细胞生物学实验指导讲义(完整)
细胞生物学实验讲义
细胞内DNA和RNA的显示一、目的要求1、掌握显示细胞内DNA和RNA的方法。
2、熟悉细胞内DNA和RNA的分布位置。
二、实验原理核酸是酸性的，它们对于碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力。
利用这两种染料的混合液处理细胞，可使其中的DNA和RNA呈现出不同的颜色，这种颜色上的差异由DNA 和RNA聚合程度的不同所引起，因为甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它与聚合程度较高的DNA分子有较强的亲和力，可使DNA分子染成蓝绿色；而派洛宁分子中仅一个正电荷，可与低聚分子RNA相结合使其染成红色。
这样细胞中的DNA和RNA可被区别开来。
三、器材与试剂1、器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、注射器。
2、材料：鸡血。
3、试剂：0.2mol/L醋酸缓冲溶液、2%甲基绿染液、1%派洛宁染液、甲基绿·派洛宁混合染液。
4、试剂的配制（1）2mol/L醋酸缓冲溶液：用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中，混匀。
再称取醋酸钠（NaAC·3H2O）2.72g溶于100ml蒸馏水中，使用时按2：3的比例混合两液即成。
（2）2%甲基绿染液：称取2.0g去杂质甲基绿溶于100ml0.2mol/L的醋酸缓冲溶液中即成。
甲基绿粉中往往混有影响染色效果的甲基紫，它们必须预先除去，其方法是将甲基绿溶于蒸馏水中，放在分液漏斗中加入足量的氯仿（三氯甲烷）用力振荡，然后静置，弃去含甲基紫的氯仿，再加入氯仿重复数次，直至氯仿中无甲基紫为止，最后放入40 C温箱中干燥后备用。
（3）1%派洛宁染液：称取1g派洛宁（吡罗红）溶于100ml0.2/L醋酸缓冲溶液中混匀。
（4）甲基绿派洛宁混合染液：将2%的甲基绿液和1%的派洛宁液以5：2的比例混合均匀即可。
该液应现配现用，不宜久置。
四、内容与方法1、取鸡血一小滴在干净的载玻片一端，用另一载玻片的一端紧贴血滴，待血液沿其边缘展开后，以30~400角向玻片的另一端推去，制成较薄的血涂片，室温下晾干。
细胞生物学讲义
细胞生物学实验室规则与操作要求为获得较好的实验结果，避免发生差错与意外事故，特制定以下规则与要求，希望实验者能严格遵守。
（一）显微镜的使用及保护①显微镜是细胞生物学实验的主要观察工具，使用时必须注意保持外观整洁、防湿、防高温、防药品侵蚀，使用时勿使染液或其它溶液沾污镜头，一旦沾污，及时用擦镜纸蘸上镜头清洗液（无水乙醚：无水乙醇＝7：3）轻轻擦拭干净。
②带光源的显微镜待电压稳定后，将电源的光亮度调节器调至最小，再打开显微镜的电源，缓慢调节光亮度适当进行量度观察，观察完毕后，则先将光亮度调节器调至最小，然后再关闭显微镜电源开关。
③镜头的清洗：实验完毕后，镜头的清洗很重要。
用擦镜纸蘸取少量镜头清洗液，先从镜头的中央开始清洗，轻轻旋转擦至镜头的边缘部分，如此重复2－3次。
④载物台必须保持清洁，必要时亦可用擦镜纸蘸少量清洗液擦试载物台。
聚光器上的污物的去除亦可采用类似的方法。
⑤使用完毕后，玻片一律取下，套上布袋.放回原处。
本桌的显微镜一律不准搬离本实验桌。
若需使用者，可到该桌使用，使用后务必保持该显微镜的清洁。
如若发现违章使用情况，必追究使用者责任，本次实验作零分计。
（二）实验时，实验室内，一律不准高声喧哗整洁，保持室内安静，认真操作，仔细做好各项观察与记录。
（三）实验室内的一切仪器、物品必须爱护。
节约材料、药品，取用时不要过量。
公用物品不得独自占用，用后归还原处。
（四）注意安全。
使用有毒物品、强酸、强碱等，应严格按照操作规程。
易燃物品远离火源。
禁止湿手拿取电源开关或接触电源。
如发生触电等事故，及时报告。
（五）取用各种试剂，要用及时盖上瓶盖。
按献宝取出所需之药品或溶液后，不得将原液倒回瓶内。
滴管、玻棒、吸管不可混用。
（六）实验中如有丢失、损坏仪器设备及用具，及时登记并报告，凡违反操作规程造成不应有的损失者，视其情节轻重，态度好坏，按有关规定处理。
（七）本实验室欢迎各位实验者对每一实验本身提出新的看法与做法，至于能否采用，视具体情况而定。
本科《细胞生物学实验》讲义
（3）载物台：戴物台为方形（多数）和圆形的平台，中央有一光孔，孔的两侧各装1个夹片，载物台上还有移动器（其上有刻度标尺），可纵向和横向移动，移动器的作用是夹住和移动标本用。
（4）镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活动式 （可改变倾斜度）两种。
（5）滤光片：自然光由各种波长的光组成，如只需某一波长的光线，可选用合适的滤光片，以提高分辨率，增加反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等颜色。根据标本颜色，在聚光器下加相应的滤光片。
图1.普通光学显微镜
五、实验步骤及内容
1．低倍镜的操作
（1）置显微镜于固定的桌上。窗外不宜有障碍视线之物。
2．高倍镜的操作
（1）使用高倍镜前，先用低倍镜观察，发现目的物后将它移到视野正中处。
