甲状腺乳头状癌细胞线粒体DNA D 环区的突变
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ｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄ—ｌｏｏｐ ｏｆ ｍｔＤＮＡ ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ
ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｙｒｏｉｄ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｍ ｅｔｈｏｄｓ
合酶所必需的蛋 白质亚单位 ，涉及线粒体蛋 白质合
基金项 目：国家 自然科学基 金资 助项 目（３０３７１２３６） 作 者 单 位 ：２０００３２ 上海 ，复 旦 大 学 附 属 肿 瘤 医 院 头 颈外 科 （孙团起 、吴 毅、嵇庆海 、王卓 颖 ）；复旦大 学上 海医学 院流行病 学教 研室（边建 超）
ｃａｒｃｉｎｏｍａ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｔｈｙｒｏｉｄ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ； Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｐａｐｉｌｌａｒｙ； ＤＮＡ，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ； Ｍｕｔａｔｉｏｎ；
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
D 肿瘤发生机制的研究长期以来主要集 中在核内
ＤＮＡ变化 ，但近几年来 ，作 为哺乳 动物细胞 中惟一
D 理医师的指导下避开钙化和胶原化 区域取其癌细胞
丰 富部位 （癌 细 胞 比例 大 于 ７０％ ）。外 周 静 脉 血 用
D 于提取 淋 巴细胞 。 C 二 、ｍｔＤＮＡ提取
细胞 ，则定 义 为突变 。为 除外组 织 特异性 多态 ，这种 突变也不出现在癌旁正常甲状腺组织。为除外 系统 误差 ，对 存 在 ｍｔＤＮＡ突 变 的 区域 重 新 进 行 ＰＣＲ 反 应和 ＤＮＡ测序 ，进一步验证 ，ｍ 。多态性出现频率 计 算公 式为 ：
D 列 进行 比对 。如果序列变化 同时出现在癌组织 D 和外 周 淋 巴 细 胞 ，称 之 为 多 态 性 ，在 数 据 库
（ＭＩＴＯＭＡＰ、ｍｔＤＢ和 ＧｅｎＢａｎｋ）没 有 记 录 的 称 为 新
C 的多态性 ；如果这种序列变化没有 出现在外周 淋巴
女 ２３例 （ＵＩＣＣ ２００２ 临 床 分 期 ：Ｉ期 ２８例 ，Ⅱ期 ３例 ，Ⅲ期 ３例 ，Ⅳ期 １例 ）。癌组 织和癌旁正常组 织均经病理证实后立 即液氮冷冻 ，其 中癌组织在病
ＨＶＲ．ＩＩ区 （６３～３２２） 。
ｄＮＴＰＳ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ），５ Ｕ／Ｉ．ｚＬ 的 ＴａｑＤＮＡ 聚 合 酶
甲状腺癌虽然 只 占所有恶性肿瘤 的 １％ ，但却 １ ＩＬＬ和 ５ Ｌ 的 ｍｔＤＮＡ。 ＰＣＲ 仪 （ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ
是最常见的内分泌系统 肿瘤 ，近年来世界范围内其 发病有逐渐增加趋势 ，乳头状癌是 其最常见的病理 类 型 （占 ８５％ ） 。本 研 究 通 过 对 ３５例 甲状 腺 乳 头状 癌标本 及外 周血 淋 巴细 胞先 抽 提 ｍｔＤＮＡ，再 行 ＰＣＲ产 物直 接 测 序 的 方 法 对 Ｄ环 中 的 ＨＶＲ—Ｉ和 ＨＶＲ．ＩＩ区进行检测 ，探讨 ｍｔＤＮＡ 的多态性和突变 与中 国汉 族人 甲状 腺乳 头状 癌发 生 的关 系。
成 的 ２个 ｒＲＮＡ和 ２２个 ｔＲＮＡ；它 的非 编 码 区 Ｄ环 （Ｄ．１ｏｏｐ）区 ，主要 控制 ｍｔＤＮＡ的复 制 和转 录 Ｊ。 由 于 ｍｔＤＮＡ缺乏 组蛋 白的保 护 和有效 的 ＤＮＡ损 伤修 复系统 ，加上对放射损伤和氧损伤的高度易感性 ，使
通 讯 作 者 ：吴 毅 ，Ｅｍａｉｌ：ｙｗｕ＠ ｒｄｄｂ．ｓｈａｎｇｈａｉ．ｇｏｖ．ｃｎ
ｔｈｉｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｒａｔｅ ｏｆ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍ ｏｒｓ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｒ ｉｇｉｎ． ａｎｄ ｆｕｒ ｔｈｅｒ
C ｗｏｒｋ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｉｓ ｍ ｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｙｒｏｉｄ ｐａｐｉｌｌａｒ ｙ
孙 团起 吴毅 嵇 庆 海 边 建超 王 卓颖
【摘要 】 目的 研究线粒 体 ＤＮＡ Ｄ环 （Ｄ—ｌｏｏｐ）区在 甲状 腺乳 头状癌 中的 突变情况 。方法 对 ３５例 甲状腺乳 头状癌 患者的癌组织 和外周 血淋 巴细胞抽 提线粒 体 ＤＮＡ，再 行 ＰＣＲ产物直 接测序 的 方法对线粒体 Ｄ环 区的两个高变 区（ＨＶＲ—Ｉ和 ＨＶＲ一Ⅱ）进行突变检测 。结果 在 ３５例 甲状腺乳 头 状癌患者 中有 ２例发 现突变 ，突变率 为 ５．７％ 。突变位点 ５个 ，都 在 ＨＶＲ一１１区 ，均 为同质性 突变 ，其 中 ２个属于微卫星不稳 定 ，其余 ３个属于碱基替 代突变。研究 同时发 现 ２个 尚未报 道的新 的多态 位 点（ｎｔ３２４：ｃ—Ｇ，ｎｔ１６０９２： Ａ）。结论 与其他上皮 来源肿瘤 相 比 ，线 粒体 ＤＮＡ Ｄ环区在 甲状腺 乳
ｓｙｓｔｅｍ ９７００，美 国 ）反应 的循 环 参 数 为 ：起 始 变 性 温 度 ９４℃ ，４ ｍｉｎ；以下 过程 进行 ３５个循 环 ：变 性 温度 ９４℃ ，３０ Ｓ；退火温度 ５５℃，３０ Ｓ；延伸温度 ７２℃，
D ３０ Ｓ。最后延 伸 温度 ７２℃ ，７ ｍｉｎ。取 １ Ｉ．ｚＬ的 ＰＣＲ
组织中都存在着高频率 的 ｍｔＤＮＡ突变 ，而这些突变 包 括 １０ ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ的两 种 引 物各 ２ ＩＬＬ，５ 的 １０×
主要集 中在 ｍｔＤＮＡ的 Ｄ环区 （１６０２４～５７６），尤其 ＰＣＲ缓 冲液 ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ的 ＭｇＣ１２溶 液 ３ ＩＬＬ，２ ＩＬＬ
是 其 两 个 高 变 区 ：ＨＶＲ．Ｉ区 （１６０２４ ～１６３２４）和 的三磷 酸 脱氧 核苷 （ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ，
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７８２
生 Ｏ月第 ４１卷第 １Ｏ期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｖｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕ ．０ｃｔ０ｈｅｒ ２００６．Ｖ０１ ４１．Ｎ０．１０
实 验 研 究
甲状 腺 乳 头 状 癌 细 胞 线 粒 体 ＤＮＡ Ｄ环 区 的突变
CDD
头状 癌中的突变率 不高 ，其与 甲状腺乳 头状 癌发 生的关系仍有待于进一 步研究 。
【关键词】 甲状腺肿瘤 ； 癌 ，乳 头状 ； ＤＮＡ，线粒体 ； 突变 ； 多态性 ，单核苷酸
D Ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍ ｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｙｒｏｉｄ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍ ａ ＳＵＮ Ｔｕａｎ—ｑｉ
液 中 ，离心 分层 去 除细 胞 核 ，然 后 裂解 线粒 体 膜 ，再
D 通过相分离技术和 Ｓｉｌｉｃａ膜选择性 吸附 ＤＮＡ的原 C 理获取高纯度的 ｍｔＤＮＡ。由于纯化 的 ｍｔＤＮＡ非 常
结 果
本 组测 序结果 与 剑桥序 列 比对后 ，在 ３５例 甲状 腺乳头状癌患者中共发现了 ２９４个多态性改变 ，其 中在 ＨＶＲ．Ｉ区域 （包 含 ３０１个 碱 基 ）发 现 多 态性 改 变 １１９个 ，１个 标 本 中最 少 发 现 １个 ，最 多 发 现 ５个 ，多态性发 生频 率 为 １．１３％ ；ＨＶＲ．ＩＩ区域 （包 含
