讲义2

第二章海洋生物调查第一节概述一、名词1、叶绿素定义：是自养植物细胞中一类很重要的色素，是植物进行光合作用时吸收和传递光能的主要物质。

▪叶绿素a是其中的主要色素。

▪Chla表示海水中的叶绿素量。

2、初级生产力定义：自养生物通过光合作用生产有机物的能力。

通常以单位时间（年或天）内单位面积（或体积）中所产生的有机物（一般以有机碳表示）的重量来计算，相当于该时间内相同面积（或体积）中的初级生产量。

3、微生物定义：一群个体微小、结构简单、生理类型多样的单细胞或多细胞的低等生物，包括属于原核生物类的细菌、放线菌、支原体、立克次体、衣原体和蓝细菌，属于真核生物类的真菌（酵母菌和霉菌）、原生动物和显微藻类，以及属于非细胞类的病毒、类病毒和朊病毒。

4、浮游生物定义：缺乏发达的运动器官，没有或仅有微弱的运动能力，悬浮在水层中，常随水流移动的生物。

包括：浮游植物浮游动物按浮游生物的个体大小可分为⑴微微型（picoplankton）：＜2 µm 细菌⑵微型（nanoplankton）：2~20 µm 金藻⑶小型（microplankton）：20~200 µm 硅藻⑷中型（mesoplankton）：0.2~2 mm 小型桡足类⑸大型（macroplankton）：2~20 mm 大型桡足类⑹巨型（megaplankton）：＞20 mm 海蜇此外，鱼类浮游生物即为鱼卵和仔稚鱼。

5、底栖生物定义：栖息在水域基底表面或底内的生物。

在海洋中，这类生物自潮间带至水深大于万米以上的超深渊带（深海沟底部）都有分布，使海洋生物中种类最多的一个生态类型，包括大多数海洋动物门类、大型和微型定生海藻类和海洋种子植物。

6、潮间带生物定义：生活在潮间带底表的植物和底表与底内的动物。

7、污损生物定义：生长在船底、浮标、平台和海中一切其他设施表面或内部的生物。

这类生物一般是有害的。

8、游泳动物定义：具有发达的运动器官，在水层中能克服水流阻力自由游动的动物。

如：鱼类、大型虾、蟹类、头足类及海洋哺乳动物等。

二、调查内容、方式和采样深度1、海洋生物调查内容叶绿素、初级生产力和新生产力，微生物、微微型、微型和小型浮游生物，鱼类浮游生物，大型底栖生物，小型底栖生物，潮间带生物，污损生物和游泳生物。

必要时，渔业资源声学调查与评估。

辅助参数：海洋调查时，应视需要确定与其有关的辅助参数，并同步进行观测。

2、调查方式▪大面观测▪断面观测▪连续观测3、采水样（1）适用于叶绿素浓度、初级生产力和新生产力，微生物，微微型、微型和小型浮游生物等调查项目的水样采集。

（2）拖网采样适用于大、中型浮游生物、鱼类浮游生物、大型底栖生物、游泳动物调查和渔业资源声学调查与评估等项目的采样。

（3）底质采样适用于微生物、潮间带生物和大、小型底栖生物调查项目的采样。

（4）挂板和水面或水中设施上采样适用于污损生物调查的采样。

4、调查时间、调查次数和边缘海调查调查时间和调查次数应根据调查水域环境条件和调查目的确定。

（1）河口、港湾、沿岸海区和边缘海调查受气象、流系的季节性影响显著的边缘海应每季度调查一次；受气候、水文的季节性影响明显且物质来源复杂的河口、港湾和沿岸海区，通常应每月（至少每季度）调查一次（潮间带生物每年调查2次-4次）；如有特殊需要可酌情调整调查次数。

若进行逐月和逐季调查，各季或各月调查的时间间隔应基本相等。

进行河口、港湾调查时，应充分考虑潮汐的影响。

一般以3-5月为春季，6-8月为夏季，9-11月为秋季，12月-2月为冬季，并分别以5月、8月、11月、2月代表春季、夏季、秋季和冬季。

但热带海域应根据具体的海洋环境条件和调查目的酌情调整调查时间和调查目的。

（2）大洋和极地海域调查应根据调查目的，选择调查时间，确定调查次数。

第二节叶绿素和初级生产力测定一、叶绿素a的测定（一）荧光分光光度法1、方法原理叶绿素a的丙酮萃取液受蓝光激发产生红色荧光，过滤一定体积海水所得的浮游植物用90%丙酮提取其色素，适用荧光计测定提取液酸化前后的荧光值，计算出海水叶绿素a的浓度。

