RNAi 实验4 个要素和基本实验路线
RNA提取及PCR操作流程
RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)操作步骤:1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。
样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。
TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。
TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。
加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。
一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。
取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。
样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。
RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。
用异丙醇沉淀水相中的RNA。
每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。
RNAi实验4 个要素和基本实验路线
RNAi 实验4个要素和基本实验路线RNA 干扰是一种自然发生的基因沉默机制，应用于基因功能研究和临床疾病治疗，就成为一种功能非常强大的工具。
不过，开展RNAi实验并不难，不需要特殊的仪器，RNAi实验所需的4大要素一点不复杂：•对应目标基因的dsRNA(siRNA,长dsRNA，shRNA载体,看实验需要）；•适合的转染或者其他将dsRNA递送进入细胞的方法；•适当的对照；•检测目标基因表达情况的方法1.对应目标基因的dsRNA在非哺乳动物细胞中，直接向细胞导入长双链RNA(dsRNA)，在细胞质核酸酶Dicer的作用下可将长双链RNA降解为21-23bp的小分子干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，这些小分子RNAs结合其他元件形成“RNA诱导沉默复合物”(RNA-induced silencing complexes，RISCs)，并引导RISCs 结合到与之互补的mRNA序列上，降解对应的mRNA，从而导致对应蛋白质水平下降，最终导致目标基因表达沉默(见下图：线路1，蓝色)。
对于哺乳动物细胞来说，导入30bp以上的长双链RNA(dsRNA)往往会诱发非预期的抗病毒应答反应，此路不通。
所以常见的做法是直接制备19-23bp左右的siRNAs，将siRNAs转入哺乳动物细胞(线路2，红色)；或者是将短发夹结构RNA(short hairpin RNAs，shRNAs)的DNA表达载体转入细胞，表达产生shRNA，经过Dicer切割后得到siRNA(线路3，黄色)；最后siRNAs同样和其他元件组合成为RNA诱导的沉默复合物RISCs，在siRNA指引下识别对应的mRNA序列并降解mRNA，从而使特定基因表达沉默。
线路1和2均为诱发瞬时基因沉默，持续时间约3－7天，根据目标基因而异，shRNA表达载体则可以建立长效基因沉默的细胞株，进行功能缺失基因组筛选研究，也可用于体内RNAi研究。
RNAI实验步骤案例
RNAI实验步骤案例1、RNAI技术简介RNAi(RNA interference，即RNA干涉)是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象，它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA和反义RNA)，从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的[1]。
RNAi现象首先是1998年在线虫中发现。
Fire及其同事们在尝试着用反义RNA抑制基因表达时，试图研究正链RNA与反义RNA 的协同作用，然而他们却意外地发现正链RNA与反义RNA的混合物，即双链RNA 对基因的沉默作用较任一单链RNA都要强十倍以上[1]。
这种双链RNA导致的RNA 干涉现象随后在果蝇、昆虫、真菌、植物拟南芥等生物及哺乳动物细胞中也分别发现，并且在线虫中，RNA干涉对90%以上的基因的转录后表达产生抑制作用[2]。
由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。
RNAi机制包含两个过程：首先dsRNA被Dicer切割产生siRNA；然后RISC识别并结合siRNA。
介导靶基因mRNA在与dsRNA同源的区段内，按照同样的间隔被降解成21～23nt 的小片段[3]。
1.1 microRNA简介microRNA（简称miRNA）是一类由基因组编码、细胞内源表达的、约为22 nt的非编码小RNA。
它通过降解靶基因mRNA或抑制其翻译过程（高等动物中主要是后者），来调控真核细胞的基因表达[3]。
虽然microRNA可以引发靶基因mRNA的降解，或转录抑制，但多数情况下（尤其是在高等动物中）主要通过与mRNA 的3’UTR不完全的配对抑制其翻译，从而影响很多蛋白质的产量[3]。