（2）旋动转换器换高倍镜，如果高倍镜触及载玻片立即停止旋动，说明原来低倍镜就没有调准焦距，目的物并没有找到，要用低倍镜重调。如果调对了，换高倍镜时基本可以看到目的物。若有点模糊，用细调节器调就清晰可见。
3．油镜的操作
4．用铅笔分别绘出各种细菌的形态图。
六、数据整理
七、实验过程中应注意事项及心得
1.取、送显微镜时要轻拿轻放，一定要一手握住弯臂，另一手托住底座。显微镜不能倾斜，以免目镜从镜筒上端滑出。不可把显微镜放在实验台的边缘，以免碰翻落地。取拿显微镜罩子的时候也一定轻取，以免将目镜从镜筒上带出摔坏。
2.显微镜的光学部分只能用特殊的擦镜纸擦拭，切忌乱用他物擦拭，更不能用手触摸透镜，以免汗液玷污透镜。
实验一、光学显微镜的基本使用方法
一、实验目的
1. 了解光学显微镜的结构、原理和保养方法；
细胞生物学实验指导
《细胞生物学实验》指导一、实验课名称：细胞生物学实验Experiment of Cell Biology二、实验课性质：独立设课三、适用专业：生物技术和水产养殖四、采用教材及参考书：教材：安利国主编．细胞生物学实验教程．北京：科学出版社，2004参考书：1. 杨汉民主编．细胞生物学实验（第二版）．北京：高等教育出版社，1997.72. 徐承水，党本元主编．现代细胞生物学技术．青岛：青岛海洋大学出版社，19953. 王金发主编．细胞生物学实验教程．北京：科学出版社，2003五、学时学分：课程总学时：36；课程总学分：1七、实验课考核方式：1.实验课考核成绩确定：本课程考核成绩由平时成绩（占30%）、实验报告成绩（占30%）和终期考核成绩（占40%）三部分构成。
2.平时成绩确定：由任课教师根据实验操作、问题回答和出勤情况确定，按A（优）、B （良）、C（及格）、D（不及格）四个等级评分。
3.实验报告成绩：本课程要求学生实验报告应包括以下内容：①实验目的及原理：简明；②方法与步骤：具体操作步骤、注意事项等；③结果：详细每一步的结果以及计算方法和计算结果；④分析与讨论：根据所学知识对结果进行分析讨论，阐明所得结果说明了什么问题；如果结果与理论不符，应说明可能的原因。
实验报告成绩由任课教师根据学生实验报告写作是否符合规范要求、试验结果及分析的具体情况给出。
每次报告均按A（优）、B（良）、C（及格）、D（不及格）四个等级评分，实验报告成绩为各次报告成绩的平均值。
4.终期考核成绩：实验课结束后进行笔试、口试或现场操作考核，按A（优）、B（良）、C（及格）、D（不及格）四个等级评分。
实验项目实验一、显微镜的技术参数及特殊光镜的演示实验一、要求：了解普通光镜及各种特殊光镜的构造、成像原理及应用；掌握正确的使用方法；理解显微镜的技术参数和特殊光镜的结构特点；掌握实验报告的写法。
二、实验内容：普通光学显微镜的结构及技术参数：由光学和机械两大系统构成。
细胞生物学实验指导
细胞生物学实验指导实验一、显微镜的结构与使用方法一、实验目的1.认识显微镜的构造2.学会独立操作显微镜二、仪器和材料显微镜、擦镜纸、装片三、实验内容1.学生按编号把自己的显微镜取出，放在试验台上，在教师的指导下熟悉显微镜各部分的构造及用途，然后进行操作练习。
先用低倍镜进行对光联系，使视野明亮而均匀。
如果使用双筒目镜，还应学习目镜间距的调节。
在转换高倍物镜观察，此时应注意它的视野亮度与低倍物镜有无区别？并思考通过哪几种方法调节使得高倍物镜的视野达到要求的亮度。
2.取已制备好的装片进行观察：按低倍镜使用步骤和方法进行操作练习。
注意要使观察到的像向前移动时，玻片标本应向那个方向移动？欲使观察到的像向右移动时，拨片标本应向那个方向移动？3.观察制备好切片：细胞核、中心体、胞间连丝、有丝分裂、减数分裂、高尔基体等。
4.观察完毕后，按正规要求取下玻片，把显微镜收好。
四、作业绘制2-3中细胞结构实验二、Feulgen反应显示DNA（一）实验目的1．掌握临时制片法。
2．熟悉Feulgen反应的原理及操作步骤。
3．观察细胞中DNA的分布。
（二）实验原理Feulgen在1924年发明一种对DNA特异的组织化学染色反应，故称Feulgen反应。
DNA经酸（1mol/L HCl）水解后，DNA分子中的嘌呤和脱氧核糖连接的配糖键被打开，脱氧核糖的一端释放出醛基，并在原位与Schiff试剂反应形成特异性的紫红色产物。
该产物能特异地吸收峰值为550~570nm的光波。
并且在一定的浓度范围内，对550~570nm光波的吸收值与DNA 含量成正比关系，既符合化学计量学关系。
此法既可定位用于细胞或组织化学染色反应，观察DNA的分布，又可用显微分光光度计和图像分析仪对细胞或组织中DNA的含量进行定量分析。
紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。
对照组或采取不经盐酸处理，或预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应。
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程而损坏仪器设备及物品者要按有关规定赔偿。 6．在实验过程中仪器设备发生故障或损坏时，应首先切断电源，并立即报告任课教
