流式细胞仪操作规程-SOP

合集下载

标准操作程序(SOP)的编写

SOP普遍特征
• • • • • • 由实验室相关人员书写实验室人员能够方便查取所有程序要符合实验室情况 SOP由作者和/或主任签署并标明日期可随时根据实验室变化修改任何变动要签字
HIV检测实验室应建立以下的SOP
样本的采集、接收登记和处理检测方法和步骤实验中的质量控制仪器的使用与维护结果解释与报告保密程序检测数据的记录和报告追踪和处理实验室的清洁与消毒实验室与操作者的安全
标准操作程序（SOP）的编写
xxx
标准操作程序SOP
SOP ：Standard Operational Procedure 为保证某个特定活动进程的一致性而制定的详细指令
实验室的SOP应涵盖所有的质量活动，包括检测或校准计划、管理性程序、技术性程序、项目操作程序和记录表格等。由于影响每个实验室的质量活动的条件和因素不一样，一个SOP只在某个实验室内有效，而不一定适用于其他实验室。
SOP
HIV抗体确认检测 Washer 430型全自动洗板机清洗与保养
SOP总结
具体、最具操作性、使用频率最高、与实验室的日常工作密切相关。就是第一次接触的人按其操作也能完成并保证工作质量。 SOP不是写给人看的，是写给自己实验室人员做的。写你所做的，做你所写的，真实记录你已做的。为保证按写的SOP执行。不仅要有实验室的管理制度作保证。但最为重要的实验室技术员的观念和意识。

流式细胞仪SOP

一. 流式细胞术概述

流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国BECKMAN- COULTER公司和

Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)两个厂家生产。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER 公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL,BD公司最新产品为

FACS Vantage 和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。

二.流式细胞仪主要技术指标

1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。

2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。

CantoII SOP canto software

FACSCanto II 流式细胞仪操作规程

开机

1．打开稳压器。

2．开启计算机，开机密码：BDIS#1。

3．打开仪器主电源。

4．点开FACSCanto软件，登陆。

5．确保软件与流式细胞仪联机。观察软件右下角：

6．观察status窗口，检查各种液体液面水平，如果需要的话，倒空废液桶，加满鞘液，清洗液和关机液。

7．从菜单上cytometer下选择液流开启(Fluidics startup)。液流启动大约需7min。同时仪器进行warm-up。

8．从菜单上cytometer下选择cleaning modes，其中依次进行以下操作：clean flow cell，degas flow cell，bubble filter purge，SIT flush （根据对话框提示选择是否上水）。

关机

1．在worklist中ID下依次填入rinse, clean，H2O。同时准备rinse 液，clean液（有效氯终浓度为0.1%-0.5%），以及DI水。2．在表格最前方指定rinse，上rinse液，点击run（绿色箭头），清洗5min。

3．取下rinse液，上clean液，清洗2min。

4．取下clean液，上DI水，清洗5min。

5．取下DI水。

6．从菜单Cytometer下，点击Fluidics shutdown。

7．运行完毕后，关掉仪器主电源。

8．退出软件。关电脑。

流式细胞仪操作规程SOP

流式细胞仪操作规程目录

１:淋巴细胞亚群测定及绝对计数

２:活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T得检测

3:HLA-B２7测定

4:CD55／CD5９测定

5:干细胞检测与绝对计数

６:白血病免疫分型测定

7:淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFＮ—γ/IL－４测定8:细胞周期分析

９:活化血小板检测

１０:血小板抗体测定

11:红细胞抗体测定

１2:粒细胞抗体测定

淋巴细胞亚群测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号:

200 年月日起实施

第1版

(共3页)

本规程每2年复审一次

复审日期: 年月日

复审人:

规程编写者:

审批者:

批准日期: 年月日文件分发部门与／或个人

院档案室保管者:

检验科主任:

检验科实验室:

淋巴细胞亚群测定

方案(Protocｏl) １.选参数

4色点击

点击

3色

点击

(命名,点击save) 2、画图

结果

此图为ＣD45圈门

如果做绝对计数,则

填写Flow-Count得浓度

选中cｅｌl/ｕl即可

方法

流式细胞仪(BｅckmaｎCoulteｒ,贝克曼库尔特)

原理:

