流式细胞仪实验方法及常见问题分析共29页文档
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术应用领域
免疫学研究
用于检测免疫细胞表面标志物、 细胞亚群分类和功能分析等。
生殖医学研究
用于精子分析和胚胎发育监测等 。
血液学研究
用于检测白血病、淋巴瘤等血液 肿瘤细胞的表面抗原和基因表达 。
肿瘤学研究
用于检测肿瘤细胞的生长、凋亡 和转移等生物学特性。
流式细胞术实验技巧 及数据分析
日期：
• 流式细胞术简介 • 流式细胞术实验技巧 • 流式细胞术数据分析 • 流式细胞术实验问题与解决 • 流式细胞术实验案例分享
目录
Part
01
流式细胞术简介
流式细胞术定义
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分离单个细胞的生物技术。通过将细胞悬 浮在液流中，并使用激光束照射细胞，可以测量细胞的物理和化学特性，如细胞 大小、颗粒质量和荧光标记等。
物的群体结构、进化关系和生态分布等方面。
THANKS
感谢您的观看
仪器参数，如光电倍增管
电压、滤波器等。
数据采集
3 确保数据采集的完整性和
准确性，避免丢失或重复 采集数据。
Part
03
流式细胞术数据分析
流式细胞术数据分析
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Part
04
流式细胞术实验问题与解决
荧光补偿设置问题
总结词
荧光补偿设置是流式细胞术实验中的 重要环节，用于消除不同荧光染料间 的光谱重叠。
细胞群体识别问题
总结词
细胞群体识别是流式细胞术实验的重要环节，直接影响实验 结果的分析和解读。
详细描述
在流式细胞术实验中，需要准确识别和区分不同的细胞群体 。通过优化抗体标记组合、采用多参数分析等方法，可以提 高细胞群体识别的准确性和可靠性，为后续的数据分析和解 读提供有力支持。
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞仪常见故障维修处理方法
流式细胞仪常见故障维修处理方法
流式细胞仪常见故障维修处理方法包括以下几点：
1. 仪器无法打开或无法正常运行：首先检查电源线是否插紧，确保电源供电正常。
同时确认电源开关是否打开。
如果仪器仍无法正常运行，可尝试重新安装软件或重启系统。
2. 数据无法读取或显示错误：检查数据线是否插紧，并确保与计算机的连接稳定。
同时检查仪器软件是否最新版本，可尝试重新安装驱动程序或软件。
3. 样品无法通过流式细胞仪：首先检查样品是否准备好并合适。
确保样品的浓度适当，含有足够的细胞数量。
检查流式细胞仪的流速设置是否正确，可尝试调整流速。
同时检查光源是否正常工作和传感器是否干净，如有需要可以进行清洁或更换。
4. 检测结果与预期不符：首先检查实验条件是否正确设置，包括抗体浓度、荧光染料浓度、细胞浓度等。
确认仪器的设置是否正确，包括激光的波长和光滤波器的选择。
如果结果仍不符合预期，可尝试更换抗体或染料，并重新确定实验参数。
5. 仪器噪音或信号干扰：检查光源和光学系统是否干净，可以使用专业的清洁剂进行清洁。
确保仪器的温度和湿度控制正常，避免影响仪器的稳定运行。
如果仍有噪音或信号干扰，可以尝试更换光源或传感器。
6. 其他故障：如果以上处理方法仍无法解决问题，建议联系仪器制造商或专业维修人员进行维修或咨询。
流式细胞仪实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除流式细胞仪实验报告篇一：流式细胞术实验报告流式细胞术实验目的掌握流式细胞仪的工作原理掌握用流式细胞仪测量细胞群体DnA含量分布的方法了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用实验原理流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。
在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。
通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、Dn(:流式细胞仪实验报告)A、RnA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。
