流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 Annexin V 检测细胞凋亡
AnnexinV-APC和7-AAD双染色检测细胞凋亡
AnnexinV-APC和7-AAD双染色检测细胞凋亡
细胞功能实验—Annexin V-APC/7-AAD双染色检测细胞凋亡
1. 材料
1.1. 实验材料
所用基础培养基请根据所培养细胞需求确定。
1.2. 试剂配制
1.2.1 培养基配制
于基础培养基中，加入10%FBS，1%双抗，以及其他营养成分（个别细胞需要额外的营养因子，请参考细胞需求），轻轻混匀，4℃冰箱储存（以下简称培养基）。
1.2.2 75%乙醇配制
取75ml无水乙醇，加入25ml超纯水，混匀。
1.2.3 PI染液配制（根据试剂盒说明书配制）
1.3. 主要仪器
1
2. 实验步骤（根据试剂盒说明书操作）
1.用不含EDTA 的胰酶消化细胞，终止消化后，1500rpm，3min 离心，吸去上清，用PBS
洗1遍，离心后用PBS重悬细胞，进行细胞计数。
2.取1E+5 个细胞量的悬液，离心弃上清，加入500 μl Binding buffer 重悬细胞。
3.加入5 μL Annexin V-APC，混匀后，再加入5 μL 7-AAD染液，混匀，室温，避光，反应
5-15 min后置于冰上。
4.1小时内进行流式细胞仪机检测。
5.GFP的绿色荧光：FITC通道筛选GFP阳性细胞进行Annexin V-APC／7-AAD荧光检测。
6.Annexin V-APC的红色荧光：激发波长633nm，最大发射波长660 nm。
7.7-AAD红色荧光：激发波长Ex=546 nm；发射波长Em=647 nm。
2。
Annexin V-FITC细胞凋亡检测详细步骤及说明
Annexin V-FITC细胞凋亡检测详细步骤及说明1. 对于悬浮细胞：a. 在进行完细胞凋亡刺激后，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS 轻轻重悬细胞并计数。
注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。
b. 取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195µl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。
c. 加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀。
d. 加入10µl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。
e. 室温(20-25ºC)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。
可以使用铝箔进行避光。
孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。
f. 如果用于流式细胞仪检测，可立即上机检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶(PI)为红色荧光，流式检测细胞凋亡的效果及其验证请参考图1和图2。
初次进行流式细胞仪检测时，建议选择一组适当的细胞参考图2设置未染色、PI单染和Annexin V-FITC单染这3个对照。
如果用于荧光显微镜检测，1000g 离心5分钟，收集细胞，用50-100µl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。
注意：细胞在染色后须尽快完成检测，通常宜在1小时之内完成检测。
用于流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测。
2. 对于贴壁细胞的消化后检测：a. 把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞。
室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。
需避免胰酶的过度消化。
Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒操作方法及步骤说明书
Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明：细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。
Annexin Ⅴ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）高亲和力特异性结合。
以标记了FITC的Annexin Ⅴ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
将Annexin Ⅴ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。
产品组成（50／25次反应）：· Annexin V-FITC 500ul／250ul（20ug /ml）· Binding Buffer 40ml／20 ml· Propidium Iodide (PI) 250ul／125ul（50ug /ml）保存条件: 2-8℃储存，有效期一年。
注意事项：1.为保证得到理想的实验结果，在使用此试剂盒之前请认真阅读该注意事项；2.试剂（尤其是小瓶装的试剂）在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落；3.Propidium iodide（PI）能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用；4.此试剂盒仅供科研使用，不宜用于临床诊断；5.本试剂盒中提供的PBS为随试剂赠送，并非试剂盒的真正组成成分；细胞的洗涤同常规方法。
操作注意要点：1.整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作；2.反应完毕后请尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应1小时后荧光强度就开始衰变；3.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在操作时请注意避光；4.成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等，把这些影响因素进行优化对实验成功是非常必要的；5.在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果；6.PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，上机前5分钟再加入PI染色。
AnnexinV凋亡试剂盒操作步骤
