2017年主管检验技师考试临床免疫学和免疫检验讲义第十三章免疫组织化学技术

第十三章免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。

第一节概述免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。

一、标本的处理（一）标本的主要来源1.活体组织：应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中。

减少对组织标本的损伤与挤压。

2.体液、穿刺液：可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。

3.培养细胞：悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定。

（二）标本的固定与保存1.标本固定的目的：使细胞内蛋白质凝固，细胞内分解酶反应终止，以防止细胞自溶，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败和在后续组织制备中的细胞结构和成分的改变。

标本的固定应以不损伤细胞形态，不干扰固定后抗原的识别和结合为原则。

2.固定剂的选择：蛋白质类抗原，可用乙醇或甲醇固定；微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定；如需除去病毒的蛋白质外壳，可使用胰蛋白酶；多糖类抗原用10%福尔马林固定或以微火加热固定；如有黏液物质存在，应用透明质酸酶等处理除去；类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时，需用有机溶剂（乙醚、丙酮等）处理除去类脂。

组织标本常规固定液为中性缓冲甲醛。

3.制片方法的评价：冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。

首选冷冻切片。

其操作简便，可避免石蜡切片因固定（甲醛）、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失，适用于不稳定的抗原。

石蜡切片是研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织细胞结构的理想方法，而且可用在陈旧石蜡包埋材料免疫组化的回顾性研究。

切片薄而有连续性，可长期保存。

但对抗原的保存不如冷冻切片。

二、抗原的保存与修复在制片过程中，由于广泛的蛋白交联可使组织中某些抗原决定簇发生遮蔽，致使抗原信号减弱或消失。

因此，使组织抗原决定簇重新暴露，即抗原修复是免疫组织化学技术中的重要步骤。

常用的抗原暴露、修复方法有：酶消化法；盐酸水解法；微波法；高压锅法；煮沸法。

三、抗体的处理与保存（一）抗体的选择：多克隆抗体广泛用于石蜡包埋的组织切片，假阴性几率低，但特异性不如单克隆抗体，有时会造成抗体的交叉反应。

单克隆抗体特异性强，但敏感性不够高。

（二）抗体的稀释：抗原抗体反应要求有正确的比例，过量或不足均不能达到预期结果。

故需进行预实验，摸索抗体的最佳稀释度。

（三）抗体的保存：保存抗体时，要注意保持抗体的生物活性，防止抗体蛋白质变性，否则会降低抗体效价，甚至失效。

四、免疫组化的结果判断（一）对照的设立：设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，主要针对第一抗体进行，常用的对照有阳性对照和阴性对照。

1.阳性对照采用已知抗原阳性的标本与待检标本同时进行免疫组织化学染色，对照切片的阳性将证明整个显色程序的正确。

尤其在待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要。

2.阴性对照用确证不含已知抗原的标本作对照，结果呈阴性。

只有在阴性对照成立时，方可判定检测结果。

主要目的在于排除假阳性。

（二）阳性结果：阳性细胞的显色分布有三种类型：①细胞质；②细胞核；③细胞膜表面。

免疫组织化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。

（三）阴性结果及抗原不表达：阴性结果不能简单地认为具有否定意义，即使只有少数细胞阳性（只要是在抗原所在部位）也应视为阳性表达。

（四）特异性和非特异性显色的鉴别：特异性反应常分布于特定抗原部位，具有结构性，显色强度不一。

非特异性反应无一定的分布规律，常为切片边缘、刀痕或皱褶部位，坏死或挤压的细胞区域，常成片均匀着色。

非特异性反应由于细胞内抗原含量不同，特异性反应的显色强度不一。

如果细胞之间显色强度相同或者细胞和周围结缔组织无明显区别的着色，常提示为非特异性反应。

其他在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性显色，有时可见非特异性显色和特异性显色同时存在，过强的非特异性显色背景可影响结果判断。

（五）免疫组化结果与苏木素-伊红染色（HE）切片结果：当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时，应结合临床资料，如性别、年龄、部位、X线等影像学及实验室结果综合分析，不能简单地用免疫组化检查结果推翻HE切片诊断。

五、质量控制抗体的质量是免疫组化染色技术成功的关键。

使用前应了解第一抗体（即特异性抗体）和第二抗体（桥联抗体）的特异性和敏感性；通过预实验决定抗体的最佳稀释度；在已知阳性和阴性的标本上观察实验结果的符合情况。

试剂的质量控制包括合适的稀释度、稀释剂、孵育温度和时间等。

操作过程质量控制1.实验操作需严格按照标准化操作步骤进行，关注日间和操作人员间的变异情况。

此外还应包括对试剂的复溶及试剂的有效性进行质量控制。

直接染色法可选择空白试验和替代试验；间接法、三步法可采用替代试验和吸收试验进行质量控制。

2.标本的质量控制标本的留取、保存、固定和处理对免疫组化染色至关重要。

用于质量控制的标本包括阴性、阳性或自身组织对照三种类型。

质控品的设置可有助于监控标本制备、操作过程、染色步骤、试剂质量等问题引起的误差。

有时需要对标本进行前处理，以消除内源性过氧化物酶的干扰。

技术设备、仪器和器具的质量控制需定期对相关设备、仪器（含基本实验液体）和器具进行校准。

操作相关工具如吸管、试管、加样枪等需进行消毒，以减少对抗体污染的机会。

第二节免疫荧光组织化学技术免疫荧光组织化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量，以达到对抗原（或抗体）物质定位、定性和定量测定的目的。