2、试剂配制（1）丙酮溶液：9+l量取900mL丙酮于1OOOmL的量筒中，加水至标线。

保存在棕色试剂瓶中。

（2）碳酸镁悬浮液：1Og/L称取1g碳酸镁，加水至100mL，搅匀，盛试剂瓶中待用，用时需再摇匀。

（3）盐酸溶液：5+95在搅拌下，将5mL盐酸缓慢地加到95mL水中，混匀，保存于滴瓶中。

3、仪器设备•荧光计；•冰箱；•离心机：4000r/min•电动吸引器•过滤装置•玻璃纤维滤膜（WhatmanGF/C, 25mm）或0.45um的纤维素醋微孔滤膜•离心管：具塞，10mL，若干；•干燥器：1个•棕色试剂瓶：100,1000mL各1个•量筒：100,200,1000mL各1个•定量加液器：10mL,1个•滴瓶：l00mL,1个•镊子:2把•一般实验室常用设备4、分析步骤①样品制备②样品的提取③样品的离心④样品测定⑤仪器校正（1）样品制备量取一定体积海水（通常大洋水250-500mL，近岸或港湾水50-250mL)，加2mL碳酸镁悬浮液，混匀，用滤膜过滤，过滤负压不得超过50kPa。

（2）样品的提取将带有样品的滤膜放人具塞离心管，加人丙酮溶液10mL，摇荡，放置冰箱贮存室中14-24h，提取叶绿素a。

若滤得的样品不能及时提取，应将该滤膜抽干、对折，再套上一张滤纸，置于含硅胶的干燥器内，贮存在低于1℃冰箱中。

（3）样品的离心•离心速度：3000-4000r/min。

•离心时间：10min。

（4）样品测定荧光计激发波长为436nm，发射波长670nm。

①零点调节：用丙酮溶液调节，使荧光计指针指零。

②将提取的上层提取液注入测定池。

③选择相应量程，测定样品的荧光值Rb。

④加2滴盐酸溶液至测定池，摇匀，经30s后再测其荧光值Ra。

（5）仪器校正用分光光度计校正取一定体积正处于指数生长期的单细胞藻类培养液，依上述方法提取其叶绿素a，用分光光度法测定、计算该提取液的叶绿素a浓度。

将它稀释至荧光计可测范围的浓度，用荧光计最低灵敏度量程测定此稀释液酸化前后的荧光值，依式（7),(8)计算该量程的换算因子和酸化因子。

5、记录与计算（二）分光光度法1、方法原理以丙酮溶液提取浮游植物色素，依次在664,647,630nm下测定吸光度，按Jeffrey-Humphrey的方程式计算，可分别得出叶绿素a，b，c的含量。