ｄｅｔｅｃｔｅｄ，２９２ ｗｅｒｅ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｒｅｃｏｒｄｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ｗｈｅｒｅａｓ ２ ｗｅｒｅ ｎｅｗ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ｎｔ３２４：Ｃ—｝Ｇ，
D ｎｔ１６０９２：Ｔ—｝Ａ）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄ．１ｏｏｐ ｏｆ ｍｔＤＮＡ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｙｒｏｉｄ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｃａｎｃｅｒｓ．
Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ（ＨＶＲ—Ｉ ａｎｄ ＨＶＲ·１１） ｉｎ ｔｈｅ Ｄ·ｌｏｏｐ ｏｆ ｍｔＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｏｆ ３５ ｔｈｙｒｏｉｄ
ｐａｐｉｌｌａｒ ｙ ｃａｎｃｅｒｓ ａｎｄ ｍａｔｃｈｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒ ｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ ｔｏ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｍａｔｃｈｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｎｏｒｍ ａｌ ｔｈｙｒｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ，５ ｓｏｍａｔｉｃ
资 料 与方法
一 、 病 例来 源 采 集 ２００４年 １至 ５月 间 在复 旦 大学 附属 肿 瘤 医院头 颈外 科 手 术 切 除 的 甲状 腺 乳 头 状 癌 标本 ３５ 例 ，同时 收取 同一 患 者 癌 旁 正 常 甲状 腺组 织 （距 离 肿瘤 组织 １ ｃｍ）和 ２ ｍｌ静 脉 血 。本 组 患 者 均 为汉 族 ，年龄 １６～７２岁 ，中位 年龄 ３９岁 ；其中男 １２例 ，
得 ｍｔＤＮＡ损伤 后 突变 率 比核 内 ＤＮＡ 高达 １０—１００
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２００６年 １０月第 ４１卷第 １
』Ｑ ！
倍 ］。最 近 的研 究 已经 表 明 ，在 很 多上 皮来 源 肿 瘤 ＴＡＣＣＧＣ．３ （４１０ ３１），ＰＣＲ的反 应 体 系 为 ５０ Ｌ，
受 到重 视 。１９８１年 Ａｎｄｅｒｓｏｎ等 … 在 Ｎａｔｕｒｅ杂 志上 由基形 成 、凋亡 等重 要功 能 ，其功 能 障碍是 肿瘤 细胞
首次 发表 了人类 ｍｔＤＮＡ基 因组 的全 核苷 酸 序 列 、结 的重要 特征 。ｍｔＤＮＡ为 包含 有 １６ ５６９ ｂｐ的双链 闭
构及 功 能 。随着对 ｍｔＤＮＡ研究 的不 断进 展 ，人们 发 环 结构 ，它 编码 ３７个 基 因 ，包括 １３个 呼吸链 和 ＡＴＰ
ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ２ ｐａｔｉｅｎｔｓ（５．７％ ）ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ．Ｔｗｏ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｉｎｓｅｒ ｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃ ｉｎ ａ ｐｏｌｙ—ｃｙｔｉｄｉｎｅ（ｎｔ３０３）
D ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ，ａｎｄ ３ ａｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ７３，１５２ ａｎｄ １９４ ｉｎ ＨＶＲ一１１． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ．ｏｆ ｔｈｅ ２９４ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ
D 存在 的核外遗传物质 的线粒体 ＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ C ＤＮＡ，简称 ｍｔＤＮＡ）在肿瘤 发生 中的作 用正在 日益
现 ｍｔＤＮＡ结构和功能的改变不仅和神经肌肉病变、 帕金森病 、衰老等有关 ，而且在肿瘤发生过程中也发 挥着 重要 作 用 。
线粒体位于细胞质内，涉及人体能量代谢 、氧 自
，
，
Ｑ 一ｈａｉ，ＢＩＡＮ Ｊｉａｎ—ｃｈａｏ，ＷＡＮＧ Ｚｈｕｏ·ｙｉｎｇ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００３２， Ｃｈｉｎａ
D Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＷＵ Ｙｉ，ＥｍａｉＺ：ｙｗｕ＠ ｒｄｄｂ．ｓｈａｎｇｈａｉ．ｇｏｖ．ｃｎ
多 态性 出现频率 （％）＝
ｘ１００％
为避免 核 内拟 基 因 （ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ）的干 扰 ，提 高 ＰＣＲ扩增 的效率和特异性 ，采用线粒体 ＤＮＡ纯化试 剂盒 （Ｖ．ｇｅｎｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌｉｍｉｔｅｄ，美 国 ）。先 通 过
D 较温和的裂解液破坏细胞 质膜 ，将线粒体释放到溶
产物在 ２％的琼脂糖凝胶上 电泳 ，确认所测 片段成
D 功扩 增后 ，用 ＥＺ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ纯化 试剂 盒 对 ＰＣＲ产 C 物 进行 纯化 。
四 、测序 在 ＡＢＩｐｒｉｓｍ３７３０测序仪上，采用双脱氧四色荧 光 染料 标记 法 原 理 对 ＰＣＲ产 物 自动 测 序 。将 所 测 Ｄ 环 区 的 ＨＶＲ．Ｉ和 ＨＶＲ．ＩＩ片 段 序 列 与 剑 桥 序
ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｙｒｏｉｄ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｍ ｅｔｈｏｄｓ
合酶所必需的蛋 白质亚单位 ，涉及线粒体蛋 白质合
基金项 目：国家 自然科学基 金资 助项 目（３０３７１２３６） 作 者 单 位 ：２０００３２ 上海 ，复 旦 大 学 附 属 肿 瘤 医 院 头 颈外 科 （孙团起 、吴 毅、嵇庆海 、王卓 颖 ）；复旦大 学上 海医学 院流行病 学教 研室（边建 超）
ｃａｒｃｉｎｏｍａ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｔｈｙｒｏｉｄ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ； Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｐａｐｉｌｌａｒｙ； ＤＮＡ，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ； Ｍｕｔａｔｉｏｎ；
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
D 肿瘤发生机制的研究长期以来主要集 中在核内
ＤＮＡ变化 ，但近几年来 ，作 为哺乳 动物细胞 中惟一
D 理医师的指导下避开钙化和胶原化 区域取其癌细胞
丰 富部位 （癌 细 胞 比例 大 于 ７０％ ）。外 周 静 脉 血 用
D 于提取 淋 巴细胞 。 C 二 、ｍｔＤＮＡ提取
细胞 ，则定 义 为突变 。为 除外组 织 特异性 多态 ，这种 突变也不出现在癌旁正常甲状腺组织。为除外 系统 误差 ，对 存 在 ｍｔＤＮＡ突 变 的 区域 重 新 进 行 ＰＣＲ 反 应和 ＤＮＡ测序 ，进一步验证 ，ｍ 。多态性出现频率 计 算公 式为 ：