细胞内的DnA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如g0/g1期的DnA含量为2c，而g2期的DnA含量是4c。
利用pI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DnA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。
仪器、材料与试剂仪器：流式细胞仪、离心机。
材料：hela细胞样品、试管、离心管、封口膜、微量移液器、Tip头、eppendorf管。
试剂：70％乙醇（保存于4℃），Rnase（-20℃保存），pI染液（避光保存于-20℃），pbs(ph7.4，保存于4℃)实验步骤样品细胞由老师于课前收集并置于70%(预冷)乙醇中4℃下固定过夜。
2000rpm15min收集固定细胞，pbs洗2次。
用100μLpbs重悬细胞并转至试管中轻轻吹打（防止细胞破碎）。
加pI染液50μL和Rnase约2μL室温放置15min。
上机检测。
样品测定并使用modFitLT软件分析结果。
实验结果与讨论:所测样品中各周期时相的百分比：g1期68.48%g2/m期16.63%s期14.89%g2：g1=1:1.77cV12.16提示结果可能不可靠或存在多倍体细胞。
流式细胞术是一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。
用以分析细胞大小、细胞周期、DnA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。
这种技术具有以下特点1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法（Fcm综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞仪试验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
细胞流式实验实验报告
细胞流式实验实验报告细胞流式实验实验报告引言：细胞流式实验是一种常用的细胞学技术，可以用于研究细胞表面标记物、细胞周期、细胞凋亡等多个方面。
本实验旨在探究细胞流式实验的原理、步骤以及数据分析方法。
一、实验原理细胞流式实验是一种通过细胞悬液经过流式细胞仪进行分析的技术。
其原理基于细胞在流体中的流动性质，通过激光照射细胞并测量其散射光和荧光信号来获取相关信息。
二、实验步骤1. 细胞样本制备：将细胞培养物离心收集细胞，用PBS洗涤细胞，然后用细胞培养基悬浮细胞。
2. 细胞固定与渗透化：向细胞悬液中加入固定液，使细胞固定，然后加入渗透化液，使细胞膜渗透。
3. 标记抗体：将待检测的抗体与细胞悬液混合，使其与细胞表面的特定分子结合。
4. 细胞染色：加入荧光染料，使细胞发出荧光信号。
5. 流式细胞仪分析：将细胞悬液注入流式细胞仪，通过激光照射细胞并测量其散射光和荧光信号。
6. 数据分析：使用流式细胞仪软件对数据进行分析，如细胞计数、细胞比例、荧光强度等。
三、实验结果通过细胞流式实验，我们获得了以下结果：1. 细胞计数：通过流式细胞仪软件分析，我们得到了细胞的总数。
2. 细胞比例：根据细胞表面标记物的不同，我们可以得到不同类型细胞的比例。
3. 荧光强度：荧光染料的强度可以反映细胞中特定分子的表达水平。
四、实验讨论1. 实验优化：在实验过程中，我们可以对实验步骤进行优化，如固定液和渗透化液的浓度、抗体的浓度、染料的浓度等。
2. 数据解读：根据细胞流式实验的结果，我们可以进一步解读细胞的特点，如细胞表面标记物的表达情况、细胞凋亡的程度等。
3. 实验应用：细胞流式实验在生物医学研究中具有广泛的应用，如肿瘤细胞的鉴定、免疫细胞的分析等。
五、结论细胞流式实验是一种重要的细胞学技术，可以用于研究细胞表面标记物、细胞周期、细胞凋亡等多个方面。
通过优化实验步骤和数据分析，我们可以获得准确的实验结果，并进一步解读细胞的特点。
细胞流式实验在生物医学研究中具有广泛的应用前景。
流式细胞仪常见问题的处理方法及技术交流
流式细胞仪常见问题的处理方法及技术交流流式细胞仪是一种对细胞进行自动分析和分选的装置，依据参数测量原理工作。