请在使用前仔细阅读说明书Annexin V,FITC 凋亡检测试剂盒(100次)产品名称货号规格储存条件运输条件Annexin V,FITC结合物AD01-10 100次×1 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温PI Solution AD02-05 50次×2 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温10×Annexin V Binding Buffer AD03-05 50次×2 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温*注：规格中的每“次”是以细胞浓度1×106 cells/ml计算产品描述细胞凋亡是指为维持有机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。
正常情况下任何细胞在形成过程中发生的异常都会通过凋亡消除。
例如体内的癌细胞增长为肿瘤的过程会受细胞凋亡的引导而被抑制。
然而在抑癌基因p53出现问题时，凋亡就不会诱导发生，从而导致癌细胞的不断增长。
细胞凋亡可以通过细胞形态的变化或生物化学的变化来检测。
目前常用的指标有caspase活性变化、DNA碎片、磷脂酰丝氨酸的外翻等。
Annexin V染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。
在细胞凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V 是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜特异性结合，因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
用绿色荧光FITC标记的Annexin V 通过流式细胞仪或荧光显微镜可以检测到细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料，PI只能透过凋亡晚期和死细胞的细胞膜，因此Annexin V和PI结合使用，可以区分凋亡早晚期的细胞及死细胞。
所需的设备和材料-合适量程的移液枪-样品和诱导剂-细胞培养用6，12，24，96孔板-PBS、去离子水-流式细胞仪或荧光显微镜。
细胞凋亡检测细胞凋亡实验步骤检测方法
细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测方法一、定性和定量研究只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。
二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，3) Telemerase Detection (端粒酶检测)3、生化检测：1）典型的生化特征：DNA 片段化2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA 片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。
可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。
4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。
通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。
此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。
如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。
上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。
需结合其它的方法来检测细胞凋亡。
)境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。
细胞凋亡检测AnnexinVFITC单染法AssayofCellApoptosis
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of CellApoptosis)2010-05-25 20:06:41 来源：浏览次数：197细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
关键词：一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。
因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用或可检测细胞凋亡的发生。
二、实验仪器和材料Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 mlPBS（1×）60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 和微量可调速载玻片（用于观察）盖玻片（用于观察）去离子水冰块或荧光显微镜三、实验方法1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。
细胞凋亡测定_实验报告
一、实验目的本实验旨在通过观察细胞凋亡的形态学特征和检测凋亡相关蛋白表达，了解细胞凋亡的发生机制，为细胞凋亡相关疾病的研究提供理论依据。
二、实验材料1. 细胞：人肝癌细胞株HepG2，人正常肝细胞株LO2。
2. 试剂：Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，Caspase-3活性检测试剂盒，DNA ladder检测试剂盒，荧光显微镜，流式细胞仪等。
3. 仪器：CO2培养箱，细胞培养瓶，移液器，离心机，荧光显微镜，流式细胞仪等。
三、实验方法1. 细胞培养：将HepG2和LO2细胞分别接种于培养瓶中，置于CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期时进行实验。
2. 细胞凋亡检测：（1）Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：将细胞悬液离心后弃去上清，加入Annexin V-FITC/PI染液，室温避光孵育15分钟，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
（2）Caspase-3活性检测：按照试剂盒说明书操作，检测细胞中Caspase-3活性。
（3）DNA ladder检测：按照试剂盒说明书操作，进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA ladder现象。
3. 数据分析：采用SPSS软件进行统计学分析，比较两组细胞凋亡率、Caspase-3活性和DNA ladder的差异。
四、实验结果1. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：HepG2细胞凋亡率为（30.2±2.5）%，LO2细胞凋亡率为（2.1±1.2）%，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
2. Caspase-3活性检测：HepG2细胞Caspase-3活性为（2.58±0.21）U/mg，LO2细胞Caspase-3活性为（0.83±0.14）U/mg，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
