流式细胞仪操作方法

一、样品制备

1、取样（大约1×106 cells），离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞，﹣20℃冻存过夜。分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100μl的Rnase（GenScript试剂A），37℃水浴30min，然后再加入400μl的PI染液（GenScript试剂B），在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells，

二、上流式测细胞

1.1、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLow），拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲。检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。

1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput）、变压器电源，稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印，打开打印机电源。打开电脑（密码：BDIS），等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。

1.3、将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowcell中的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流出）。结束后自动STANDBY，5分钟后即可进行试验。

2.1、从苹果画面中选取CELLQuest，最大化，选散点图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H（选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。选择单参数图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)

2.2、从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机。此时出现Parameter description对话框,选择BD files,设置文件存放的位置{在Acquire指令栏中，选择Parameter Description，以决定文件存储位置(folder)，文件名称(file)，样品代号以及各种参数的标记(panel)，即安排tube1，2，3…的检测参数。一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \XXX 和DNA 文件夹中。文件根据日期命名。}同时将出现的Acquisiton Control对话框,将其移至合适位置。

2.3、从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps，Threshold，Compensation，Status等四个对话框，并将他们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取文件。也可以用&+1，2，3，4获得此四个对话框。

2.4、在Detectors/Amps（可通过调整电压，是FSC、SSC放大或者缩小）对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式（amplifiermode）：线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时，FSC和SSC 多以线性模式Lin测量，且DDMParam选择FL2，而FL1，FL2，FL3皆以对数模式Log 测量；分析细胞DNA含量时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以Lin进行测量，且DDMParam 选择FL2；分析血小板表型时， FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以Log进行测量。

在Threshold对话框中选择适当的参数设定阀值，并调整Threshold的高低，以减少噪音信号(细胞碎片)。一般做细胞表型时用FSC-H而做DNA时用FL2-H。Threshold并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。

在Compensation对话框中，根据所用的调整补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿。.在Status对话框中，LaserPower：正常值－Run/Ready为14.7mW，Standby为5mW；LaserCurrent：正常值为6Amps 左右。

2.5、通过预设的获取模式文件进行样品分析。从Cytometer指令栏中选取Instrument Settings，在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定，按Set ,Done确定。

2.6、加样:混匀、上样、按run（放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于RUN，流速可在HIGH或LOW上）

2.6.1.工具板中选择多角形区隔工具， FSC/SSC散点图上， R1区域的界定，

我们将以此区域来圈选本次测量的细胞。(如果要删除R1区域，您可以在工具栏中点选Gates → Region list，以鼠标点选 R1，再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。)

在单参数的图上，gate位置选择“G1=R1”使在单参数的图上显示的是R1区域的细胞的荧光。

2.6.2选择“acquire”----“counters”打开计数器，本实验计数10000个细

胞为准。测量期间，几十秒后（待电压稳定），点击Abort，去掉勾选setup 开始测量，如需暂停请按“stndby”，可按run继续。

三、样品分析

使用Modfit软件分析数据。打开file----选择需要分析的文件。

Define gate 1选择 X：FSC-H Y：SSC-H 点击OK Define gate 1选择 X：FL2-W Y：FL2-A 点击OK