流式细胞仪紧要由流动室和液流系统、激光源和光学系统、光电管和检测系统、计算机和分析系统4部分构成，目前在生物医疗领域有广泛运用，紧要用于分析细胞表面标志、分析细胞受体、分析肿瘤细胞的DNA、RNA含量、分析免疫细胞的功能。
对于精密仪器而言，故障的显现在所难免，如何排查故障是延长仪器寿命的关键。
流式细胞仪常见的故障紧要有仪器长时间不能进入ready状态、喷嘴堵塞两个。
仪器长时间不能进入ready状态仪器长时间不能进入ready状态可能是试管有裂缝导致漏气、鞘液罐的接口漏气、喷嘴上的胶圈破损及老化、电源部分有故障，应遵奉并服从由简到难的次序逐一排查，替换问题组件，假如仍旧无法进入ready状态，需请厂家来维护和修理。
喷嘴堵塞喷嘴堵塞一般显现在实机操作中。
日常的喷嘴在prime机时喷出一道水柱，假如喷出的是气泡，则说明喷嘴有堵塞，气泡越大堵塞越严重。
排出故障的步骤：①放开托臂，用10%的次氯酸钠反复冲洗再放回托臂机，假如故障还未排出就应关掉主机。
②用的注射器接上胶管套，在喷嘴上反复抽吸，一般堵塞现象可以排出。
③假如注射器抽吸无效，则要小自取下喷嘴。
此操作应由厂家的维护和修理人员或娴熟的工作人员进行，以免撞弯了喷嘴。
喷嘴用注射器套上冲洗，直至喷嘴喷出的水柱呈直线为止。
④假如喷嘴堵塞经上述淀查病后的水柱呈直线为止。
④假如喷嘴堵塞经上述3个步骤还不能解决，可以用超声波仪清洗。
清洗时喷嘴两头应套上试管，以防碰弯。
先将喷嘴浸入的10%次氯酸钠中超声1h，然后用过滤后H2O的再超声1h，经过此步骤清洗的喷嘴都会除去堵塞现象。
注意不到万不得己时不要拆下喷嘴清洗，由于反复的拆卸会加添喷嘴损坏的可能性。
流式细胞仪的十大应用1、DNA倍体分析DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用广泛检测项目。
由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很讨论评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。
流式细胞仪使用方法说明书
流式细胞仪使用方法说明书1. 概述流式细胞仪是一种用于细胞分析和排序的先进仪器。
本方法说明书旨在向用户介绍如何正确操作流式细胞仪以及最佳的使用方法。
请用户在使用前仔细阅读本说明书并遵循相关的安全操作规程。
2. 仪器组成流式细胞仪主要由以下几个组成部分构成：- 流体传送系统：用于将样本引入仪器并排除废弃物。
- 激光系统：产生激光束以激发样本中的荧光染料。
- 光学系统：收集样本产生的荧光信号并进行检测。
- 数据分析系统：用于解析和分析收集到的数据。
3. 使用准备在进行流式细胞仪实验之前，请确保以下几个步骤已经完成：- 仪器校准：根据仪器的使用手册进行仪器校准，确保仪器工作在最佳状态。
- 样本准备：按照实验需求，对待测样本进行合适的处理，例如细胞培养、染色等。
- 试剂准备：准备好所需的荧光染料、缓冲液等试剂。
4. 仪器操作以下是流式细胞仪的一般操作步骤：- 打开仪器电源，并等待仪器启动完成。
- 将样本装入合适的样本管，并在样本管中加入适量的荧光染料或其他试剂。
- 将样本管放入仪器中的样本槽，并调整流速和其他参数。
- 启动激光系统，并调整激光强度和波长以适应实验需求。
- 开始数据采集，根据仪器界面指示收集所需数据。
- 数据分析：根据实验需要，使用相应的数据分析软件对采集到的数据进行解析和处理。
5. 安全注意事项在使用流式细胞仪时，务必注意以下安全事项：- 佩戴个人防护装备，包括实验手套和护目镜。
- 遵循实验室的生物安全规程，确保样本处理符合相关的安全要求。
- 避免直接暴露于激光束下，以免损伤眼睛和皮肤。
- 在清洁仪器时使用合适的溶剂，并按照仪器清洁的标准程序进行操作。
6. 故障排除在实际操作中，有时可能会遇到仪器故障或其他问题。
以下是一些常见问题及其排除方法：- 仪器无法启动: 检查电源连接是否正常，重启仪器。
- 数据质量差: 检查样本制备和染色的质量，调整参数和仪器校准。
- 清洗困难: 检查是否有阻塞，按照清洁程序进行清洗。
流式细胞仪使用注意事项
流式细胞仪使用注意事项流式细胞仪是一种现代化的生物技术仪器，可以快速、准确地进行单个细胞的分析和分类，被广泛应用于生命科学、医学、药物研发等领域。