3. DNA ladder检测：HepG2细胞出现明显的DNA ladder现象，LO2细胞无DNA ladder现象。
细胞凋亡流式细胞术检测
该法简单、快速，但不适于常规多功能流式细胞仪 (不具备紫外光源)的检测。 主要有Caspases-3流式细胞检测试剂盒，Caspases-
2/ Caspases-4/Caspases-6/Caspases-7/Caspases-9等抗
体
2.6 DNA 碎片分析：Apo-BrdU
核酸内切酶活化使核小体内DNA断裂为50~300kb片段，裂解为200bp
通透性和对称性均会改变。
解决方法： 形态学特征是区分凋亡和坏死的“金标准”。
3.3 样本制备过程中凋亡细胞的选择性丢失：
贴壁培养细胞的分离
凋亡早期，细胞即脱离培养瓶表面并悬浮在培养液中。因此去除培养液， 然后加胰酶或EDTA消化的方法不可避免的会失去很多凋亡细胞。 ---将培养液和消化下来的细胞合在一起 胰酶消化本身就倾向于破坏细胞膜已破损的晚期凋亡和坏死细胞，导致 丢失。
2 细胞凋亡的流式检测方法
利用流式仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析 凋亡早期细胞因体积减小，胞浆及染色质固缩，FSC变 小，SSC增大 凋亡晚期细胞FSC、SSC均变小 坏死细胞则因细胞膜通透性改变，细胞肿胀， FSC 、 SSC 变大，胞膜破裂，胞内含物释出后 FSC 、 SSC 均变 小。
此法简单、可靠，由于凋亡时 细胞膜的改变大大早于DNA 的 改变，因此Annexin V/PI(或7-
AAD )双染色是检测早期凋亡
细胞的敏感方法。 由于该法必须用活细胞，因此 检测时间受到限制，且对凋亡 晚期细胞和坏死细胞无法准确 区分。
2.3 细胞内钙离子测定
Fluo-3-Am为新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，进入细胞后
2.1 PI单染检测
与细胞周期相同，利用PI染色，通过检测DNA含量来 同时判定细胞周期和凋亡。 凋亡过程中，细胞内核酸酶释放，细胞DNA发生有序
流式细胞术检测细胞 操作-3.23
所需的实验试剂
1. PBS
2. 1640细胞培养液
3. Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒
4. 胰蛋白酶
实验对象：A549细胞
干预措施：含有0、2236、5000ug/ml茶氨酸的细胞培养液
分组：五个组别，即对照组，2236ug/ml茶氨酸培养24h组，2236ug/ml茶氨酸培养48h组，5000ug/ml茶氨酸培养24h组，5000ug/ml茶氨酸培养48h组。
流式细胞仪检测A549细胞凋亡
流式实验步骤
1, 收集对数生长期A549细胞，计数，以(1～5)×105个/孔接种于6孔板，置37℃，5％CO2条件下培养过夜，使细胞贴壁；次日更换培养液，各孔分别加入含有不同浓度茶氨酸的细胞培养液2 mL/孔，继续常规培养；每24 h同法换液一次；
2, 在药物处理24h,48 h后，以不含EDTA的胰酶消化并收集细胞于流式管1000 r/min离心5 min，弃上清。
冷PBS洗涤细胞3次，离心弃上清；
3, 按照Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒的说明，向细胞中加入Binding buffer 150 μL/管和Annexin-V 5 μL/管，振荡混匀。
室温、避光反应15 min；
4, 再次加入Binding buffer 100 μL/管和PI染料5 μL/管，振荡混匀；
用流式细胞仪检测细胞凋亡。
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis)
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of CellApoptosis)2010-05-25 20:06:41 来源：易生物实验浏览次数：197 网友评论0 条细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
关键词：细胞检测单染法细胞凋亡检测Annexin-V-FITCAssayCellApoptosis一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。
因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
二、实验仪器和材料Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 mlPBS（1×）60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片（用于荧光显微镜观察）盖玻片（用于荧光显微镜观察）去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。
细胞凋亡检测（annexin-v...
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of CellApoptosis)2010-05-25 20:06:41 来源：易生物实验浏览次数：197 网友评论0 条细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
关键词：细胞检测单染法细胞凋亡检测Annexin-V-FITCAssayCellApoptosis一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。
因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
二、实验仪器和材料Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 mlPBS（1×）60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片（用于荧光显微镜观察）盖玻片（用于荧光显微镜观察）去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。
简化的流式检测凋亡步骤
流式检测凋亡FITC/PI法
1、布板：将细胞PBS清洗，胰酶消化，离心1000g5分钟。
细胞计数，保证6孔板每
个孔30X104个细胞，2mL培养液。
过夜。
2、细胞换液，吸净旧培养液，PBS清洗，加2mL对照组和染氟组培养液。
24过夜。
3、收集细胞，PBS清洗，0.5ml胰酶消化，1mL终止消化，收集到2mL离心管里，
离心1000g5分钟。
4、用15ml管，PBS将浓缩结合缓冲液稀释至1x，可根据实际需要量稀释。
本周一
12mL，1.2mL原液+10.8mLPBS。
5、弃上清。
加入1mL的结合缓冲液到H1、H4、P1、P4，细胞计数，保证细胞浓度为20-50X104个细胞/mL。
转移到另一个管，结合缓冲液补到1mL。
6、离心，弃上清，加入0.190mL结合缓冲液，5ul的FITC，加入5ul的PI，混匀后
室温避光孵育15分钟。
7、离心，弃上清，加200ul结合缓冲液清洗，离心，弃上清，加入，200ul结合缓冲
液，混合均匀。
出细胞间，去B520.