双／三色直接免疫荧光法、荧光素标记得各种单克隆抗体加入到全血中,与白细胞膜上相应得抗原结合,经过溶血、洗涤(与固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析,从而得到相应各亚群得百分数。活化淋巴细胞表面抗原为ＣD3+/CD25+与CD3＋/ＨLA—ＤR+、CD3+／CD45RＯ+就是记忆型Ｔ细胞、CD3+/CD45RA+就是纯真型T细胞、

HLＡ-B２7测定

点击

键入文件名,点击Ｓavｅ2.画图

结果

１、positｉvｅ(+)

X－Ｍean=１７、1 2.nｅgａｔｉve(—)

医院检验科完整SOP程序文件

科室管理诊疗规范文件版序：A/O

生效日期：2004年5月30日责任部门：检验科页码：第 10 页共275页

3、科室平面图

科室管理诊疗规范文件版序：A/O

生效日期：2004年5月30日责任部门：检验科页码：第 11 页共275页

科室管理诊疗规范文件版序：A/O

生效日期：2004年5月30日责任部门：检验科页码：第 12 页共275页

流式细胞仪干细胞计数程序

保证流式细胞仪检测外周血或骨髓液中造血干/祖细胞计数的工作质量，旨在保证造血干/祖细胞计数检测正确的操作程序和控制检测结果的精确度。

二、修改程序：

本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：质量主管、授权人（科主任），方可改动。

三、适用范围：

外周血或骨髓液中造血干/祖细胞计数。

四、溯源：

美国BD公司ProCOUNT Progenitor Cell Enumeration Kit 产品说明书(CAT:340498)。

五、实验原理：

ProCOUNT方法根据祖细胞的特征，低SSC、CD45弱阳性、核酸染料阳性及CD34阳性；采用核酸染料/CD34/CD45染色方法，特异识别样本中干/祖细胞，同时，ProCOUNT实验加入TRUCOUNT绝对值计数管作定量分析，计算CD34+细胞cell/ul，从而避免了血球计数仪可能带来的误差。

六、主要试剂：

ProCOUNT Progenitor Cell Enumeration Kit (美国BD Biosciences公司；

CAT:340498)，

其中包括：1、核酸染料/CD34-PE/CD45-PreCP

2、核酸染料/IgG1-PE/CD45-PreCP

3、TruCOUNT Tubes

七、实验操作：

抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml；或新鲜肝

1、标本采集：使用EDTA-K

素抗凝骨髓。

2、染色和固定细胞：

（1）标本管编号A，另取TruCOUNT管两只AT、AC。

（2） AT管加入核酸染料/CD34-PE/CD45-PreCP 20ul。AC管加入核酸染料/IgG1-PE/CD45-PreCP 20ul。

HLA-B27检测SOP

HLA-B27检测操作程序

一、目的：

保证流式细胞仪检测外周血淋巴细胞上HLA-B27表达量检验的工作量，旨在保证HLA-B27检测的正确操作程序和控制检测结果的精确度。

二、修改程序：

本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：质量主管、授权人（科主任），方可改动。

三、适用范围：

外周血中T淋巴细胞HLA-B27表达量检测。

四、溯源：

Anti-HLA-B27 kit(美国BD Biosciences 公司；CA T:340183)

五、试验原理：

HLA-B27属于1型MHC基因。基本上表达在机体所有有核细胞上，特别是淋巴细胞表面有丰富的含量。使用荧光定量标准微球，校正HLA-B27试验条件后，测定样本中T淋巴细胞HLA-B27表达水平。若HLA-B27表达水平大于标准微球设定MARK,则为阳性结果；若HLA-B27表达水平低于标准微球设定的MARK，则为阴性结果。

六、主要试剂：

Anti-HLA-B27 kit(美国BD Biosciences 公司；CA T:340183)