然而，由于其操作复杂、灵敏度高、易受污染等特点，使用过程中需要注意一些细节和技巧，以确保数据的准确性和可靠性。
本文将从以下几个方面介绍流式细胞仪的使用注意事项。
一、仪器准备在使用流式细胞仪前，需要对仪器进行一系列准备工作，包括检查仪器是否正常、清洁仪器表面、校准仪器参数等。
具体步骤如下： 1. 检查仪器是否正常：首先检查仪器的电源、冷却系统、激光器、光路等部件是否正常运转，确保仪器处于良好的工作状态。
2. 清洁仪器表面：使用干净柔软的布擦拭仪器表面，避免使用含有酸碱等腐蚀性成分的清洁剂，以免损坏仪器。
3. 校准仪器参数：根据实验需要，对仪器的激光功率、PMT增益、流速等参数进行校准，确保仪器的准确性和稳定性。
二、样品准备样品的准备是流式细胞仪实验的重要环节，不同的样品类型需要不同的处理方法。
下面介绍几种常见的样品类型及其处理方法：1. 细胞悬液：将细胞培养物或组织切片等样品离心收集，用PBS 等缓冲液洗涤，最后用适当的缓冲液稀释至合适的浓度。
2. 血液样品：采集静脉血或指尖血液，使用抗凝剂（如EDTA、肝素等）处理，离心收集血细胞，用PBS等缓冲液洗涤，最后用适当的缓冲液稀释至合适的浓度。
3. 粒子悬液：将纳米颗粒、微珠等样品用PBS等缓冲液稀释至合适的浓度，加入荧光染料等标记物后进行分析。
三、操作注意事项在使用流式细胞仪时，需要注意以下几点：1. 样品处理：样品的处理过程中需要避免受到光、热、震动等外界因素的干扰，以免影响实验结果。
同时，需要注意样品的稀释倍数，过高或过低都会影响数据的准确性。
2. 样品注入：将样品注入流式细胞仪时，需要根据样品的性质和浓度选择适当的注入速度和压力，以避免样品堵塞或破坏仪器。
3. 数据分析：在数据分析过程中，需要根据实验设计和样品类型选择适当的数据处理方法，如峰值分析、群体分析、细胞周期分析等。
流式细胞抗体染色操作步骤及常见问题(详细版)
流式细胞抗体染色的操作步骤及常见问题一、实验物品准备水平离心机、流式细胞仪、流式细胞管、流式细胞缓冲液、细胞过滤器、15ml离心管、流式抗体、同型对照抗体、避光锡纸、移液器、细胞吸管、细胞计数仪等二、FC受体封闭试剂准备阻断Fc受体的试剂可用于减少非特异性免疫荧光染色。
一般标记样品细胞的荧光素偶联抗体多为单克隆抗体，少数也可能是多克隆抗体。
其基本结构都由两部分组成，即包含有特异性结合抗原位点的Fab段和相对保守的Fc段，抗体的特异性表现在Fab段。
标记时利用Fab 段的抗原结合位点与细胞上抗原分子特异性结合，从而标记并且相对量化细胞表达该抗原分子的情况。
但是，有些细胞表面表达FcR(Fc receptor,Fc受体），如巨噬细胞、树突细胞、B淋巴细胞等，FcR可以与荧光素偶联抗体的Fc段进行非特异性的结合，对结果产生一定的影响。
目前封闭方法主要有两种：（1）用市面上卖的适量的CD16/32的抗体与样品细胞充分混匀，4℃孵育10-15min。
CD16/32是一种Fc受体, 能够与IgG的Fc段结合，而荧光素偶联抗体基本上是IgG抗体，所以在标记荧光素偶联抗体前可以用CD16/32抗体封闭样品细胞，使样品细胞表面的FcR都被抗CD16/32抗体结合，从而阻止后续荧光素偶联抗体与FcR的非特异性结合。
（2）用血清全IgG抗体与样品细胞充分混匀，4℃孵育10-15min。
比如研究人的细胞时，若荧光素偶联抗体来源于小鼠，封闭采用小鼠血清全IgG抗体。
注意：无论选用哪一种方法，原则是如果流式抗体可能与样品细胞的FcR发生非特异性结合，那么在标记荧光素偶联抗体之前先用流式抗体同源的全IgG抗体或CD16/32抗体进行封闭，使样品细胞表面的FcR饱和。
三、流式对照设置流式细胞实验对照设置非常重要，常见有阴性对照和单阳对照。
（1）阴性对照设置目的是去除自发和非特异荧光干扰。
阴性对照主要包括两个部分，即:空白对照（检测样本自发荧光）和同型对照（检测样本自发荧光+非特异性荧光）。
流式细胞仪质量控制及常见问题处理-薛向军
移液 抗体 溶解/固定
II 仪器设置
IV 样品分析
分析窗口 补偿
门的纯度和回收率 准确性和精确度 可靠性核查
标本及标本处理的质控
•第一，标本的种类及外观 •第二，单细胞悬液的获取 •第三，抗凝剂的选择 •第四，样本的保存 •第五，去除红细胞的方法 •第六，细胞与抗体的比例 •第七，细胞活性的鉴定