8、流式细胞仪去离子水冲洗15分钟。
9、另标一管，200目滤网过滤，上流式细胞仪检测。
慢速。
细胞凋亡流式实验步骤
细胞凋亡流式实验步骤
1. 细胞分离：分离被试细胞，如置于离心机中中心转速达到200 rpm，约5 分钟左右即可去除悬浮细胞上的血小板（如红细胞）。
2. 是否置于缓冲液中：将细胞置于缓冲液中，配制如下：PBS（无血清、不加钠）（50％），离心机中细胞悬液（50％）；加入另一液体（如HBSS）使其总体百分比为80％；之后将液体混合至相对稳定，之后置于离心机中细胞悬液中稀释到所需浓度（常见为1∶1 的程度）。
3. 是否加入胁迫剂：是否加入胁迫剂，加入的胁迫剂应根据实验的要求添加，如应添加的为脂质体类胁迫剂，可以考虑使用多巴胺；如果应添加的为放射线，可以考虑使用γ射线或X 射线。
4. 活性检测：活性可以用活性抑制试验（LDH）、核碎裂染色试验等探测，探究细胞凋亡后会出现多大程度的染色，从而测定凋亡程度。
5. 数据获取：流式实验完成后，将数据获取到电子数据库中，避免混淆错乱，快速查看，从而获取凋亡程度及其他信息。
一文掌握AnnexinV-FITCPI细胞凋亡实验方法
一文掌握AnnexinV-FITCPI细胞凋亡实验方法一、技术原理细胞凋亡（apoptosis）是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制控制，按照自身程序主动性、生理性的死亡过程。
细胞凋亡受凋亡相关基因调控，故又称为程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。
一般来说，凋亡早期，主要涉及胞内一些蛋白的变化，例如蛋白量的增高、位置的迁移、状态的改变等，还有一些磷脂、Ca2+的变化等；中晚期则伴随着DNA的断裂、凋亡小体的形成；而细胞形态的改变则伴随着整个凋亡过程。
二、产品应用目前可以采用单染色法和双染色法对细胞进行染色，流式细胞仪检测或荧光显微镜观察来检测细胞凋亡，其中Annexin V/PI法是当下较为流行的检测细胞凋亡的方法。
正常细胞中，磷脂酰丝氨（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡细胞中，PS会从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。
用荧光素（FITC、Alexa Fluor488等）标记的Annexin-V作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生；碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。
因此将Annexin-V 与PI结合使用，就可以检测出细胞群体中的早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞。
Apoptosis-AnnexinV 检测示意图碘化丙啶PI检测示意图三、使用方法1悬浮细胞，2000rpm离心5min收集细胞;对于贴壁细胞，要用不含EDTA的胰酶消化细胞，胰酶消化时间不宜过长或过短(过长细胞膜破碎，造成假阳性，过短，细胞黏连影响检测)最好是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶消化液，加入细胞培养液终止消化，，2000rpm离心5min收集细胞；24℃预冷PBS，洗涤细胞2次（2000rpm x 5min）,收集细胞2～5×105 ；3离心弃上清，加入500μL结合缓冲液，轻轻吹打重悬细胞；4加入5μL Annexin V-FITC，轻轻吹打混匀，加入5μL PI 轻轻吹打混匀,室温避光孵育5-15min。
bd annexin凋亡实验步骤
bd annexin凋亡实验步骤
进行bd annexin凋亡实验的步骤通常包括以下几个主要环节：
1. 细胞处理，首先，需要处理细胞样本。
这可能涉及到细胞培养、细胞分离、冻存细胞等步骤，具体操作会根据实验的具体要求
和样本类型而有所不同。
2. 细胞处理，将处理后的细胞进行处理，包括用PBS洗涤细胞、用缓冲液悬浮细胞等操作。
3. 细胞标记，接下来，需要使用BD Annexin V染色试剂盒对
细胞进行染色标记。
这通常涉及到使用BD Annexin V染色液和PI （荧光素）染色液，根据厂家提供的操作手册进行染色操作。
4. 流式细胞术，将标记后的细胞进行流式细胞术分析。
这包括
使用流式细胞仪进行数据采集和分析，根据细胞标记的不同，可以
区分出不同的细胞亚群，如存活细胞、凋亡细胞等。
5. 数据分析，最后，需要对流式细胞术得到的数据进行分析，
包括细胞凋亡率的计算和数据的统计学处理。
需要注意的是，在进行实验前，需要仔细阅读BD Annexin V染色试剂盒的操作手册，严格按照操作要求进行操作。
此外，实验过程中需要注意细胞的处理和操作要在无菌条件下进行，以确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，实验过程中也需要注意个人防护，避免对染色试剂和细胞样本造成污染。
希望这些信息能够对你有所帮助。
AnnexinV凋亡试剂盒一般染色检测方法1.把将被染色分析的细胞用冷PBS...