师及时处理。 7．使用贵重仪器设备，一定要在老师的指导下操作，使用完毕，要进行登记。 8．实验中使用易燃、易爆、有毒试剂及传染性强的物品时，应严格操作，注意自我
的像再次放大，没有辨析能力。物镜一般有：4×、10×、 图1 显微镜的光路
40×和油镜(100×)，它们各有一定的放大率，不仅可以 放大标本，而且有辨析能力。
2.问：什么是光学显微镜？它的各部名称是什么？ 答：一般的普通光学显微镜如下图 2。它的各部名称如图 3 所示。镜座、镜柱、 镜臂、镜筒、物镜转换器(旋转器)、镜台(载物台)、调节器：粗调节器(粗螺 旋)和细调节器(细螺旋)、反光镜、集光器、显微镜目镜、显微镜物镜、开关、 光源等。
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上海大学生命科学学院
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实验须知
一、实验须知 1．每个学生必须遵守实验室规则。 2．实验时不准迟到、早退或无故缺席，有病或有事需向任课教师请假。 3．进入实验室后要保持安静，不得在室内喧哗、打闹；不得抽烟、吃东西、随地吐
痰、乱丢纸屑和其他杂物。 4．不得将与实验无关的物品带入实验室；不得将实验物品带出实验室；不允许在食
1.问：在细胞生物学实验中，为何要使用光学显微镜？ 答：（1）所要观察的对象细胞的个体很微小，绝大多数细胞， 直径一般为 10-100 微米（1 微米＝1 / 1000 毫米），动物 的细胞更小，一般只有 10 微米左右，而细菌只是一个细 胞，这种细胞比动物细胞还小。所以肉眼无法看到这些微 小的生命体。 （2）人眼所能看到的物体的大小和人眼与该物体的距离有 关。视力 1.0（即对数视力表 5.0）的眼睛的分辨率是 1'； 2.0 的眼晴的分辨率是 0.5'。这样你就可以算出在一定距 离下人眼所能看到的物体的最大长度是多少了。一般肉眼 的分辨距离在 0.2mm 左右。 （3）视角过小时需要借助放大镜、显微镜或望远镜等加以 放大，才能看清物体了。光学显微镜：0.2um （4）显微镜有目镜和物镜。目镜一般有：8×、10×、15 ×、16×等种不同的放大倍数的目镜。目镜只能把物镜成
《细胞生物学》实验指导书(不太全供参考).doc
《细胞生物学》实验指导书（不太全供参考）适用专业:生物科学、生物技术实验目录实验一植物原生质体的分离与融合•••]实验二动物细胞原代培养•••3实验三细胞传代培养…彳实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察••Y实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测“I实验六环境因素诱变染色体改组的观察实验七红细胞膜蛋白的分离及其电泳检测 (11)实验一植物原生质体的分离与融合实验项目类型:综合性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：7学时一、实验目的1.掌握原生质体分离的原理与技术；2.了解细胞融合的基本原理及应用；3.初步掌握PEG融合法和电融合法.二、实验原理植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞.原生质体可以从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官（叶等）获得.但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致.原生质体的分离通常采用酶解法，对细胞壁成分进行降解后获得.原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞相似.但原生质体由于除去了细胞壁,所以需要一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定.常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等. 其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响.2个或2个以上的细胞合并成为1个细胞的现象称为细胞融合.细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇(PEG)法和电融合3种方法，其原理基本相同，都是两细胞接触点的膜分子发生重组,然后由于表面张力作用,形成一个球形细胞. 原生质体分离融合和培养的意义：1.除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，为制造新杂种开辟了道路.植物原生质体融合和培养在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景.它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一.2.原生质体可摄入外源DNA,细胞器、细菌或病毒颗粒,这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础.3.获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料.