D 列 进行 比对 。如果序列变化 同时出现在癌组织 D 和外 周 淋 巴 细 胞 ，称 之 为 多 态 性 ，在 数 据 库
（ＭＩＴＯＭＡＰ、ｍｔＤＢ和 ＧｅｎＢａｎｋ）没 有 记 录 的 称 为 新
C 的多态性 ；如果这种序列变化没有 出现在外周 淋巴
女 ２３例 （ＵＩＣＣ ２００２ 临 床 分 期 ：Ｉ期 ２８例 ，Ⅱ期 ３例 ，Ⅲ期 ３例 ，Ⅳ期 １例 ）。癌组 织和癌旁正常组 织均经病理证实后立 即液氮冷冻 ，其 中癌组织在病
ＨＶＲ．ＩＩ区 （６３～３２２） 。
ｄＮＴＰＳ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ），５ Ｕ／Ｉ．ｚＬ 的 ＴａｑＤＮＡ 聚 合 酶
甲状腺癌虽然 只 占所有恶性肿瘤 的 １％ ，但却 １ ＩＬＬ和 ５ Ｌ 的 ｍｔＤＮＡ。 ＰＣＲ 仪 （ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ
是最常见的内分泌系统 肿瘤 ，近年来世界范围内其 发病有逐渐增加趋势 ，乳头状癌是 其最常见的病理 类 型 （占 ８５％ ） 。本 研 究 通 过 对 ３５例 甲状 腺 乳 头状 癌标本 及外 周血 淋 巴细 胞先 抽 提 ｍｔＤＮＡ，再 行 ＰＣＲ产 物直 接 测 序 的 方 法 对 Ｄ环 中 的 ＨＶＲ—Ｉ和 ＨＶＲ．ＩＩ区进行检测 ，探讨 ｍｔＤＮＡ 的多态性和突变 与中 国汉 族人 甲状 腺乳 头状 癌发 生 的关 系。
成 的 ２个 ｒＲＮＡ和 ２２个 ｔＲＮＡ；它 的非 编 码 区 Ｄ环 （Ｄ．１ｏｏｐ）区 ，主要 控制 ｍｔＤＮＡ的复 制 和转 录 Ｊ。 由 于 ｍｔＤＮＡ缺乏 组蛋 白的保 护 和有效 的 ＤＮＡ损 伤修 复系统 ，加上对放射损伤和氧损伤的高度易感性 ，使
通 讯 作 者 ：吴 毅 ，Ｅｍａｉｌ：ｙｗｕ＠ ｒｄｄｂ．ｓｈａｎｇｈａｉ．ｇｏｖ．ｃｎ
ｔｈｉｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｒａｔｅ ｏｆ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍ ｏｒｓ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｒ ｉｇｉｎ． ａｎｄ ｆｕｒ ｔｈｅｒ
C ｗｏｒｋ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｉｓ ｍ ｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｙｒｏｉｄ ｐａｐｉｌｌａｒ ｙ
孙 团起 吴毅 嵇 庆 海 边 建超 王 卓颖
【摘要 】 目的 研究线粒 体 ＤＮＡ Ｄ环 （Ｄ—ｌｏｏｐ）区在 甲状 腺乳 头状癌 中的 突变情况 。方法 对 ３５例 甲状腺乳 头状癌 患者的癌组织 和外周 血淋 巴细胞抽 提线粒 体 ＤＮＡ，再 行 ＰＣＲ产物直 接测序 的 方法对线粒体 Ｄ环 区的两个高变 区（ＨＶＲ—Ｉ和 ＨＶＲ一Ⅱ）进行突变检测 。结果 在 ３５例 甲状腺乳 头 状癌患者 中有 ２例发 现突变 ，突变率 为 ５．７％ 。突变位点 ５个 ，都 在 ＨＶＲ一１１区 ，均 为同质性 突变 ，其 中 ２个属于微卫星不稳 定 ，其余 ３个属于碱基替 代突变。研究 同时发 现 ２个 尚未报 道的新 的多态 位 点（ｎｔ３２４：ｃ—Ｇ，ｎｔ１６０９２： Ａ）。结论 与其他上皮 来源肿瘤 相 比 ，线 粒体 ＤＮＡ Ｄ环区在 甲状腺 乳
ｓｙｓｔｅｍ ９７００，美 国 ）反应 的循 环 参 数 为 ：起 始 变 性 温 度 ９４℃ ，４ ｍｉｎ；以下 过程 进行 ３５个循 环 ：变 性 温度 ９４℃ ，３０ Ｓ；退火温度 ５５℃，３０ Ｓ；延伸温度 ７２℃，
D ３０ Ｓ。最后延 伸 温度 ７２℃ ，７ ｍｉｎ。取 １ Ｉ．ｚＬ的 ＰＣＲ
组织中都存在着高频率 的 ｍｔＤＮＡ突变 ，而这些突变 包 括 １０ ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ的两 种 引 物各 ２ ＩＬＬ，５ 的 １０×
主要集 中在 ｍｔＤＮＡ的 Ｄ环区 （１６０２４～５７６），尤其 ＰＣＲ缓 冲液 ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ的 ＭｇＣ１２溶 液 ３ ＩＬＬ，２ ＩＬＬ