其中包括：1、Anti-HLA-B27-FITC/CD3-PE

2、HLA-B27 Calibration beads

3、FACS Lysing Solution

七、试验操作：

1、标本采集：使用EDTA-K2抗凝真空管，抽取静脉血2ml。

2、染色和固定细胞：

(1)取一只流式专用管，标本管编号A

(2)A管加入Anti-HLA-B27-FITC/CD3-PE 10ul

(3)再加入全血18ul,混匀。

流式细胞仪使用规范

流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种常用的细胞分析仪器，广泛应

用于细胞学、免疫学、生物学、医学等领域。流式细胞仪可以对细胞进行

快速、准确的多参数分析，能够检测和分离不同细胞类型、测定细胞数量、评估细胞活性以及研究细胞表面标记物等。

为了保证流式细胞仪的正常使用，以下是一些流式细胞仪的使用规范

和注意事项。

1.准备工作：

a.检查仪器：确认仪器的状态，包括是否通电、通气、光源是否正常

工作等。

b.清洁样品室：使用无菌纯水或适当的清洁剂擦拭样品室，确保没有

杂物或污染物。

c.校准仪器：根据仪器规定进行标定和校准，确保仪器的准确性和稳

定性。

2.样品准备：

a.细胞处理：合理处理样品，保证单细胞悬浮状态。可以通过胰酶消化、筛选等方法获取单细胞悬浮液。

b.细胞计数：使用合适的细胞计数仪进行细胞计数，计算出所需的细

胞悬浮液浓度。

c.细胞染色：根据实验需求对样品进行适当的荧光染色或抗体标记，

以便在流式细胞仪中检测和分析。

3.流式细胞仪操作：

a.设置参数：根据实验设计和研究目的，设置合适的仪器参数，包括激光器选择、激发波长、检测波长、门控设置等。

b.样品加载：将样品注入流式细胞仪样品室，避免气泡的产生，并确保样品完整进入样品室。

c.数据采集：开始数据采集前，进行流式细胞仪的标定、峰位校正和峰间校正，以保证数据的准确性和可靠性。

d.数据分析：对采集到的数据进行分析和解读，根据实验要求选取合适的分析策略和软件进行数据处理。

4.清洁和保养：

a.实验后清洁：实验结束后，及时清洁仪器，避免样品残留和交叉污染。

医院检验科完整SOP程序文件

科室管理诊疗规范文件

版序：A/O

生效日期：2004年5月30日责任部门：检验科页码：第 10 页共275页

3、科室平面图

科室管理诊疗规范文件

版序：A/O

生效日期：2004年5月30日责任部门：检验科页码：第 11 页共275页

科室管理诊疗规范文件

版序：A/O

生效日期：2004年5月30日责任部门：检验科页码：第 12 页共275页

大型医院检验科完整SOP程序文件

一、科室设置

1、科室各实验室设置及负责人

2、科室人员结构

3、检验中心平面图

4、检验中心工作流程图

二、检验中心工作职责

（一）检验中心各级人员工作职责

1、检验中心主任、副主任工作职责

2、主任检验师工作职责

3、主管检验师工作职责

4、检验师工作职责

5、检验士工作职责

（二）检验中心各实验室工作职责

1、临检室人员岗位职责

2、生化室人员岗位职责

3、免疫室人员岗位职责

4、细菌室人员岗位职责

5、骨髓细胞室人员岗位职责

6、急诊检验人员岗位职责

三、检验中心各项规章制度

1、生物安全管理制度

2、检验质量管理制度

3、血型安全鉴定制度

4、差错事故登记制度

5、安全制度

6、急诊检验制度

7、技术管理制度

8、工作职责制度

9、试剂管理制度

10、天平称量制度

11、实习生管理制度

12、仪器管理制度

13、标本管理制度

14、档案管理制度

15、为民服务公约

16、细菌培养室无菌制度

17、同位素实验室管理制度

18、会议学习制度

19、请示报告制度

20、保密守则

21、职工考勤制度

22、人事考核制度

23、治安保卫制度

24、消防安全制度

25、业务学习管理制度

26、物资报废制度

27、赔偿制度

28、奖罚制度

29、质量信息反馈制度

30、计算机使用管理制度

31、血常规复查制度

32、卫生制度

四、检验中心标准操作规程

（一）检验中心各类仪器标准操作规程

1、BECKMAN CX9生化操作规程

2、日立7600生化仪操作规程

3、RA-1000生化仪操作规程

4、644电解质仪操作规程

5、SP-4430干式生化仪操作规程

6、拜耳248血气分析操作规程

7、ACCESS化学发光操作规程

NK细胞培养SOP

NK 细胞培养sop

日程：

第0天：NK激活剂的处理，分血

第2天：补液20ml

第4天：补液

第7天：装袋

第9天：补液

第11 天：分袋

第13 天：检菌

第14、15 天：收获

1. 研究背景与目的

采用从病人自体外周血细胞中分离得到的单个核细胞，经体外操作使其扩增活化，再静脉回输，

将其输回病人体内，通过激活体内特异性免疫反应达到杀灭肿瘤细胞目的的一种体细胞治疗方法。

2. 定义和缩写

2.1. NK 自然杀伤细胞

2.2. rhIL-15 人源重组白细胞介素15

2.3. IL-2 白细胞介素

3. 主要仪器、耗材

3.1. 仪器

3.1.1 生物安全柜

3.1.2 流式细胞仪

3.1.3 水平低速离心机

3.1.4 灭菌锅

3.1.5 CO 2 孵箱

3.1.6 倒置显微镜