1.1.1 miRNA与肿瘤的研究关于癌症基因研究的的最新进展是miRNA领域，miRNA是长度大约在22个核苷酸的单链RNA分子，miRNA可以通过调节靶mRNA的平移效率来负性调节基因的表达。
RNA研究相关的实验原理及操作介绍
RNA研究相关的实验原理及操作介绍1. ChIRP-Seq（Chromatin Isolation by RNA Purification）ChIRP-Seq：培养的细胞在活细胞中交联，它们的染色质被提取并均匀化。
利用磁性链霉亲和素珠，将感兴趣的RNA与目标RNA杂交并分离得到生物素化互补寡核苷酸。
将纯化的染色质洗脱成蛋白质、RNA或DNA，然后进行下游检测以进行鉴定和定量，ChIRP-Seq能在全基因组水平上对lncRNA与染色质之间所有潜在的相互作用位点进行标记。
原理：戊二醛固定细胞后，利用声波降解法进行细胞裂解和染色质断裂，在裂解物中加入带生物素标记的oligo探针与lncRNA杂交，利用链霉素亲和磁珠分离纯化（与生物素亲和）。
最后加RNaseA，从复合物中将lncRNA结合的蛋白和DNA片段洗脱下来，用于后续分析。
实验操作视频链接：/video/3912/chromatin-isolation-by-rna-purification-chirp实验操作protocol：二、RNA原位杂交（RNA in situ hybridization）RNA原位杂交（RNA in situ hybridization）：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相杂交，经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA/lncRNA等分子，可检测该lncRNA是否位于核内或在细胞内的分布情况。
原理：将特定标记的已知序列核酸做为探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，从而对特定核酸进行精确定量定位的过程。
原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。
根据RNA序列设计cDNA探针，可结合RNA和DNA。
三、荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH)FISH：对于RNA分布定位，一般会使用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）。
RNAi的实验原理和操作实用技术
RNAi的实验原理和操作实用技术几十年来生物学上最重要的进展，也许是关于R N A分子能调节基因表达的发现。
R NA干涉（R N Ai）是指双链RN A分子使基因表达沉寂的现象，是在线虫中发现的，在 1998年的一篇Nat ure论文中被公诸于众。
此后，科学家们明白，RNAi还有其他形式，它既是一种了解基因功能的强大工具，又是很多生物的基因组所采用的一种在演化上来讲很古老的防卫方法。
RNAi肯定有很多新用途，RNAi还可能具有一些仍然有待去发现的天然功能。
RNAi实验原理与方法近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRN A)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。
这种转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。
一、RNAi的分子机制通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effe ctor steps)。
在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(smallinterfering RNAs, siRNAs)。
证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNa se III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。
在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。
siRNA序列搜索
• 二、选择2-4个靶点序列
siRNA选择标准
• 三、设计合适的对照siRNA——确 保数据的有效性
• 阴性对照siRNA：与所选的siRNA核酸组成相同，但与其 他基因相比缺乏显著的同源序列。打乱所选的基因特异性 siRNA的核酸序列，并进行搜索使其与其他基因无同源性。 • 针对相同基因的其他siRNA：也许是确保siRNA数据的可 靠性的最佳途径。
具体设计原则