三、实验仪器与材料1.材料:油菜叶子、白菜花2.溶液或试剂:(1)洗涤液:甘露醇0.7mol/L,CaC12 • 2H2O3.5mmol/L,KH2PO4 0.7mmol/L(pH 5.6),高压灭菌；(2)混合酶液:1.5%纤维素酶,1%果胶酶溶于洗涤液中(pH 5.6).(3)50%PEG(4)高pH高钙稀释液：(5)20%蔗糖溶液(6)DPD培养基：3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤(一)原生质体的制备：1.取材:取新鲜油菜叶和白菜花瓣自来水洗净，再用70%乙醇浸泡30S,0.5%次氯酸钠消毒lOmin,无菌水冲洗5次.2.酶解：材料切成1mm宽细丝，加入适量酶液，置摇床上(60〜70rpm),在25〜28°C黑暗条件下，酶解5〜7h.3.分离：用200目网过滤除去未完全消化的残渣，在lOOOrpm条件下离心5分钟,弃上清.加入3〜4ml洗涤液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液.用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20% 蔗糖溶液上(5ml离心管装3ml 20%蔗糖溶液)，在lOOOrpm条件下离心5-10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖与洗涤液之间，破碎的细胞残渣沉入管底.用200 u 1移液器轻轻将状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中，加4ml洗涤液,1000rpm离心2-5分钟, 弃上清.（二）原生质体融合：1.将原生质体用DPD调节浓度为1*105个/mL.2.将原生质体混合物滴入小培养皿，静置8〜10分钟.3.然后滴入50%的PEG溶液，静置2分钟.4.依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml高钙高pH洗涤液.注意在第二、三次洗液加入前,用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡;最后用液体培养基洗1〜2次.制片，镜检.五、实验报告画出观察到的融合细胞，并计算融合率.六、思考题1.你认为要获得数量多、生活力强的原生质体，在实验中应注意那些问题？增多数量的方法:多取材且尽量切碎，增加酶浓度，提高酶解温度，延长酶解时间，操作轻柔，勿使原生质体破碎等.提高生活力的方法:取新鲜材料,采用合适的酶浓度、作用温度和时间2.举例说明原生质体融合的应用价值.实验二动物细胞原代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：4学时一、实验目的1.掌握动物细胞原代培养的基本方法和操作过程；2.熟悉原代培养细胞观察方法.二、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养.原代培养是建立各种细胞系的第一步，该技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究.分为组织块培养法和消化法两种.三、实验仪器与材料1.材料:小鼠心、肝、脾、肾等2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、解剖器械、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.处死小鼠:将小鼠用颈椎脱臼法处死，放入75%酒精种浸泡消毒.2.取材:在超净工作台中用灭菌的解剖器械剖开小鼠腹腔，辨认并取下肝脏、脾脏和肾脏，放入灭菌的培养皿中，加入Hanks液清洗，然后加入2mL胰蛋白酶液,研磨并过滤.3.将液体转移到离心管,1200rpm离心5min收集细胞,加入适量培养液,C02培养箱培养.4.观察:逐日在倒置镜下观察细胞生长情况.五、实验报告画出细胞贴壁前和贴壁后的形态.六、思考题试述细胞原代培养成功的条件？实验三细胞传代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的1.熟练掌握贴壁细胞传代的培养方法；2.观察传代细胞贴壁、生长、繁殖过程中细胞形态的变化.二、实验原理离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养,细胞将逐渐衰老死亡.传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其它比率转移，接种到另一培养瓶的培养.贴壁培养细胞的传代通常采用胰蛋白酶消化,把细胞分散成单细胞再传代.三、实验仪器与材料1.材料:原代培养的小鼠细胞或Hela细胞2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出,在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液.