组织处理免疫荧光组化技术主要靠观察标本的荧光抗体染色结果作为抗原的鉴定和定位，因此标本的制作十分重要。

在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和包埋过程中不发生溶解和变性，也不扩散至邻近细胞或组织间隙中。

标本要求尽量薄些，以利抗原抗体接触和镜检。

标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，有传染性的标本要注意安全。

（一）标本的类型：基质标本是指固定在玻片上用作抗原的组织、细胞和微生物等，包括：1.涂片和印片：血液、细菌培养物、脑脊液、体腔渗出液和细胞悬液等均可简单地涂抹在玻片上，干燥固定后就可用于荧光抗体染色。

脑脊液、脏器（肝、脾、淋巴结等）、细菌菌落或尸体病变组织可把新鲜切面压印于玻片上做成印片，经固定后再染色。

2.组织切片：最常用。

包括：①冷冻切片：首选的制片方法。

优点：操作简单，组织的抗原性保存好，自发荧光较少，特异荧光强，同时适用于不稳定的抗原；缺点：组织结构欠清晰；②石蜡切片：研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织结构的理想方法，而且可进行回顾性研究。

其优点是组织细胞的精细结构显现清楚，但对抗原的保存量不如冷冻切片，并有组织自发荧光和非特异性荧光，需加酶消化处理。

3.细胞培养标本：细胞在玻片上培养，形成单层，固定后用作抗核抗体等检测的抗原片。

还可使细胞单层生长在玻片上，再用病毒或患者标本感染，然后固定，用荧光抗体染色法检测病毒。

4.活细胞染色：检查淋巴细胞表面抗原以及免疫球蛋白受体、癌细胞表面抗原、血清中抗癌细胞抗体等，均可用活细胞荧光抗体染色法。

当同时观察细胞表面两种抗原的分布和相互关系时，可用双标记法进行染色。

（二）标本的保存标本在固定干燥后，最好立即进行荧光抗体染色及镜检。

如必须保存时，则应保持干燥，置4℃以下保存。

一般细菌涂片或器官组织切片经固定后可保存1个月以上。

但病毒和某些组织抗原标本抗原性丧失很快，数天后就失去其抗原性，需在-20℃以下保存。

第三节酶免疫组织化学技术酶免疫组化技术是在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜识别标本中抗原（抗体）的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。

一、组织处理主要用于标本中抗原（抗体）的定位和定性检测。

该技术染色标本可长期保存，可用普通光镜观察结果，可观察组织细胞的细微结构等优点，尤其是非标记抗体酶免疫组化法的敏感性更优于荧光免疫技术。

酶免疫组化技术可分为酶标记抗体免疫组化技术和非标记抗体酶免疫组化技术两种类型。

二、酶标记抗体免疫组化染色（一）直接法：将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最后用酶底物显色。

直接法的优点在于操作简便及特异性强，缺点是敏感性低，制备的抗体种类有限。

（二）间接法：将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。

间接法的优点是检测敏感性高，制备一种酶标二抗可用于检测多种抗原或抗体。

缺点是特异性不如直接法，而且操作较为繁琐。

三、非标记抗体免疫酶组化染色酶不是标记在抗体上，而是首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，通过免疫学反应将抗酶抗体与组织抗原联系在一起。

该方法避免了酶标记时对抗体的损伤，同时也提高了方法的敏感性。

（一）酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色。

酶桥法较酶标法的敏感性有所提高，但操作分四步，较为复杂。

在酶桥法中，如果抗酶抗体与酶结合弱，在操作中酶常被冲洗掉；如果酶标记在非特异性抗体上就会存在背景着色问题；如果抗酶抗体的非特异性成分与桥抗体结合，就会与抗酶抗体竞争桥抗体结合位点，影响方法的敏感性。

（二）PAP法：PAP法是在酶桥法基础上的改良。

PAP法首先将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶组成可溶性复合物（PAP复合物）。

该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。

通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与PAP复合物的抗酶抗体连接起来，此时要求特异性第一抗体与第三抗体的动物种属相同。

与酶桥法相比，PAP法操作简便，分三步。

PAP复合物结构稳定，避免了酶桥法中标记易脱落的弊端；敏感性高；背景着色淡，因为即使桥抗体存在有非特异性抗体的可能，但因其与第一抗体并非同种属，故不能与抗酶抗体结合。

并且，如果抗酶抗体中存在着非抗酶抗体，当其与桥抗体或组织成分结合时，由于其不能与酶结合，也不会产生非特异性反应。