• • • • • • • • • 1． 在所选基因的启动子100个碱基以后开始自5’-端开始 2． 寻找基因序列中的23个碱基， 最好是5‘- AA（N19）TT -3’ （N是任 何碱基） 3． 如果找不到以上AA（N19）TT，则用 AA（N21）补足。 4． 如果找不到以上AA（N21）， 则用 NA（N21）补足。 5． 所选定序列中，G和C的数目的总和在总数（23）的35-55%. 6． 满足以上1-5项要求的片段数目如果不足四个，将G和C的数目的总和 放宽至总数（23）的30-70%. 7． 选好上述序列后，以此确定所需合成双链RNA oligo 的序列如下： 8． 正义序列 （N19）TT 与上述选定的23 个碱基序列中的第3-23个碱基 相同 9． 反义序列的3’----5’ 的序列与目标序列中的第1-21个碱基互补， 即A变 成T，C变成G， T变成A， G变成C。 10． 将反义序列3’----5’ 改写成 5’----3’. 11． 将最后所得序列中除3’- 末端的两个碱基之外的所有碱基中的T都用U来 替代。 最后每三个组成一个字节，中间断开。 12． 将所选定的正义序列和反义序列与gene bank 中已知同物种的基因序 列进行比较，确定其唯一性（BLAST）
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具体设计原则
rnaseq流程步骤
rnaseq流程步骤RNA测序（RNA-seq）是一种用于研究转录组的高通量测序技术。
它可以帮助我们理解基因表达和转录调控的机制，并揭示基因功能和调控网络。
本文将介绍RNA测序的流程步骤。
1. 样品制备RNA测序的第一步是样品制备。
样品可以是细胞、组织或者其他生物学材料。
首先，需要提取RNA，通常使用酚-氯仿法或商业化的RNA提取试剂盒。
提取的RNA可以是总RNA，也可以是多聚A+ RNA，取决于研究的目的。
2. RNA质量检测提取的RNA需要进行质量检测，以确保RNA的完整性和纯度。
常用的方法有比色法、凝胶电泳和生物分析仪。
RNA的A260/A280比值应在1.8-2.2之间，表示RNA的纯度较高。
3. RNA文库构建RNA测序需要构建RNA文库，即将RNA转录为cDNA，并进行文库的建立。
常用的文库构建方法有两种：全长文库和选择性文库。
全长文库包括了RNA的全部信息，而选择性文库只包括了某些特定的RNA，如mRNA或非编码RNA。
4. 文库测序构建好的RNA文库需要进行测序。
目前常用的测序技术有两种：第一代测序和第二代测序。
第一代测序技术包括Sanger测序和454测序，具有高准确性但测序量较少。
第二代测序技术包括Illumina测序、Ion Torrent测序和PacBio测序等，具有高通量但准确性稍低。
5. 数据质量控制测序得到的原始数据需要进行质量控制，以排除低质量的序列。
常用的数据质量控制工具有FastQC和Trimmomatic。
这些工具可以检查序列的质量分数、序列长度分布和测序错误等，并根据设定的阈值进行过滤和修剪。
6. 数据比对和定量质控后的序列数据需要进行比对和定量。
比对是将测序reads与参考基因组序列进行比对，以确定每个reads的起源。
常用的比对工具有Bowtie、STAR和HISAT等。
定量是根据比对结果，计算每个基因或转录本的表达水平。
常用的定量工具有HTSeq和featureCounts等。
RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南
RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南RNA提取是一项重要的实验技术，也是分子生物学和基因表达研究的前提之一。
RNA提取的操作步骤、注意事项和可能出现的问题是影响实验结果的关键因素。
本文将介绍RNA提取实验的操作步骤、注意事项和问题指南，以便帮助读者更好地完成RNA提取实验。
RNA提取实验操作步骤1. 样本的准备在实验开始前，需要准备好样本。
样本可以是组织、细胞、菌落等，在RNA提取中通常使用 TRIzol 或 RNeasy 等试剂进行样品裂解和提取。
样本的数量和来源需要根据实验的需要来决定。
2. 细胞裂解样品准备好之后，需要进行细胞裂解，使细胞内部的 RNA 释放出来。
裂解的方法可以是机械裂解、化学裂解或声波裂解等。
3. RNA 的提取和纯化经过细胞裂解后，需要使用 RNA 提取试剂对 RNA 进行提取和纯化。
经过提取和纯化后，可以通过检测 A260/A280 值的比例来确定 RNA 的纯度和浓度。
4. 聚合酶链式反应（PCR）检测经过 RNA 的提取和纯化之后，需要进行 PCR 检测，确定 RNA 是否已经被成功提取和纯化。
PCR 检测需要使用适当的引物和探针，并遵守相应的反应条件和分析方法。
RNA提取实验注意事项1. 样品选择选择合适的样品，保证样品的活性和稳定性。
不同类型的样品需要使用不同的RNA 提取试剂，因此需要选择适当的试剂和方法。
2. 操作规范在 RNA 提取过程中，需要保持操作规范，如穿戴实验手套和实验衣服等，避免 RNA 受到污染。
在实验过程中要注意操作细节，如注射器和离心管应保证干净和无漏，对样品的取用和储存要进行标记和记录。
3. RNA 的质量控制在 RNA 提取的过程中，需要进行质量控制，如测定 RNA 的纯度和浓度等。
在进行下一步操作之前，必须检查 RNA 的质量和质量指标，如 A260/A280 值的比例要在 1.8 ~ 2.0 之间， RNA 的完整性要保证。
实验一RNA提取方法及原理
实验一RNA提取方法及原理RNA提取是一种重要的实验方法，它可以将RNA从细胞或组织中分离出来，用于进一步的实验研究。
在这篇文章中，我们将介绍一种常用的RNA提取方法及其原理。
RNA提取方法一般分为有机试剂法和无机试剂法两种。
有机试剂法包括酚-氯仿法和酚-醚法，无机试剂法包括柱式提取法和磁珠提取法。
下面我们以酚-氯仿法为例介绍RNA提取方法及其原理。
酚-氯仿法是一种经典的RNA提取方法，它利用有机试剂酚和氯仿对细胞或组织进行裂解和分离，最终将RNA提取出来。