(以液面盖住细胞为宜)，静置5~10分钟.2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆,相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3〜5ml新鲜培养液,吹打, 制成细胞悬液.3.将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml 左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养.五、实验报告分别画出贴壁生长的小鼠细胞和Hela细胞,并说明二者的不同.六、思考题写出细胞传代培养成功的条件？实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的了解细胞骨架的结构特征及其制备技术二、实验原理细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维.它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用.用适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可将细胞质膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色或间接免疫荧光标记以后，可在显微镜下观察到细胞骨架结构.三、实验仪器与材料1.材料:洋葱鳞茎和口腔上皮细胞2.溶液或试剂：(1)M-缓冲液(2)6mmol/L(pH 6.8)磷酸缓冲液(3)l%Triton X-100(用M-缓冲液配制)(4)0.2%考马斯亮蓝R250(5)3%戊二醛3.仪器或其他用具:光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镶子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸等.四、实验步骤1.撕取洋葱鳞叶内表皮若干片,大小约lcm2,置于青霉素小瓶或小烧杯中.2.用磷酸缓冲液(PBS)浸泡片刻.3.吸去磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20分钟抽提细胞骨架以外的蛋白质,从而使骨架图像更加清晰.4.吸去TritonX-100,用M-缓冲液洗3次，每次3分钟.M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用.5.用3%戊二醛固定15-20分钟6.用PBS洗3次，每次3分钟7.考马斯亮蓝染色15分钟8.蒸馅水洗2次9.置于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察.五、实验报告绘出植物细胞骨架微丝结构图.六、思考题说出各步骤的目的和一些重要试剂的在此处的作用.实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测实验项目类型:创新设计性实验所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：9学时一、实验目的1.了解细胞凋亡的概念和原理;2.掌握细胞凋亡诱导的方法;3.认识细胞凋亡的特征.二、实验原理人体内的细胞注定是要死亡的，目前人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡.坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程.表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢,DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应.凋亡是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为.其细胞及组织的变化与坏死明显不同.细胞凋亡的形态学变化: 首先细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后胞质密度增加, 核质浓缩，核膜核仁破碎,DNA降解,胞膜形成小泡，最终为为几个凋亡小体，无内容物外溢,因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬.凋亡细胞DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果,该酶在核小体连接部位切断染色体DNA,这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱,而坏死呈弥漫的连续图谱.三、实验仪器与材料1.鸡血细胞2.溶液或试剂：生理盐水,20mmol/LCaC12顺伯，姬姆萨染色剂，Tris.HCl,SDS, EDTA,乙醇，甲醇，蛋白酶K.3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤（一）细胞凋亡的诱导：1.采鸡血10ml,加0.85%的生理盐水混匀,1200r/min离心5min,弃上清液（重复三次），制备红细胞悬液，然后加入50ml血细胞保存液混匀放于4°C冰箱中备用.2.