2、试剂配制（1）丙酮溶液：9+l量取900mL丙酮于1OOOmL的量筒中，加水至标线。

保存在棕色试剂瓶中。

（2）碳酸镁悬浮液：1Og/L称取1g碳酸镁，加水至100mL，搅匀，盛试剂瓶中待用，用时需再摇匀。

3、仪器设备•分光光度计：波带宽度应小于3nm，吸光值可读到0.001单位。

附3-10cm测定池。

•玻璃纤维滤膜（WhatmanGF/C, 47mm）或0.45um的纤维素酯微孔滤膜。

•离心管：具塞，10或15mL，若干。

•所需其他设备类同荧光光度法。

4、测定步骤（1）样品制备量取2-5L海水样品，加入3mL碳酸镁悬浮液,混匀，用滤膜过滤，过滤负压不得超过50kPa。

（2）样品的提取将带有样品的滤膜放人具塞离心管，加丙酮溶液10mL，摇荡，放置冰箱贮存室中14-24 h，提取叶绿素a。

若滤得样品不能及时提取，应将该滤膜抽干、对折，再套上一张滤张，置于含硅胶的干燥器内，贮存在低于1℃的冰箱中。

（3）样品的离心•离心速度：3000-4000r/min。

•离心时间：10min。

（4）样品测定小心将离心的上清液注入测定池。

用丙酮溶液作参比，分别在750,664,647,630nm波长处测定吸光值。

其中，750nm处的测定，用以校正提取液的浊度，当测定池1cm光程的吸光值超过0.005时，提取液应重新离心。

5、记录与计算（三）高效液相色谱（HPLC）法方法原理：浮游植物所含各种光合色素经提取后，在一定溶剂系统中，可经高效液相色谱柱进行分离，再由检测器进行检测并获得色谱图。

根据与标准色素比较保留时间及色谱图可鉴别色素种类，根据色谱峰的面积可计算含量。

二、初级生产力测定方法原理：取一定数量的H14CO3-加入到已知二氧化碳总浓度的海水样品中，在模拟现场海水温度和光照的情况下，经过一段时间的培养，测定浮游植物中固定有机14C的量，求出现场初级生产力的值。

1、采样层次按光学深度，在光强分别为表层的100%，50%，30%，10%，5%和1%的深度上采集水样，特殊情况时可减少采样层次。

2、采样与培养在预定深度采样后，尽快在弱光下将水样用孔径为180um左右的筛绢将水样过滤，并分装到相应层次的培养瓶中，每层样品设2个白瓶和1个黑瓶，第一层和第四层样品还应各分装一个零时间培养瓶（或根据现场调查情况选定）。

在每个培养瓶中加入相同体积的14C 工作液，在模拟设定的现场温度和光照条件下培养一定的时间（零培养瓶除外）。

3、过滤与储存培养结束后用滤膜将样品中的浮游植物过滤得滤膜上，在通风橱中将样品滤膜用浓硫酸蒸汽薰蒸15min，放入闪烁瓶中，密封保存。

4、测定用液体闪烁计数仪进行放射性活性的测定，并计算海水样品中的初级生产力。

第三节微生物调查一、粪大肠菌群检测（一）发酵法1、方法原理大肠菌群系一群在37℃或44℃生长时能使乳糖发酵、在24h内产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌。

大肠菌群数系指每升水样中所含有的“大肠菌群”的数目。

一般在37℃培养生长的称为“总大肠菌群”，在44℃培养生长的称为“粪大肠菌群”。

海水检验采用44℃培养法，以检出粪大肠菌群。

发酵法系通过初发酵及复发酵二个步骤，以证实海水水样中是否存在粪大肠菌群并测定其数目。

2、试剂及培养基配制（1）溴甲酚紫乙醇溶液：称取1.6g 的溴甲酚紫溶于2-3mL乙醇中，然后用蒸馏水定容到100mL。

（2）碳酸钠溶液：称取10.6g碳酸钠溶于蒸馏水，并定容到100mL。

（3）乳糖蛋白栋培养液成分：制法•将规定量的蛋白脉、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，用碳酸钠溶液调节pH为7.2-7.4。

•加人1mL溴甲酚紫乙醇溶液，混匀，分装于置有倒管的试管内（10mL左右）。

置高压蒸气灭菌器中，于115 ℃(68.95kPa）灭菌20min。

•根据需要，可按上述配方将蒸馏水由l000mL减为333mL，制成浓缩三倍的乳糖蛋白陈培养液备用。

（4）EC培养基成分：制法将上述成分加热溶解，分装于内装倒管的试管中。

灭菌后pH值应为6.9。

此培养基用前不宜置冰箱，以防检测时出现假阳性。

3、仪器设备•恒温培养箱：37℃士1℃及44℃士0.5 ℃•干热灭菌箱•高压蒸气灭菌器•接种环•吸量管：1,10mL•试管：15mm×150mm,18mm×180mm;•发酵倒管：5mm×30mm;•纱布及棉花（塞试管用）•脱脂棉或白绒布：过滤培养基用•锥形瓶：500mL•采水样瓶：500mL广口瓶•接种箱：（折叠式）4、样品采集（1）采样瓶•用于细菌检查的采样瓶，宜用可耐灭菌处理的广口玻璃瓶或无毒的塑料瓶。