该方法的步骤如下：1.细胞或组织裂解：将待提取RNA的细胞或组织加入细胞裂解缓冲液，通过机械打碎或超声波处理，使细胞或组织完全裂解释放出RNA。
2.高速离心：将裂解后的混合液通过高速离心，将细胞碎片、核酸混合物和脂质分离。
3.加入酚：将上一步得到的上清液转移到离心管中，加入等体积的酚，混匀离心。
4.加入氯仿：将上一步得到的上清液转移到新的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀离心。
5.冷沉淀：离心后，上清液分为两个相，上层是DNA/RNA的酚相，下层是蛋白质的酚相。
将上层的酚相转移到新的离心管中。
6.沉淀：加入等体积的冷异丙醇或冷酒精，沉淀DNA/RNA。
冷沉淀使得核酸溶解度下降，从而沉淀出来。
7.脱水：将沉淀的DNA/RNA用无水乙醇洗涤一次，去除杂质。
8.反转录：将脱水后的DNA/RNA通过逆转录酶转录成cDNA，用于后续的实验研究。
酚-氯仿法的原理是利用酚对脂质膜的溶解作用，从而裂解细胞或组织释放出RNA。
酚可以溶解脂质膜，但不能溶解RNA和DNA。
氯仿能够与酚和蛋白质形成复合物，从而使RNA和DNA从水相分配到氯仿相中。
通过酚-氯仿法，我们可以将RNA与其他杂质分离开来，得到纯净的RNA溶液。
需要注意的是，在RNA提取过程中，应该尽量避免RNA的降解。
因此，可以在提取过程中使用RNase抑制剂，防止RNA被降解。
此外，RNA提取的成功与否还与细胞或组织的处理方式、裂解缓冲液的选择等因素有关，需要根据具体实验条件进行优化。
RNAi的实验原理和操作实用技术(2)
RNAi的实验原理和操作实用技术(2)2.体外转录以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。
不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。
而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。
值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。
最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。
不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。
长期研究。
3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。
而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。
选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。
在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。
由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。
不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。
现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。
最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗体内表达前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。
RNA提取的实验步骤及结果剖析
RNA提取的实验步骤及结果剖析本文详细介绍RNA提取前的实验准备、RNA提取的详细实验步骤，以及对RNA提取结果的剖析。
希望可以大家在做克隆和荧光定量时有所帮助！注意:RNA提取也做到无菌操作的水平！ⅠTrizol法实验原理Trizol内含异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性并释放出核酸；由于释放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同，且分别位于中间相和水相，从而使DNA和RNA得到分离；取出水相后，通过有机溶剂(氯仿)抽提及异丙醇沉淀，可得到纯净RNA。
预备实验1.DEPC简介DEPC是一种潜在的致癌物质，主要是能生成乙酯基衍生物和乙酯类衍生物，其中尿烷是一种已知的致癌物质。
DEPC有刺激性，对眼睛和气道粘膜有强刺激，在操作中应尽量在通风的条件下进行，DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，不小心占到手上注意立即冲洗。
由于DEPC是一种酯类，较难溶于水，故通过加热搅拌的方式来使其溶解。
2.1%的DEPC水的制备（1L）取1mlDEPC于999ml去离子水中，37℃在磁力搅拌器上搅拌4h 以上使其溶解。
此溶液即1%DEPC水。
注意：①DEPC与水反应后会产生大量的气体，可用塑料膜将瓶口扎紧，剧烈混匀后通过观察塑料膜是否胀气来判断反应是否充分②DEPC水的量可以根据需要配制即可，原则上确保所有的物品都能浸在DEPC水中。
③制备的1%DEPC水，应留下100ml左右并装入100ml左右的试剂瓶中，以备溶解RNA用。