取4个试管，各加入鸡血细胞保存液2ml,在1号管中加入2ml生理盐水作为阴性对照,2号试管加入2ml 10ug/ml的顺伯溶液作为阳性对照;3号试管中加入2ml 20mmol/L的CaC12溶液进行胁迫处理;4号试管不加任何物质，实验时煮沸5 min使细胞坏死.（二）细胞凋亡的形态学观察：1.处理4h取样，用生理盐水稀释5倍，各取50ul细胞悬液均匀涂布于5 片载玻片上,晾干.2.用甲醇固定2min,然后在载玻片上滴加适量姬姆萨染液染色lOmin.3.用蒸馅水轻轻洗去染液，室温晾干，在光学显微镜下观察细胞形态变化.4.照相，并对试验组细胞进行凋亡计数统计.（三）DNA梯状条带的检测：1.离心收集鸡血细胞，弃上清.2.加入1ml的细胞裂解缓冲液重悬，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20 n 1,混匀.3.在65°C恒温水浴锅中水浴30min（也可转入37°C水浴12〜24h）,间歇振荡离心管数次.4.于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中.5.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul吸头挑出, 或12,000转/分离心5分钟，弃上清,晾干.6.用50ulTE 缓冲液(pH8.0)溶解沉淀,并加入RNase A(10ug/ul)5ul,于37 °C 保温10〜15分钟.7.1.2 %琼脂糖凝胶,75 V电压，电泳45 min左右，8.紫外灯下观察并照相.(琼脂糖凝胶电泳:称取 1.2克琼脂糖加入100ml1*TBE),加热使之溶解，取一个凝胶模子，两端用胶布封好，水平放置.将制孔器(即梳子)放在模子一侧约0.5cm处，其底部距模子约1mm.待琼脂冷至约70°C时，加入10ul 0.5mg/ml EB,混匀，倒入模子，待冷却凝固后，取下梳子，撕去两端胶布,放入电泳槽中，使有加样孔的一端放在负极一端.在电泳槽中加入1*TBE至超过凝胶表面约1mm.加入DNA 电泳样:1.5ul DNA 。
细胞生物学讲义概论
细胞生物学讲义概论细胞生物学是研究细胞的结构、功能和相互关系的学科，是现代生命科学的基础和核心。
它从分子水平到系统水平探究细胞的内部组成、外部相互作用以及生物体的发育、遗传和适应能力等方面的问题，涉及到细胞的形态学、生化学、遗传学、生理学等多个领域。
本讲义旨在介绍细胞生物学的基本概念和原理，以及细胞的结构、功能和相互关系等内容。
一、细胞的定义和分类1.细胞的定义：细胞是生物体的基本结构和功能单位，是由细胞膜包围的原核或真核质量，内含细胞器，并能进行代谢和遗传。
2.细胞的分类：根据细胞核的有无，将细胞分为原核细胞和真核细胞两大类。
原核细胞是没有真核膜包围的细胞核，如细菌和蓝细菌；真核细胞是有真核膜包围的细胞核，如动植物等真核生物。
二、细胞的结构和功能1.细胞的结构：细胞包括细胞膜、细胞质、细胞核、细胞器等结构。
细胞膜是细胞的外界界面，细胞质是细胞内质量，细胞核是细胞的遗传中心，细胞器是细胞内特定功能的结构。
2.细胞的功能：细胞能进行物质运输、能量代谢、遗传信息的传递和表达等多种功能。
其中，细胞膜起着物质进出细胞的调节作用；线粒体是细胞的能量中心，负责产生细胞所需的能量；细胞核负责细胞的遗传信息的储存和传递。
三、细胞的相互关系2.细胞的组织和器官：相同类型的细胞可以组织成组织，不同类型的组织可以组合形成器官，不同器官之间可以组成一个完整的生物体。
四、细胞的繁殖和分化1.细胞的繁殖：细胞能够通过有丝分裂和无丝分裂两种方式进行繁殖。
有丝分裂是指细胞对核和细胞质进行同步复制，然后进行分裂；无丝分裂则是细胞直接进行分裂，没有核和细胞质的复制过程。
2.细胞的分化：细胞分化是指细胞通过表达不同基因，进而形成不同的形态和功能。
细胞的分化过程是由基因表达调控网络控制的，而细胞分化后会形成不同功能的细胞类型，如肌肉细胞、神经细胞等。
细胞生物学是生命科学的基石，对于我们了解生命的本质、解读疾病机制和开发新药都具有重要意义。
细胞生物学实验讲义
植物组织培养一、实验目的1、掌握植物细胞无菌培养技术。
2、了解不同激素对细胞的不同诱导作用。
二、实验原理植物组织培养是20世纪60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。
它是借用无菌操作方法，培养植物的离体器官，组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整的再生植株。
植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也已显示了广阔的应用前景。
组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒，花药培养与单倍体育种，幼胚培养与试管受精，抗体突变体的筛选于体细胞无体系变异，悬浮细胞培养与次生物质生产以及超低温种质保存等方面的深入研究与实际应用，都必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法，深刻理解植物细胞的全能性。