3.1.7 血细胞记数器

3.1.8 血细胞计数板

3.1.9 移液器

3.1.10 -20℃-4℃冰箱

3.2. 耗材

3.2.1 75cm2培养瓶

3.2.2 225 cm2培养瓶

3.2.3 移液管

3.2.4 15ml、50ml离心管、250ml离心管

3.2.5 医用塑胶手套

3.2.6 一次性帽子、手套

3.3. 试剂

3.3.1 无血清培养液

3.3.2 IL-2 (100万IU/瓶)

3.3.3 IL-15

3.3.4 0.4%苔盼蓝溶液

3.3.5 生理盐水

3.3.6 人淋巴细胞分离液

3.4 原材料

3.4.1 外周血，脐血，骨髓等

4 操作步骤

分血：

4.1 培养瓶的处理：吸取NK细胞激活剂500ul，用生理盐水稀释至6ml，加到75cm 2 的培养瓶中混匀后，放置于37°C。1h后取出备用。

流式细胞仪操作规程

流式仪操作规程

1. 首次操作时务必在负责人的指导下进行。

2. 操作前需检查所有瓶中的液体，鞘液桶补满超纯水（2L），废液桶倒空，清洗液和消毒液不是空的。

3. 清洗液和消毒液配置方法：清洗液为1% BD FACS Cleaning solution(原液为10%，即稀释十倍使用)，消毒液为BD detergent solution concentrate。

4. 开机前，确保样品支架上放置的EP管内至少装500uL ddH2O。

5. 仪器启动期间，软件界面上仪器当前状态会显示黄色的灯，该过程中仪器会用鞘液冲洗液流管路，持续大约13分钟，直到显示绿灯表示仪器和软件连接完成。

6. 根据实验设计选择软件选项，进行上样。

7. 上样完毕后，用SIP程序清洗进样针，根据提示先上2ml 1% FACS Clean，再上2ml ddH2O。

8. 保证清洗液和消毒液的量，在进样针上放2ml ddH2O，轻触（不能超过3秒）仪器上电源键，仪器自动运行13min cleaning the fluidics程序后自动关机。

9. 清理桌面，写好仪器使用记录。

10.将房间卫生整顿好，垃圾带出实验室，负责人检查后方可离开。

流式细胞仪操作规程-SOP

WORD格式

流式细胞仪操作规程目录

1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数

2：活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测

3：HLA-B27测定

4：CD55／CD59测定

5：干细胞检测和绝对计数

6：白血病免疫分型测定

7：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定

8：细胞周期分析

9：活化血小板检测

10：血小板抗体测定

11：红细胞抗体测定

12：粒细胞抗体测定

WORD格式

淋巴细胞亚群测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号：

200年月日起实施

第1版

(共3页)

本规程每2年复审一次

复审日期：年月日

复审人：

规程编写者：

审批者：

批准日期：年月日

文件分发部门和／或个人

院档案室保管者：

检验科主任：

检验科实验室：

淋巴细胞亚群测定

方法

流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)

原理：

双/三色/四色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，

与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式

细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：

CD3-，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4；+抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8；+NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count组会自动得出绝对计数。

标本采集与处理

受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。

流式细胞仪操作规程-SOP

流式细胞仪操作规程目录

1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数

2：活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测

3：HLA-B27测定

4：CD55／CD59测定

5：干细胞检测和绝对计数

6：白血病免疫分型测定

7：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定8：细胞周期分析

9：活化血小板检测

10：血小板抗体测定

11：红细胞抗体测定

12：粒细胞抗体测定

淋巴细胞亚群测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号：

200 年月日起实施

第1版

(共3页)