注意：根据试剂瓶的大小调节所留的DEPC水的量，原则是确保DEPC水能够充满整个试剂瓶，并且盛有DEPC水的试剂瓶也要放置过夜，然后高温高压灭菌使DEPC分解后才能用于溶解RNA。
④配制DEPC处理水时用棕色瓶。
3.离心管、各种大小的枪头（1000ul、200/100ul、10ul）根据步骤及提取的量计算所需的个数，然后用制好的1%DEPC浸泡比计算数目略多的过夜处理。
RNA提取实验方案
RNA提取实验方案1.所需试剂和设备-细胞样品（细菌、真核细胞等）- RNA提取试剂盒（例如TRIzol）- RNase去除剂（例如RNase A）-乙醇或异丙醇-游离亚硫酸-蒸馏水-离心机-定量和质量测量设备（例如紫外-可见光分光光度计）-冰桶和冷冻离心管2.操作步骤A.细胞样品处理和收集1.根据实验需求选择适当的生长培养基和条件培养细胞。
2.在适当的培养条件下培养细胞样品直到其数量达到目标水平。
3.将细胞样品收集到冷冻离心管中，通过离心将细胞沉淀于离心管底部。
B.细胞裂解和RNA分离4. 在冷冻离心管中加入适量的RNA提取试剂盒（例如TRIzol），按照试剂盒说明书中的比例加入。
5.快速颠倒离心管，混合细胞样品和试剂，使样品充分裂解。
6.在室温下静置5-10分钟，促使RNA与试剂发生充分结合。
7. 加入适量的RNase去除剂，按照试剂盒说明书中的比例加入。
8.快速颠倒离心管，继续混合样品。
9. 在室温下静置10分钟，使RNase去除剂与RNA结合。
C.RNA沉淀10.加入等体积的冷异丙醇或乙醇，混合样品。
11.在室温下静置10分钟，使RNA沉淀。
13.小心倒掉上清液，避免损失沉淀的RNA。
15.重复洗涤步骤一次。
D.RNA溶解和保存16.用适量的蒸馏水溶解RNA沉淀，使其完全溶解。
17.使用紫外-可见光分光光度计定量和质量测量RNA的浓度和纯度。
18.根据实验需求将RNA保存在合适的条件下（例如冷冻保存）。
3.注意事项- 在整个过程中要注意RNA的RNase污染，使用经RNase去除的试剂和消毒实验器具以避免污染。
-在RNA提取过程中要注意细胞样品的处理和保存，避免样品质量下降。
-每个步骤中的试剂和设备要根据实验室的具体情况进行选择和调整。
-在浓度和纯度测量RNA时要严格按照设备和试剂的操作要求进行操作。
这份RNA提取实验方案提供了一个通用的操作步骤，以便科研人员从细胞样品中提取RNA。
根据实验需求，可以对方案进行修改和调整，以获得更好的提取效果。
RNAi的实验设计及使用步骤
RNAi的实验设计及使用步骤RNA 干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA 特异性的核酸酶Dicer 将dsRNA 裂解成由21-25 个核苷酸组成的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA 作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
siRNA 设计A.哺乳动物siRNA 设计基因抑制的有效性很大程度取决于目的基因序列的选择。
目的序列可以随机选择也可以通过在目的基因的不同区域上测试不同的序列以决定何种序列是最有效的。
哺乳动物siRNA设计需要注意的几个方面1．从转录本（mRNA）的AUG 起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19 个碱基序列，作为潜在的siRNA 靶位点。
正义链和反义链都采用这19 个碱基(不包括AA 重复)来设计。
2．避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。
3．siRNA 序列的GC 含量应为30%-60%左右。
4．在设计siRNA 时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslatedregions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNA 核酸内切酶复合物结合mRNA 从而影响siRNA 的效果。
5．将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。
将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。
例如使用BLAST （/BLAST/）。
7．选出合适的目标序列进行合成。
通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA 序列。
RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南
RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS （溶液均需用DEPC处理过的水配制）。
操作步骤：1. 匀浆处理a. 植物组织:以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.，大约100mg 叶片使用1 ml Trizol.b. 动物组织:以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70℃冻存组织,每50-100mg 组织加1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.c. 单层培养细胞.直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol.用取样器吹打几次.注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染.d.细胞悬液:离心取细胞，每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。