三、实验用品1、材料半夏无菌苗。
2、仪器卧式灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱或培养室。
3、用具镊子、刀、牛皮纸、marker笔、棉线。
4、器皿试剂瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培养皿(直径9～11cm)。
5、药品与试剂1).药品(见下表)2).70％酒精四、实验方法1、培养基的配制配制培养基前先要配制母液。
母液分大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四类。
(各类成分浓度、用量详见下表)。
表1 MS培养基母液配制(单位：mg)1).大量元素母液(10倍液)分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的(60～80℃)蒸馏水中。
一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水定容至1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用。
2).微量元素母液(100倍液)分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定容至1000ml。
3).铁盐母液(100倍液)称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO4·7H2O溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。
细胞生物学实验讲义
细胞生物学实验一细胞分裂相的观察（综合性，3学时，生技、生工专业必修）一、实验目的1.掌握减数分裂标本的制备方法；2.掌握生殖细胞减数分裂发生过程及各个时期的染色体和细胞变化特点；3.了解植物生殖细胞的形成过程。
二、实验原理减数分裂是生殖细胞发生的一种特殊细胞分裂方式，特点是染色体复制一次，细胞分裂两次，形成4个子细胞，每个子细胞染色体数目减半。
经过受精作用后，染色体数目恢复，这样在物种延续过程中保证了遗传的相对稳定性和基因的多样性。
三、实验仪器、材料和试剂1.仪器、用具：眼科镊子、解剖针、刀片、吸水纸、显微镜、载玻片、盖玻片；2.材料：普通小麦(Triticum aestivum，2n=2x=42)或黑麦（Secale cereale，2n=2x=14）、大麦(Hordeum sativum，2n=2x=14)的幼穗（旗叶叶枕与幼穗顶部距离3～5cm，穗长约6～8cm）；或大葱（Allium fistolosum，2n=2x=16）花序（外包绿色总苞者，长2～3cm）；或玉米(Zea mays，2n=2x=20)幼穗（雄穗）。
3.试剂：苯酚品红、醋酸洋红。
注：以下染色剂的配制① 1％醋酸洋红（aceto carmine）：酸性染料，适用于压碎涂抹制片，能使染色体染成深红色，细胞质成浅红色。
配方：洋红1g ； 45％醋酸100ml。
煮沸2h左右，并随时注意补充加入蒸馏水到原含量，然后冷却过滤，加入4％铁明矾溶液1～2滴（不能多加，否则会发生沉淀），放入棕色瓶中备用。
②改良苯芬品红染色液（Carbol fuchsine）核染色剂。
配制步骤：先配成三种原液，再配成染色液。
原液A：3g碱性品红溶于100ml 70％酒精中。
原液B：取原A液10ml加入到90ml 5％石炭酸水溶液中。
原液C：取原B液 55ml，加入6ml冰醋酸和6ml福尔马林（38％的甲醛）。
（原液A和原液C可长期保存，原液B限两周内使用）染色液：取C液10～20ml，加45％冰醋酸80～90ml，再加山梨醇1～1.8g，配成10％～20％浓度的石炭酸品红液，放臵两周后使用，效果显著（若立即用，则着色能力差）。
细胞生物学实验讲义
《细胞生物学》实验指导目录实验一细胞大小测定和生物绘图法（验证性）2实验二细胞中过氧化物酶的显示（验证性）2实验三细胞内糖类的显示（验证性）2实验四细胞Feulgen反应（验证性）2实验五动物细胞培养（综合性）4实验六细胞膜通透性的观察和细胞活力测定（创新性）4实验一细胞大小测定和生物绘图法一、实验目的1. 掌握用测微尺测定细胞大小的原理和方法。
2. 掌握生物绘图的基本方法。
二、实验原理（一）测微尺的原理测微尺分物镜测微尺（简称物微尺或台微尺）和目镜测微尺（简称目微尺），两尺配合使用，可以测量细胞大小。
目微尺是一个可以放在目镜内的特制玻璃圆片，圆片中央刻有一条直线，此线分为若干格。
物微尺为一载玻片中央封固的小尺，长1mm，被等分为100格，长为0.01mm（10um）。
当测量细胞大小时，不能用物微尺直接测量细胞，而只能使用目微尺。
因目微尺测量的细胞是经物镜放大后的像，而它每格所代表的实际长度随物镜的放大率而变，在测量时需要先用物微尺来测定，求出某一放大率时目微尺每格所代表的实际长度，然后再用以测定细胞大小。