是 其 两 个 高 变 区 ：ＨＶＲ．Ｉ区 （１６０２４ ～１６３２４）和 的三磷 酸 脱氧 核苷 （ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ，
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生 Ｏ月第 ４１卷第 １Ｏ期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｖｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕ ．０ｃｔ０ｈｅｒ ２００６．Ｖ０１ ４１．Ｎ０．１０
实 验 研 究
甲状 腺 乳 头 状 癌 细 胞 线 粒 体 ＤＮＡ Ｄ环 区 的突变
CDD
头状 癌中的突变率 不高 ，其与 甲状腺乳 头状 癌发 生的关系仍有待于进一 步研究 。
【关键词】 甲状腺肿瘤 ； 癌 ，乳 头状 ； ＤＮＡ，线粒体 ； 突变 ； 多态性 ，单核苷酸
D Ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍ ｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｙｒｏｉｄ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍ ａ ＳＵＮ Ｔｕａｎ—ｑｉ
液 中 ，离心 分层 去 除细 胞 核 ，然 后 裂解 线粒 体 膜 ，再
D 通过相分离技术和 Ｓｉｌｉｃａ膜选择性 吸附 ＤＮＡ的原 C 理获取高纯度的 ｍｔＤＮＡ。由于纯化 的 ｍｔＤＮＡ非 常
结 果
本 组测 序结果 与 剑桥序 列 比对后 ，在 ３５例 甲状 腺乳头状癌患者中共发现了 ２９４个多态性改变 ，其 中在 ＨＶＲ．Ｉ区域 （包 含 ３０１个 碱 基 ）发 现 多 态性 改 变 １１９个 ，１个 标 本 中最 少 发 现 １个 ，最 多 发 现 ５个 ，多态性发 生频 率 为 １．１３％ ；ＨＶＲ．ＩＩ区域 （包 含
ｄｅｔｅｃｔｅｄ，２９２ ｗｅｒｅ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｒｅｃｏｒｄｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ｗｈｅｒｅａｓ ２ ｗｅｒｅ ｎｅｗ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ｎｔ３２４：Ｃ—｝Ｇ，
D ｎｔ１６０９２：Ｔ—｝Ａ）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄ．１ｏｏｐ ｏｆ ｍｔＤＮＡ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｙｒｏｉｄ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｃａｎｃｅｒｓ．
Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ（ＨＶＲ—Ｉ ａｎｄ ＨＶＲ·１１） ｉｎ ｔｈｅ Ｄ·ｌｏｏｐ ｏｆ ｍｔＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｏｆ ３５ ｔｈｙｒｏｉｄ
ｐａｐｉｌｌａｒ ｙ ｃａｎｃｅｒｓ ａｎｄ ｍａｔｃｈｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒ ｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ ｔｏ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｍａｔｃｈｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｎｏｒｍ ａｌ ｔｈｙｒｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ，５ ｓｏｍａｔｉｃ
资 料 与方法
一 、 病 例来 源 采 集 ２００４年 １至 ５月 间 在复 旦 大学 附属 肿 瘤 医院头 颈外 科 手 术 切 除 的 甲状 腺 乳 头 状 癌 标本 ３５ 例 ，同时 收取 同一 患 者 癌 旁 正 常 甲状 腺组 织 （距 离 肿瘤 组织 １ ｃｍ）和 ２ ｍｌ静 脉 血 。本 组 患 者 均 为汉 族 ，年龄 １６～７２岁 ，中位 年龄 ３９岁 ；其中男 １２例 ，
