A.FBS的灭活与分装

1.化冻

将血清（Fetal Bovine Serum，Hyclone）从－20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻过夜；也可室温（或浸于自来水中）化冻，化冻后若不马上灭活，可以放入4℃冰箱暂时保存；

2.灭活

（1）放入室温的水浴锅内开始加热（同时放入一个内装200 ml自来水的血清瓶，插入一根温度计，温度监控以此为准）；

（2）当温度计显示56℃时，控制在此温度30分钟±3分钟；若不小心使温度上升超过56℃，则：若仍未超过60℃，且时间很短（比如：不超过5分钟），则仍可使用；若超过60℃，或者时间较长，则弃去不用，或者尝试用于ME细胞的培养；

（2）取出，自然冷却至室温（约需1－3小时），可分装或－20℃继续冻存；

3.分装

（1）转入细胞间，用移液器将血清分装，注意预先要将血清轻轻摇动数周、混匀；吹出血清时要注意：不要吹出气泡（血清很粘稠，很容易产生气泡；如果已产生气泡，则在酒精灯火焰上过一下）；标好批号和日期；

（2）放入－20℃冰箱冻存(分装一次大约可以使用1—2个月)。

B. 配制DMEM血清培养基

1.提前一天将分装好的FBS从—20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻；

2.在细胞间中将FBS以及其它需要添加的成分（如，丙酮酸钠、抗生素等），按照比例加入DMEM培养基中，作好标签；放入4℃冰箱保存。

配制比例如下：

50ml体积的干细胞培养液配制

DMEM（High glucose）/ DMEM培养基（高糖

谷氨酰胺（）

50ul

非必需氨基酸500ul

丙酮酸钠500ul

B-巯基乙醇？？

双抗

50ul

血清

7.5ml

LIF

5ul

C.原代胚胎成纤维细胞（ME）的制备

1. 取1

2.5-1

3.5dpc孕鼠，断颈处死；

2. 将鼠腹面向上放置，70% 酒精润湿、消毒腹部（防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫），剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中；

3. 把平皿转入超净台；

4. 用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏（主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等）；

5. 将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次；

6. 弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色（1－4次）；

7. 加入适量Trypsin-EDTA（0.25% Gibco 25520，下同），体积约等于组织块体积；

8. 用滴管轻轻吹匀，室温下消化1－10分钟（或消化至溶液浑浊变粘），加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀（5－10次），静置；

9. 沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。

10. 将细胞悬液管离心（1000转5分钟）；

11. 弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10 cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签（ME－0；注意：若冻存，则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder；若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder，要传到一代以后再用来制作Feeder比较好），转入培养箱培养；

12. 视细胞生长情况换液（一般3天换液一次），若细胞已长满，则冻存，或者1：3-5传代（视细胞疏密而定），放入培养箱继续培养（此后不用再换液）；1－5代的ME细胞均可用来制作Feeder。

饲养层细胞（Feeder）的制备

（实验室所用MMC为10 mg/mL，注：含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基（FBS占10%）

Calbiochem）

1.弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基（DMEM+10% FBS）；

2. 放入培养箱培养3小时（2－4小时）；

3. 用0.1% 明胶处理培养皿（将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可），室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止；

4. 弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2－3 mL PBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次（必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性）；

24. 加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可（如细胞过稀，可再补加丝裂霉素处理过的细胞），半小时后即可使用（如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上），可使用6－10天，用前更换培养液（如未用明胶处理培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用；最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做）。

ES细胞培养基

DMEM+15�S

2-巯基乙醇：5.5uM 1000X Gibco 21985-023

L-谷氨酰胺：2mM 100X Sigma G8540

LIF：1000U/mL 10000X Chemicon ESGRO® (LIF); 10E7 units，货号:ESG1107

非必需氨基酸：100uM 100X Gibco 11140-050

双抗：100X Gibco 15070-063

ES细胞的复苏

1. 提前制备好相应数量的Feeder；

2. 准备37－39℃的热水，从液氮罐中取出所需冻存管（冻存细胞），迅速投入热水中，迅速剧烈摇动直至冻存液全部融化；

3. 转入无菌间，1000转/分钟离心5-10分钟；

4. 弃上清，加入1 ml ES培养液轻轻吹打重悬，转入铺有饲养层细胞的培养皿中（冻存前细胞来自多大的培养皿，复苏时就用相应大小的培养皿），补加适量培养液；

5. 转入培养箱培养，次日换液；此后每24小时换一次液，每48小时传一次代（视生长情况）。

ES细胞的换液

1. 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温（或者放于37℃温箱内）；

2. 细胞培养皿从培养箱内取出，相差显微镜下作常规观察（判断生长情况，并确证未发生污染）后转入无菌操作台内；

3. 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，换新鲜培养基（6 cm培养皿约5 mL，3.5 cm培养皿约3 mL培养基；若死细胞较多则可以先用PBS洗一次，再加培养基）；

4. 放回培养箱继续培养。

ES细胞的传代

1. 前一天下午做好所需数量的Feeder细胞板；

2. 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温（或者放于37℃温箱内）；

3. 将ES细胞培养皿、Feeder细胞培养皿从培养箱内取出（相差显微镜下作常规观察，Feeder 细胞应生长良好，细胞覆盖95%左右，至少90%以上的培养皿面积）；ES细胞应生长良好，接近长满培养皿，细胞集落大小一致、疏密均匀，集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表面光滑，细胞生长致密、核大、胞质少；

4. 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用约30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，弃去；再作用1—5分钟，不时观察，待细胞层（皿底一层白色脏东西样膜）出现裂缝并明显开始下滑时，补加培养基，适度吹打（视消化程度及管口粗细而定，至看不到明显的大的细胞团块为止）；平均分到Feeder培养皿中（滴加，以