加Trizol 前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理。
e.血液处理:直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10 000rpm 离心1min。
弃上清，收集白细胞沉淀。
每1ml 血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。
2. 将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。
3. 可选步骤:4 ℃10 000rpm离心10min，取上清。
如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。
取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min。
RNAi实验技术手册
RNAi实验技术手册介绍rnai的基本信息SiRNA与RNAi实验技术手册RNA是生物体内最重要的物质基础之一，它与DNA和蛋白质一起构成生命的框架，但长久以来，RNA分子一直被认为是小角色。
然而，一系列发现表明――这些小分子RNA事实上操纵着许多细胞功能。
它可通过互补序列的结合反作用于DNA，从而关闭或调节基因的表达。
甚至某些小分子RNA可以通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。
RNA干涉（RNAi）是在线虫中发现的，在1998年的一篇Nature论文中被公诸于众。
此后，科学家们还明白，RNAi还有其他形式，它既是一种了解基因功能的强大工具，又是很多生物的基因组所采用的一种在演化上来讲很古老的防卫方法。
一、什么是siRNA和RNAi？双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA，这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了，双链RNA对基因表达的阻断作用就被称为RNA干预（RNA interference, RNAi ）。
二、RNAi的作用机制是什么？目前RNAi的作用机理主要是在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内阐明的。
生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染、转座子的转录产物、外源导入的基因。
这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除、转座子的表达被阻断、外源导入基因表达被阻断，同时与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。
通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。
A、在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。
证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。
RNAi技术及其实验操作
RNAi技术及其实验操作点击次数：252 发布时间：2010-11-14 14:04:09RNAi技术及其实验操作目前对RNAi （RNA interference）的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：①RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。
②RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。
具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。
如果将其作为一门生物技术，则定义为：①RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA（有义RNA 和反义RNA）,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。
②RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。
③RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA（dsRNA ）导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默（post - transcriptional gene silence , PTGS）。
各种不同定义虽然说法不同，但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。
