流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)

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一、开机程序:

1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态(鞘液为鞘液桶体积的3/4位

置,可以连续工作3个小时左右)、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足

够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液,要先释放鞘液桶中

气压。

2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关,打印

机。

3.气压阀置于加压位置,待流式细胞仪处于STANDBY状态,做Prime,以

排除管路中气泡。

二、运行FACSComp软件、检查仪器状况

1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液(或过滤PBS)中加入

1滴质控小微球,也可以根据实际情况调节浓度。

2.机器预热5 min,打开FACSComp软件,选择保持路径。选择所需校

正内容,如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。

3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型,即实验过

程中是否需要清洗样品。

4.上样品,微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。

5.仪器自动检查,并做电压、补偿等设置。

6.FACSComp软件运行完毕,显示结果通过测试。

7.做Set up。

8.打印校正结果,退出FACSComp程序。

备注:在质控过程中,如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度,但是在调节灵敏度(Sens)时,一定要用“Low”的状态上样,保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯,在上样品过程中,仪器保持在“Low”“Standby”状态。

三、样品分析软件:CellQuest Pro

软件,选择“联机”。

1.

(2)对实验样本进行命名;

(3)对实验通道进行预设(FSC,SSC,FL1-FL4)。

备注:如果界面被关闭,重新调出步骤:

2.调出质控模板。

3.画图

选择画图工具(一般选择散点图),Inspect

界面会自动弹出,对几

选中图形)

,将更改横纵坐

备注:第一个散点图横坐标为FSC,纵坐标为SSC。

(1一般获取10000个细胞。

(2

3)将所有补偿调为0

(4)将非

52

(5)FSC和SSC

(6

4.上阴性对照

将阴性对照管混匀,上机,功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信

号,第一个图:让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域;其他三个

散点图,要将细胞信号调整到阴性区域,即左下角区域。通过移动通

道电压来实现。

获取实验数据:暂停刚才实验

注意:

5. RUN

”,如果细胞信号出现在双阳区域,说明

有细胞信号露到相邻通道中,要将细胞信号调节到单一通道中。通过

移动通道补偿来实现,想要细胞信号向哪个通道移动,就用散点图中

的另一个通道去减,即想要移动的那个通道作为减数。如在FL1和

FL2两个通道组成的散点图中,细胞信号出现在双阳区域,要将细胞

信号移动到FL1通道,就要调节FL2-FL1对应的补偿,直到细胞信号

只出现在FL1通道中,这样可以消除漏到FL2通道中的信号。

备注:FL1-FITC ,FL2-PE ,FL3-PerCP ,FL4-APC 。

根据实验要求选择流速,按设置顺序上样。

6. 点击“Acquire ”命令,仪器开始获取数据,并自动将数据文件保存

到规定的目录下。

7.

样本获取完毕,功能键设置在“STANDBY ”,并选择“脱机”命令。 8.

点击“Quit ”命令,退出CellQuest 软件。 9. 关机:(1)1% 次氯酸,高速(Hi )“RUN ” 5-10 min ,Acquire 如果

细胞计算器中不显示有细胞则表示管道已经干净。

(2)用双蒸水高速(Hi )“RUN ” 5-10 min ,Standby 5 min ,关

机。

四、DNA 倍性分析实验:

一、仪器情况检测,DNA 倍性分析的质控用CellQuest Pro 软件进行。

1.

(1)保证机器预热5 min ,打开CellQuest Pro 软件,选择“联机”。

做质控时,需要画三个图,第一个是散点图,横坐标是FSC ,纵坐标是SSC ;第二个是散点图,横坐标是FL2-Width ,纵坐标是FL2-Area ;第三个是直方图,横坐标是FL2-Area ,纵坐标是Counter 。做DNA 倍性实验时一般使用PI 染色,)。DNA 倍性分析不需要调节补偿。因为属于单色实验,所以把电压界面 前的勾去掉。将信号接收方式“Log ”改为“Lin ”,DDM Pram 改为“FL2阈值使用FL2,而不是FSC 。

去掉细胞群中粘连体,上样本,利用第二个图,调节FL2-A 和FL2-W 电压,使细

胞群信号显示在横纵坐标200位置,通常血细胞中单细胞成45℃,粘连体体积会比单细胞大,大概在横坐标400位置。保存质控。

二、DNA倍性分析用ModFit LT软件进行。

(1)打开ModFit LT软件,调出样品检测结果,

(2)选择面积(FL2-A),选定X轴:FL2-W,Y轴:FL2-A。

(3)可以点击Auto选项,进行结果自动分析,也可以选择Manuale,人工分析。

FACSCalibur

每日开机程序

1.检查鞘液桶,确认:

❖鞘液充满状态(~3升)

❖盖紧黑盖

❖管路畅通,无扭曲

2.检查废液桶,确认:

❖废液桶充满100ml漂白剂

❖管路畅通,无扭曲

3.打开流式细胞仪。

4.打开电脑。

5.气压阀置于加压位置,并排除管路中气泡。

6.做Prime。

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