得 ｍｔＤＮＡ损伤 后 突变 率 比核 内 ＤＮＡ 高达 １０—１００
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２００６年 １０月第 ４１卷第 １
』Ｑ ！
倍 ］。最 近 的研 究 已经 表 明 ，在 很 多上 皮来 源 肿 瘤 ＴＡＣＣＧＣ．３ （４１０ ３１），ＰＣＲ的反 应 体 系 为 ５０ Ｌ，
受 到重 视 。１９８１年 Ａｎｄｅｒｓｏｎ等 … 在 Ｎａｔｕｒｅ杂 志上 由基形 成 、凋亡 等重 要功 能 ，其功 能 障碍是 肿瘤 细胞
首次 发表 了人类 ｍｔＤＮＡ基 因组 的全 核苷 酸 序 列 、结 的重要 特征 。ｍｔＤＮＡ为 包含 有 １６ ５６９ ｂｐ的双链 闭
构及 功 能 。随着对 ｍｔＤＮＡ研究 的不 断进 展 ，人们 发 环 结构 ，它 编码 ３７个 基 因 ，包括 １３个 呼吸链 和 ＡＴＰ
ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ２ ｐａｔｉｅｎｔｓ（５．７％ ）ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ．Ｔｗｏ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｉｎｓｅｒ ｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃ ｉｎ ａ ｐｏｌｙ—ｃｙｔｉｄｉｎｅ（ｎｔ３０３）
D ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ，ａｎｄ ３ ａｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ７３，１５２ ａｎｄ １９４ ｉｎ ＨＶＲ一１１． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ．ｏｆ ｔｈｅ ２９４ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ
D 存在 的核外遗传物质 的线粒体 ＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ C ＤＮＡ，简称 ｍｔＤＮＡ）在肿瘤 发生 中的作 用正在 日益
现 ｍｔＤＮＡ结构和功能的改变不仅和神经肌肉病变、 帕金森病 、衰老等有关 ，而且在肿瘤发生过程中也发 挥着 重要 作 用 。
线粒体位于细胞质内，涉及人体能量代谢 、氧 自
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Ｑ 一ｈａｉ，ＢＩＡＮ Ｊｉａｎ—ｃｈａｏ，ＷＡＮＧ Ｚｈｕｏ·ｙｉｎｇ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００３２， Ｃｈｉｎａ
D Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＷＵ Ｙｉ，ＥｍａｉＺ：ｙｗｕ＠ ｒｄｄｂ．ｓｈａｎｇｈａｉ．ｇｏｖ．ｃｎ
多 态性 出现频率 （％）＝
ｘ１００％
为避免 核 内拟 基 因 （ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ）的干 扰 ，提 高 ＰＣＲ扩增 的效率和特异性 ，采用线粒体 ＤＮＡ纯化试 剂盒 （Ｖ．ｇｅｎｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌｉｍｉｔｅｄ，美 国 ）。先 通 过
D 较温和的裂解液破坏细胞 质膜 ，将线粒体释放到溶
产物在 ２％的琼脂糖凝胶上 电泳 ，确认所测 片段成
D 功扩 增后 ，用 ＥＺ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ纯化 试剂 盒 对 ＰＣＲ产 C 物 进行 纯化 。
四 、测序 在 ＡＢＩｐｒｉｓｍ３７３０测序仪上，采用双脱氧四色荧 光 染料 标记 法 原 理 对 ＰＣＲ产 物 自动 测 序 。将 所 测 Ｄ 环 区 的 ＨＶＲ．Ｉ和 ＨＶＲ．ＩＩ片 段 序 列 与 剑 桥 序