流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
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一、开机程序:
1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态(鞘液为鞘液桶体积的3/4位
置,可以连续工作3个小时左右)、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足
够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液,要先释放鞘液桶中
气压。
2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关,打印
机。
3.气压阀置于加压位置,待流式细胞仪处于STANDBY状态,做Prime,以
排除管路中气泡。
二、运行FACSComp软件、检查仪器状况
1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液(或过滤PBS)中加入
1滴质控小微球,也可以根据实际情况调节浓度。
2.机器预热5 min,打开FACSComp软件,选择保持路径。选择所需校
正内容,如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。
3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型,即实验过
程中是否需要清洗样品。
4.上样品,微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。
5.仪器自动检查,并做电压、补偿等设置。
6.FACSComp软件运行完毕,显示结果通过测试。
7.做Set up。
8.打印校正结果,退出FACSComp程序。
备注:在质控过程中,如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度,但是在调节灵敏度(Sens)时,一定要用“Low”的状态上样,保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯,在上样品过程中,仪器保持在“Low”“Standby”状态。
三、样品分析软件:CellQuest Pro
软件,选择“联机”。
1.
(2)对实验样本进行命名;
(3)对实验通道进行预设(FSC,SSC,FL1-FL4)。
备注:如果界面被关闭,重新调出步骤:
2.调出质控模板。
3.画图
选择画图工具(一般选择散点图),Inspect
界面会自动弹出,对几
选中图形)
,将更改横纵坐
备注:第一个散点图横坐标为FSC,纵坐标为SSC。
(1一般获取10000个细胞。
(2
(
3)将所有补偿调为0
(4)将非
52
(5)FSC和SSC
(6
4.上阴性对照
将阴性对照管混匀,上机,功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信
号,第一个图:让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域;其他三个
散点图,要将细胞信号调整到阴性区域,即左下角区域。通过移动通
道电压来实现。
获取实验数据:暂停刚才实验
注意:
5. RUN
”,如果细胞信号出现在双阳区域,说明
有细胞信号露到相邻通道中,要将细胞信号调节到单一通道中。通过
移动通道补偿来实现,想要细胞信号向哪个通道移动,就用散点图中
的另一个通道去减,即想要移动的那个通道作为减数。如在FL1和
FL2两个通道组成的散点图中,细胞信号出现在双阳区域,要将细胞
信号移动到FL1通道,就要调节FL2-FL1对应的补偿,直到细胞信号
只出现在FL1通道中,这样可以消除漏到FL2通道中的信号。
备注:FL1-FITC ,FL2-PE ,FL3-PerCP ,FL4-APC 。
根据实验要求选择流速,按设置顺序上样。
6. 点击“Acquire ”命令,仪器开始获取数据,并自动将数据文件保存
到规定的目录下。
7.
样本获取完毕,功能键设置在“STANDBY ”,并选择“脱机”命令。 8.
点击“Quit ”命令,退出CellQuest 软件。 9. 关机:(1)1% 次氯酸,高速(Hi )“RUN ” 5-10 min ,Acquire 如果
细胞计算器中不显示有细胞则表示管道已经干净。
(2)用双蒸水高速(Hi )“RUN ” 5-10 min ,Standby 5 min ,关
机。
四、DNA 倍性分析实验:
一、仪器情况检测,DNA 倍性分析的质控用CellQuest Pro 软件进行。
1.
(1)保证机器预热5 min ,打开CellQuest Pro 软件,选择“联机”。
做质控时,需要画三个图,第一个是散点图,横坐标是FSC ,纵坐标是SSC ;第二个是散点图,横坐标是FL2-Width ,纵坐标是FL2-Area ;第三个是直方图,横坐标是FL2-Area ,纵坐标是Counter 。做DNA 倍性实验时一般使用PI 染色,)。DNA 倍性分析不需要调节补偿。因为属于单色实验,所以把电压界面 前的勾去掉。将信号接收方式“Log ”改为“Lin ”,DDM Pram 改为“FL2阈值使用FL2,而不是FSC 。
去掉细胞群中粘连体,上样本,利用第二个图,调节FL2-A 和FL2-W 电压,使细
胞群信号显示在横纵坐标200位置,通常血细胞中单细胞成45℃,粘连体体积会比单细胞大,大概在横坐标400位置。保存质控。
二、DNA倍性分析用ModFit LT软件进行。
(1)打开ModFit LT软件,调出样品检测结果,
(2)选择面积(FL2-A),选定X轴:FL2-W,Y轴:FL2-A。
(3)可以点击Auto选项,进行结果自动分析,也可以选择Manuale,人工分析。
FACSCalibur
每日开机程序
1.检查鞘液桶,确认:
❖鞘液充满状态(~3升)
❖盖紧黑盖
❖管路畅通,无扭曲
2.检查废液桶,确认:
❖废液桶充满100ml漂白剂
❖管路畅通,无扭曲
3.打开流式细胞仪。
4.打开电脑。
5.气压阀置于加压位置,并排除管路中气泡。
6.做Prime。