也就是说，RNAi技术是利用RNAi为原理，在体外利用化学或酶促合成siRNA，也可构建在体内合成siRNA的质粒或病毒表达载体，然后利用传统微注射磷酸钙法、电穿孔转染法、脂质体介导转染等方法转染细胞从而致使靶基因沉默的技术。
RNA干扰有很多方法：①化学合成法：应用最广泛但成本昂贵，体外合成的长21nt、3`端带有2个游离核苷酸的siRNA较其它形式合成的RNA具有更大效率的降解目的mRNA的效果。
rna测序思路
rna测序思路RNA测序是一种基于高通量测序技术研究转录组的方法，可以快速获取一个基因组中RNA的种类和数量。
以下是RNA测序的基本思路：1. 样品准备：选择适当的生物样品，如细胞、组织或血液等，根据研究目的和问题来选择。
样品需要经过适当处理以提取出RNA。
2. RNA提取：这是RNA测序的第一步，目的是从样品中提取出RNA分子。
常用的方法有酚-氯仿法、磁珠法、柱子法等。
这一步的目的是去除样品中的DNA、蛋白质和其他杂质，以便进行后续的测序。
3. RNA纯化：提取到的RNA可能会伴随着DNA、蛋白质和其他杂质，需要进行纯化以去除这些杂质。
常用的方法有RNA酶消化、硅胶柱纯化等。
纯化后的RNA 质量对后续的测序结果有很大影响。
4. cDNA合成：由于RNA是单链分子，为了进行测序，需要将其转录成双链DNA，即合成互补DNA（cDNA）。
这一步通常使用反转录酶将RNA作为模板合成cDNA。
5. 文库构建：将cDNA片段连接到测序载体上，构建测序文库。
这一步需要进行末端修复、连接接头、PCR扩增等处理，最终构建成文库。
6. 测序：构建好的文库通过高通量测序技术进行测序。
常用的测序方法有第一代测序技术（Sanger测序）和第二代测序技术（如Illumina测序）。
测序过程会产生大量的原始数据，需要进行后续的数据分析。
7. 数据分析：测序得到的数据需要进行质控、序列比对、注释和差异表达分析等一系列的数据分析步骤。
这些分析可以帮助研究者了解RNA的组成、表达水平和功能等信息。
数据分析是RNA测序的关键步骤，涉及多个复杂的过程和技术。
通过以上步骤，研究人员可以获得基因组中RNA的种类和数量信息，进一步了解基因的表达水平和功能状态。
这有助于揭示基因的表达模式、基因融合、突变和差异表达等方面的信息，为深入探究生命过程和疾病机制提供有力支持。
RNA提取试验步骤
RNA提取实验步骤
1.将组织用剪刀剪碎或研钵研碎，尽量剪碎。
2.根据组织块的大小，加入800-1000微升的RNA裂
解液TRIOZOL，充分混匀。
3.加入200微升的氯仿，充分混匀，室温放置5分
钟。
4.14000rpm，4℃离心15分钟。
取上清到一个新的
离心管。
注意：不要取到中间的蛋白层。
5.加入等体积的异丙醇后充分混匀。
6.14000rmp，4℃离心15分钟，可见白色的RNA沉
淀。
7.弃上清，加入70%的乙醇500微升，上下混匀。
8.14000rmp，4℃离心5分钟。
9.弃上清，加入70%的乙醇500微升，上下混匀。
10.14000rmp，4℃离心5分钟。
11.弃上清，室温干燥5分钟左右（注意：不要让管
内的RNA过于干燥）。
12.根据RNA沉淀的大小加入DEPC水15-40微升。
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RNAi 实验4个要素和基本实验路线
RNA 干扰是一种自然发生的基因沉默机制，应用于基因功能研究和临床疾病治疗，就成为一种功能非常强大的工具。
不过，开展RNAi实验并不难，不需要特殊的仪器，RNAi实验所需的4大要素一点不复杂：
•对应目标基因的dsRNA(siRNA,长dsRNA，shRNA载体,看实验需要）；
•适合的转染或者其他将dsRNA递送进入细胞的方法；
•适当的对照；
•检测目标基因表达情况的方法
1.对应目标基因的dsRNA
在非哺乳动物细胞中，直接向细胞导入长双链RNA(dsRNA)，在细胞质核酸酶Dicer的作用下可将长双链RNA降解为21-23bp的小分子干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，这些小分子RNAs结合其他元件形成“RNA诱导沉默复合物”(RNA-induced silencing complexes，RISCs)，并引导RISCs 结合到与之互补的mRNA序列上，降解对应的mRNA，从而导致对应蛋白质水平下降，最终导致目标基因表达沉默(见下图：线路1，蓝色)。
对于哺乳动物细胞来说，导入30bp 以上的长双链RNA(dsRNA)往往会诱发非预期的抗病毒应答反应，此路不通。
所以常见的做法是直接制备19-23bp 左右的siRNAs ，将siRNAs 转入哺乳动物细胞(线路2，红色)；或者是将短发夹结构RNA(short hairpin RNAs ，shRNAs)的DNA 表达载体转入细胞，表达产生shRNA ，经过Dicer 切割后得到siRNA(线路3，黄色)；最后siRNAs 同样和其他元件组合成为RNA 诱导的沉默复合物RISCs ，在siRNA 指引下识别对应的mRNA 序列并降解mRNA ，从而使特定基因表达沉默。
线路1和2均为诱发瞬时基因沉默，持续时间约3－7天，根据目标基因而异，shRNA 表达载体则可以建立长效基因沉默的细胞株，进行功能缺失基因组筛选研究，也可用于体内RNAi 研究。