本规程每2年复审一次

复审日期：年月日

复审人：

规程编写者：

审批者：

批准日期：年月日

文件分发部门和／或个人

院档案室保管者：

检验科主任：

检验科实验室：

淋巴细胞亚群测定

点击

3色

点击

（命名，点击save）画图

此图为CD45圈门

填写Flow-Count的浓度

活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的测定

HLA-B27测定

点击

X-Mean=17.1 negative(-)

X-Mean=1.2 X-Mean=5.8

CD55/CD59测定

2.RBC: abnormal

干细胞检测和绝对计数

白血病免疫分型测定

T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测

细胞周期分析

2.画图

血小板膜表面抗体测定

红细胞膜蛋白结构测定（红细胞抗体）

粒细胞抗体测定

T淋巴细胞亚群检测操作程序

一、目的：

保证流式细胞仪检测外周血中T淋巴细胞亚群检验的工作质量，旨在保证正确的T淋巴细胞亚群检测标准操作程序和控制检测结果的精确度与准确度.

二、修改程序:

本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：质量主管、授权人（科主任)，方可改动。

三、适用范围：

外周血中T淋巴细胞亚群的绝对计数检测.

四、实验原理：

人的T淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为二大类：辅助/诱导T细胞和抑制/细胞毒T细胞。辅助/诱导T淋巴细胞表达CD3和CD4；抑制/细胞毒T细胞表达CD3和CD8。利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料以及绝对计数管，即可以把T淋巴细胞区分为两种亚型，进面得到各亚群的绝对值.

六、主要试剂：

CD4—FITC／CD8-PE／CD3-APC／CD45-PC7 (美国BCs公司；CAT:IM3548),

七、实验操作：

抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml.

1、标本采集：使用EDTA—K

2、染色和固定细胞：

（1）标本管编号A，取一只流式专用管A1。

（2） A1管加入CD4-FITC／CD8—PE／CD3-APC／CD45-PC7 20ul。

（3） A1管中再加入全血100ul，混均。

（4）置室温，避光孵育15min。

（5）加入FACSLysing溶血液2。0ml，置室温,避光孵育10min。

（6） 300g离心5min，弃上清液。

（7） PBS洗涤细胞两次，300g离心5min,弃上清液。

3、上机检测;分析结果；打印实验报告。

中检院送检细胞制剂检定项目SOP

1.人脐带间充质干细胞P4代成品细胞质量标准 (2)

2.细胞流式检测标准操作程序 (4)

3.逆转录病毒PERT法检测标准操作程序 (8)

4.细胞基因组DNA提取操作标准流程 (10)

5.细胞基因组RNA提取操作标准流程 (12)

6.病毒PCR法检测标准操作程序Ⅰ (14)

7.病毒PCR法检测标准操作程序Ⅱ (16)

8.hUC-MSCs免疫学反应检测标准操作程序 (19)

9.hUC-MSCs成骨诱导分化标准操作程序 (21)

10.hUC-MSCs成脂诱导分化标准操作程序 (22)

11.细胞计数台盼蓝染色法标准操作程序 (25)

12.细胞周期检测标准操作程序 (26)

13.hUC-MSCs端粒酶检测标准操作程序 (28)

14.hUC-MSCs软琼脂克隆形成实验标准操作程序 (31)

人脐带间充质干细胞P4代成品细胞质量标准

细胞流式检测标准操作程序

1 目的：对细胞表面抗原进行流式鉴定，保证检测的准确性。

2 范围：细胞流式检测的全过程

3 责任人：技术部

4 内容

4.1 仪器和试剂

4.1.1 仪器设备：流式细胞仪（FACS Calibur TM）、台式离心机、1000µL微量移液枪、100µL

微量移液枪、10µL微量移液枪。

4.1.2 试剂以及耗材：FITC单克隆抗体、APC 单克隆抗体、PE单克隆抗体、PerCP 单克隆

抗体、相应的同型对照；1XPBS；鞘液专用流式管、枪头。

4.1.3 样本准备

4.1.3.1 将样本按条码号顺序排列好，每份样本按照检测抗体种类的需要取流式专用管若