将物微尺放在显微镜的载物台上，小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处，记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数），按下式计算，在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度：物测微尺格数目微尺每格所代表的实际长度= ×10um目测微尺格数例如：目微尺是100倍，其对应的物微尺使80格，则目微尺每格所代表的实际长度为80/100=8um。
测量某一细胞时，如果目微尺测得其横径为5倍，则此细胞横径为8×5=40um。
（二）生物绘图的基本要求1. 具有高度的科学性，不得有科学性错误。
形态结构要准确，比例要正确，要求真实感，立体感，精美而美观。
2. 图面要力求整洁，铅笔要保持尖锐，尽量少用橡皮。
3. 绘图大小要适宜，位置略偏左，右边留着注图。
4. 绘图的线条要光滑、匀称，点点要大小一致。
细胞生物学重点讲义
《细胞生物学》重点讲义第1章—绪论1、概念：细胞生物学2、9世纪自然科学的“三大发现”：细胞学说、能量转化与守恒定律、达尔文进化论第2章—细胞基本知识概要1、概念：细胞2、如何理解细胞是生命活动的基本单位？3、病毒的结构及其增殖过程？第3章—细胞生物学研究方法略第4章—细胞膜与细胞表面1、概念：细胞膜、生物膜、细胞连接、胶原2、生物膜的基本结构特点是什么？这些特征与它的生理功能有什么关系？3、细胞连接有哪几种类型？各有何功能？第5章—物质的跨膜运输与信号传递1、概念：协同运输（共运输与对向运输）、细胞通讯、细胞识别、细胞信号通路、分子开关蛋白2、物质的跨膜运输方式与哪些？各有什么特点？3、Na+-K+泵的工作原理？4、胞饮作用与吞噬作用的比较？5、细胞有哪些方式进行通讯？各种方式之间有何不同?6、细胞有哪几种方式通过分泌化学信号进行细胞间相互通讯?第6章—细胞质基质与细胞内膜系统1、概念：蛋白质分选、信号肽、共转移、后转移2、信号假说的主要内容？第7章—细胞的能量转换—线粒体和叶绿体1、概念：呼吸、呼吸链、光合作用、光反应中心2、线粒体各结构上的标志酶分别是什么？3、光合作用的过程4、线粒体的氧化磷酸化与叶绿体的光合磷酸化的异同点5、氧化磷酸化偶联机制的化学渗透假说的内容第8章—细胞核与染色体1、概念：核孔复合体、染色体、染色质、核小体、常染色质、异染色质（结构异染色质和兼性异染色质）、2、核孔复合体的功能3、染色体DNA的三种功能元件第9章—核糖体略第10章—细胞骨架1、概念：细胞骨架、细胞核骨架2、微管和微丝的特异性药物第11章—细胞增殖及其调控1、概念：细胞周期、检验点、细胞周期同步化、联会、二价体、四分体、2、细胞周期中各个时期及其主要事件（包括有丝分裂和减数分裂）第12章—细胞分化与基因表达调控1、概念：细胞分化、细胞癌变、转分化、去分化、再分化、再生、细胞全能性、癌基因、抑癌基因2、细胞分化的影响因素3、癌细胞的基本特征4、良性肿瘤与恶性肿瘤的区别第13章—细胞衰老与凋亡1、概念：细胞衰老、Hayflick界限、细胞凋亡、细胞坏死2、细胞衰老的特征3、细胞凋亡的特征4、细胞凋亡与细胞坏死的区别。
细胞生物学实验指导
细胞⽣物学实验指导实验⼀动物细胞的传代培养⼀、实验⽬的1、熟悉细胞培养过程中的⽆菌操作技术。
2、了解细胞传代培养的基本⽅法和主要操作步骤⼆、实验原理细胞培养(cell culture)是指从机体内取出某种组织或细胞，模拟机体内的⽣理条件使其在体外⽣存、⽣长和繁殖的过程。
细胞的体外培养在细胞⽣物学和医学研究领域有着极为⼴泛的⽤途，这⼀技术已成为研究细胞⽣理、细胞增殖、细胞遗传、细胞癌变和细胞⼯程等课题的⼀项不可缺少的⼿段。
细胞培养技术的突出优点在于能为研究者提供⼤量的⽣物性状相同的细胞作为研究对象，便于⼈们在体外利⽤各种不同的⽅法从不同的⾓度研究细胞⽣命活动的规律。
另外，利⽤细胞培养技术还可使⼈们较为⽅便地研究各种物理、化学和⽣物因素对细胞结构和功能的影响。
细胞培养可分为原代培养和传代培养2种情况。
所谓原代培养(primary culture)是指直接从机体取出组织或细胞后所进⾏的⾸次培养。
⽽传代培养(subculture)是指当原代培养的细胞增殖到⼀定密度后，将其从原培养容器中取出，以1：2或其他⽐例转移到另⼀个或⼏个容器中所进⾏的再培养。
传代培养可简称传代。
在体外培养过程中，要使细胞能正常地⽣长、繁殖，需经常对其进⾏传代。
传代的累积次数就是细胞的代数。
在从事细胞培养⼯作时常常会接触到细胞系(cell line)和细胞株(cell strain)这两个容易混淆的概念。
⼀般认为，细胞系指通过原代培养并经传代后所形成的细胞群体，由于细胞系来源于原代培养，⽽原代培养物中所含的细胞种类较多，故⼀个细胞系往往由多个⽣物学性状不同的细胞群体所组成，⽽细胞株是利⽤单细胞分离培养法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中选择出的细胞群体，⼀个细胞株往往具有特殊的⽣物学性状或标记并可持续存在。
细胞培养是⼀种程序复杂、条件较多且要求严格的实验性⼯作。
由于细胞在体外的⽣长、繁殖会受到温度、营养物质、酸碱度、渗透压及微⽣物等多种因素的显著影响，故细胞培养⼯作的各个环节如培养器⽫清洗消毒、营养液配制和除菌、pH值调整、温度调节等操作都有严格的要求和规定，特别要注意⽆菌操作，这是细胞体外培养成败的关键。