市面上提供RNAi 试剂的厂家越来越多，产品也格外丰富，如何选择呢？生物通参照这3条主要的RNAi 实验线路的每个步骤，分别汇集介绍市售好用的相关产品，方便大家实验时作为选择的参考。
2. 适合的将dsRNA 递送进入细胞的方法
一旦拿到siRNAs 或者dsRNA ，还需要一种将双链RNA 传递到细胞里的方法。
传递的方法因细胞种类不同而异。
对于线虫之类的低等动物活体进行体内RNAi 实验，多见以喂饲或者浸泡方法将dsRNA 导入体内。
体外培养细胞，多数的贴壁细胞可以用脂质体或者多胺类试剂来进行有效的转染；对于原代细胞或者悬浮细胞，如果常规转染方法不行，可以用电转，甚至显微注射等，或者通过病毒载体感染等方法进行，病毒载体还可以作为哺乳动物体内RNAi 实验的手段。
3 设置适当的参照
生物通RNAi 实验特别ebioTips1：
设置好参照：适当的参照对于每个实
验来说都是关键的，必须的，非常重要的。
RNAi 实验也不例外。
缺少适当的参照，RNAi 实验的结果就无从分析。
未转染细胞对照：不加转染试剂的空
白对照，用于排除转染试剂对细胞活力的影响（这个可以在摸转染条件时先做）
空白对照：只加转染试剂(如果实验用
到载体则可做一组空载体对照)，用于排除siRNA 转染对细胞活力的影响
负对照：设置不针对目标细胞内源任
何基因的siRNA 对照，用以排除转染siRNA 对基因表达可能造成的任何非特异影响。
正对照：设置针对易于检测的参照基
因的siRNAs ，用于确证siRNAs 的递送、转染以及反应条件环境是可行的。
也有建议选择和目标基因同一信号通路的另一个基因作为参照，便于排除脱靶等副反应，以及进一步确认目标基因的功能。
好的实验设计应该选择至少2个以上
针对同一目标基因的有效siRNAs 同时平行做实验，以相互验证实验结果确实是由于目标基因沉默而引起的，并非个别siRNA 的特异现象。
可选：荧光标记的siRNAs 对照便于
检测siRNA 递送效果
4. 检测目标基因表达情况的方法
RNAi 实验使得特定细胞中的目标基因在mRNA 水平上降解从而导致表达沉默，相当于暂时“敲除”目标基因，通过研究目标基因缺失的情况下细胞发生的变化，因而得以研究目标基因在细胞中的功能。
目标基因不同，可以采用的检测目标基因表达状况的方法也千
差万别。
在各种检测方法之前，你首先要确认目标基因的mRNA 确实被siRNA 介导降解了。
由于siRNA 作用在mRNA 水平上，所以最常用的检测方法之一是通过实时定量qRT-PCR 来检测目标基因的mRNA 水平，比较实验组和负对照组（用非特异的参照siRNA 平行实验）的差别。
生物通ebioTips2: 在做实时荧光定量RT-PCR 实验时注意选择Primer 针对的区域是siRNA 对应的同一区域，以免存在不同的mRNA 剪接形式影响对结果的判断。
通常Taqman 探针法优于SYBR Green 法，因为TaqMan 探针法可以检测同一样本中2个以上不同的mRNA 水平，便于在检测目标基因的同时检测参照。
由于蛋白质才是最终行使功能的载体，除了在mRNA 水平上检测目标基因的mRNA 是否下降，严谨的研究人员还会在蛋白表达水平上检测目标基因表达产物水平的下降幅度，也就是基因“沉默”的程度。
Western Blot ，免疫荧光等方法都是常用的方法。
siRNA/dsRNA 递送到细胞内后，应该什么时候做qRT-PCR 检测，什么时候做蛋白检测呢？转染8-48小时后就可以检测到mRNA 水平的逐步下降，转染48小时后检测mRNA 含量通常会得到相对漂亮的结果；48-72小时后可以检测到蛋白质表达的下降。
因为siRNAs 的沉默效果是有时效性的，探讨最佳的基因沉默效果落在哪个时间点上，就需要多个时间点进行检测，可以得到siRNA 的量、mRNA 的量、蛋白的量之间的关系，需要花费更多的功夫。
瞬时RNAi 而诱导的基因沉默 通常可延续3－7天，视目标蛋白在生命中的周期而不同。
而shRNA 表达载体则可以借助选择压力或者整合等方式，长时间持续沉默目标基因的表达。
确认目标基因沉默，产物表达下降后，在此基础上研究人员就可以分析目标基因沉默对细胞功能和形态的影响，从而研究基因的功能。
如果是已知基因，可以用相应的功能检测试剂盒进行定量检测。
除了严谨全面的对照体系，特别严谨的实验还会设计Rescue 实验来排除假阳性：目标基因mRNA 序列对应siRNA 的位置引入点突变（不影响产物表达），使得siRNA 不能作用于这种外源设计的mRNA ，并引入RNAi 实验中看是否能回复由RNAi 引起的变化。
过表达目标基因、dominant negative expression ，或者刺激同一信号通路下游以观察是否能回复RNAi 引起的变化，都有助于验证RNAi 实验的严谨性。
不过这些方法如何调节调控以免引起新的问题，还有待研究。
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由于不断有文章指出高浓度的siRNA （超过100nM ）容易引发抗病毒相应，除了需要摸索条件选择siRNA 最低的有效用量来避免非预期反应，严谨的实验最好能检测细胞体系内的抗病毒反应----虽说芯片是检测全局的最佳方式，你并不一定需要如此高昂的代价——检测某些基因的变化可以提示是否出现抗病毒响应——如2'5' oligoadenylate synthetase, STAT1，RNase L 等。
好，了解RNAi 实验4大要素后，让我们沿着实验线路，一步一步了解RNAi 实验，以及如何选择所需用到的产品。