Annexin V凋亡试剂盒一般染色检测方法1.把将被染色分析的细胞用冷PBS洗涤二次并在恰当的染色缓冲液（binding buffer）中以1 x 106 细胞/mL的浓度重悬。
（染色缓冲液，binding buffer,中必须含有钙离子）2.吸取100ul的细胞(1 x 105)至试管中。
（必须在室温下进行）3.加入适量的荧光标记的annexin V试剂和PI。
（必须在室温下进行）4.混匀后避光室温下孵育15分钟。
（必须在室温下进行）5. 孵育后加入400ul染色缓冲液，立即上流式细胞仪分析。
（实验必须在一小时内完成，否则无意义！）我们推荐另外制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：a) 没有染色的细胞;b) 仅用荧光标记的annexin V染色的细胞;c) 仅用PI染色的细胞.annexin V和PI双阳性可以说明细胞群体中含有死亡细胞。
我们推荐可以使用一个细胞系来制备以上三个对照管来作为annexin V和PI阳性染色对照。
可以使用在RPMI +10% FCS + 2-4 ng/mL的TNF-a孵育2-3小时的人U-937细胞，或在培养液中孵育1-2小时鼠淋巴细胞作为对照细胞。
请依据以下建议来正确设置仪器补偿。
以下方案可以根据不同的细胞类型稍加修改。
在流式细胞仪上分析经染色的细胞:使用流式细胞仪正确分析annexin V-FITC和PI双标的细胞要求仪器的荧光补偿来去除两种染料激发光之间的叠加。
因为荧光补偿设置与PMT的电压直接相关，所以不同仪器之间的补偿不同。
我们建议在实验开始阶段分析单染的细胞来调整荧光补偿去除光谱重叠。
1. 上样未经染色的细胞，在线性FS-SS点图上显示细胞并设门圈出目标细胞群体。
注意：细胞在经培养后光散射信号会发生变化。
要注意使用侧向散射光设门来识别出这些已改变的细胞。
2.建立LogFL1-LogFL2双参数点图并分析以上光散射图中设门的细胞；保证>98%的细胞处于在X、Y轴Log 1为边界的左下象限中心区域。
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A n n e x i n V检测细胞凋亡
实验原理
Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。
实验用品
1. 一次性12⨯75mm Falcon试管。
2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8︒C保存。
3. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为
10⨯，使用时，用稀释为1⨯浓度的应用液。
5. Annexin V试剂与核酸染料：
Annexin V 核酸染料
Annexin V-Biotin（Cat. No. 65872X）Streptavidin-FITC（Cat. No. 13024D）
PI（Cat. No. 66211E）或7-AAD（Cat. No. 34321X）
Annexin V-FITC（Cat. No. 65874X）PI（Cat. No. 66211E）Annexin V-PE（Cat. No. 65875X）7-AAD（Cat. No. 34321X）
6. FACS流式细胞仪：上样检测。
7. CELLQuest软件：获取和分析试验数据。
8. Annexin V检测对照管：
Annexin V A-阴性对照B-补偿1 C-补偿2
Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin
和SAv-FITC
PI 和SAv-FITC
PE 未染色细胞Annexin V-PE 7-AAD
FITC 未染色细胞Annexin V-FITC PI
操作步骤
1.取Falcon 试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。
2.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1⨯Binding Buffer缓冲液制成1⨯106
细胞/ml的悬液。
3.Falcon试管中加入100 µl细胞悬液。
4.按以下体积加入Annexin V与核酸染料：
1阴性对照--
2单阳1 AV-FITC -
3-PI 4样本AV-FITC PI 5.轻轻混匀，室温（20︒C ~25︒C）避光处放置15分钟。