数据的获取和分析
•第一，细胞获取数量
•第二，阈值的设立通道和大小 •第三，分析区域 •第三，其它有用的参数，如平均荧光强度，荧光强度中位 数，CV，细胞浓度等
可靠性的核实
T SUM: %CD3+4+ + %CD3+8+ = %CD3 ± 5% T 细胞的平行测定 2% LYMPHOSUM: CD3+ + CD19+ + NK = 100% ± 5% 荧光微球的流速（样本内质控）
在质控方面移液的影响经常被忽略
单平台绝对记数法要求精确和准确的测定 , 推荐使用反向加样
法, 要定期检查移液枪的精确度和准确性.
精确
准确
精确和准确
“Ringing phone syndrome”
Site A
“Change of operator syndrome”
Site B
“Stepper pipette syndrome”
系统性能参数----荧光线性
将不同荧光强度的微球混合，得到各个峰的平均荧光强度；根据标准微 球说明书提供的各个峰的MEFL荧光分子数，以及分析得到的各个峰的平 均荧光强度，做的线性回归。
Log Amplifier Linearity Verification 3
流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞仪常用技术方法)
流式细胞仪常用技术方法细胞周期/DNA分析(PI法)一、鞘液准备(至少3L PBS,提前一天准备)0.01M的PBS配制方法:800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g;Na2HPO40.24g;调节pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH调节,各地蒸馏水的酸碱度不同),加蒸馏水定容至1L,0.22um滤膜过滤后,室温保存。
二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围:没有染色的细胞(制备过程如下,仅不加抗体)三、实验步骤1.取对数期生长细胞,倒去培养液,胰酶适度消化细胞,用培养液吹打,1000rpm,离心10min弃上清;2.PBS洗2次,加0.5ml吹匀,务必吹散;3.加入70%预冷乙醇中(标准做法是将细胞悬液加入预冷70%酒精),固定时可加入Triton X-100以增加膜的通透性)封口膜封口,4℃固定1-2h或过夜(可长至一个月);4.1000rpm×10min离心收集细胞,PBS洗两次;5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打;6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml,37℃水浴消化30min;7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml,室温避光染色30min;8.用300目滤网过滤,上机检测。
细胞周期/DNA分析(BD公司CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit)一、鞘液准备(至少3L PBS,提前一天准备)0.01M的PBS配制方法:800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g;Na2HPO40.24g;调节pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH调节,各地蒸馏水的酸碱度不同),加蒸馏水定容至1L,0.22um滤膜过滤后,室温保存。
二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围:没有染色的细胞(制备过程如下1-6)三、若做DNA倍体分析,需另设附加对照管肿瘤细胞和外周血单核细胞的混合管,比例至少为2:1四、实验步骤1. 将细胞消化后,用冷PBS洗细胞两次,300g×5min(若细胞数过少可提高转速到500g),为减少细胞损失可用1.5ml离心管离心;2. 弃上清留大约50ul下面的液体防止碰到细胞团,加入1ml Buffer Solution并低速混匀细胞。