nLUC,cLUC载体图谱

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质粒图谱大全

（转载）一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA二.克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS( )L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39band40b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41and42 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems43.1and44 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNAProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKits四.PGEX系列表达载体TEcoR?pGEX-1I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3五.PTYBsystemPTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-)pCDNA3.1( )pPICZalphaApGAPZαAPYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。

质粒图谱查询方法

3.google scholar: / 有些质粒是经过改造的，所以通过上述方法不能查询到相应信息。这时，可以在google scholar中输入质粒名称，可以直观地看哪些学者在何文章中使用了该质粒，从而可了解到质粒的来源;或者籍此向作者咨询或索取。 4.尝试从各大生物公司，例如invitrogen网站查询. 5. 这个网站收录了大量图谱： http://www.embl-hamburg.de/~geerlof/webPP/vectordb/bact_vectors/table.html
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file:///D|/中科院/Selective Serotonin Transporter/质粒信息/质粒图谱查询方法.txt
file:///D|/中科院/Selective Serotonin Transporter/质粒信息/质粒图谱查询方法.txt（第 2／6 页）[2011/8/4 18:39:52]
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0099--pGE-1—Stratagene--RNAi载体 0100--pSUPER.p53—OligoEngine--RNAi载体 0101--palter-ex1--promega 0102--pACYCDuet-1--NOVAGEN 0103--pEX lox(+) Vector—NOVAGEN--原核表达 0104--质粒名称：pBACgus-8 Transfer Plasmid—NOVAGEN--CHUANSUO 0105--pSCREEN?-1b(+) Vector Map—novagen--筛选 0106--PGEX-2T--BD Co--pDsRed2--Clontech 0107--pbgal-Basic—Clontech--mammalian reporter vector 0108—pBI—Clontech--express two genes of interest from a bidirectional tet-responsive promoter 0109--质粒名称：pbgal-Control—Clontech--mammalian reporter vector 0110-- pGEX-5X-1--原核表达 0111--pBI-EGFP—Clontech--pBI-EGFP-- coexpress 0112--pBI-G—Clontech--pBI-G--express b-galactosidase 0113--pBI-GL—Clontech--pBI-GL --express luciferase and b-galactosidase 0114--pCMS-EGFP—Clontech--mammalian expression vector 0115--pd2EYFP-1—Clontech--启动子测定 0116--质粒名称--pd2EYFP-N1—Clontech--融合表达 0117--pd4EGFP-Bid—Clontech--融合表达 Bid 0118--pDNR-CMV—Clontech--pDNR-CMV 0119--pDNR-EGFP Vector—Clontech 0120--pDNR-LacZ –Clontech 0121--pECFP-Endo—Clontech--真核表达0122--pECFP-ER—Clontech--真核表达0123--pEGFP-Actin—Clontech--真核表达0124--pGAD GH--Clontech--酵母表达 0125--pGADT7-Rec –Clontech--酵母表达 0126--pGADT7-RecAB—Clontech--酵母表达 0127--pGADT7-Rec2—Clontech--酵母表达 0128--pGBKT7—Clontech--酵母表达 0129--pHAT 10/11/12—Clontech 0130--pHAT20—Clontech 0131—pHygEGFP—Clontech 0132—pLacZi—Clontech 0133—pM—Clontech--pM is used to generate a fusion of the GAL4 DNA-BD 0134--pPKCa-EGFP—Clontech 0135--pPKCb-EGFP—Clontec 0136--pSIREN-DNR Vector—Clontech--RNAi 0137--pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector—Clontech--RNAi 0138--pSIREN-RetroQ—Clontech--RNAi 0139--pIRES-EYFP—Clontech--RNAi 0140--pSRE-Luc—Clontech--RNAi 0141--pTK-neo—novagen--原核表达 0142--pZsGreen Vector—Clontech--pZsGreen is a pUC19-derived prokaryotic expression vector 0143--pTandem-1—novagen--原核表达 0144--pZsGreen1-C1Vector—Clontech----真核表达 0145--质粒名称：M13mp18—novagen--原核表达 0146--pZsGreen1-DR Vector—Clontech--真核表达 0147--PZsGreen1-N1 Vector—Clontech --真核表达 0148--T7Select415-1b—novagen----真核表达 0149--pZsYellow Vector—Clontech --真核表达 0150—pTimer—Clontech --真核表达 0151--pTA-Luc—Clontech --真核表达 0152--pTAL-Luc—Clontech --真核表达 0153--pTA-SEAP—Clontech --真核表达 0154--pTAL-SEAP—Clontech --真核表达 0155--pTet-On—Clontech --真核表达 0156--pTet-Off—Clontech --真核表达 0157--pTet-ATF—Clontech --真核表达 0158--pTet-CREB—Clontech --真核表达

真核载体构建

42℃、90sec
不含抗生素的培养基热休克得到细菌的克隆
37℃ 涂布选择性平板 30-60min （合适抗生素）（使质粒扩增）
37℃ 10hr
2.感染（infection）：也称转导（transduction）由噬菌体或病毒介导外源DNA进入宿主细胞的过程有一个：体外包装过程
lDNA ®E-coli 动、植物病毒DNA ®动植物细胞
PCR扩增
vDNA polymerase 高保真酶 primerstar probest Phusion vRich GC sequence primerstar with GC buffer v热启动PCR，Nest PCR
载体构建步骤
v Get the target DNA sequence v Select appropriate vector v PCR primer design v Obtain cell or tissue v PCR amplification v Restriction, ligation and transformation
克隆载体→表达载体
A A
双酶切
表达载体
限制性内切酶
连接
v PCR product:vector 1：10~ 10:1（1：3 ~ 3：1）摩尔比 v At 25 °C for 23 hours or at 16 °C overnight v Inactive T4 DNA ligase (at 70 °C for 10min )
2. 缺点：①高水平表达基因产物易沉淀、凝集、不易折叠 ②基因产物纯化工艺复杂 ③基因产物易受污染（内毒素） ④基因产物对受体菌有毒害作用 ⑤基因产物易被水解 ⑥从安全角度——并不理想 ⑦缺乏基因产物表达后加工机制

拟南芥中与蓝光受体CRY2相互作用蛋白的生化分析

湖南大学硕士学位论文拟南芥中与蓝光受体CRY2相互作用蛋白的生化分析姓名：***申请学位级别：硕士专业：分析化学指导教师：***20091101硕上学位论文摘要隐花色素ＣＲＹ２（ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ２）是植物感受蓝光的光受体之一，它介导了蓝光调节植物的光形态建成反应，如抑制下胚轴的伸长、调节昼夜节律、激活基因转录和调节开花等。

Ｃａｓｈｍｏｒｅ等人１９９３年就确定ＣＲＹ２是植物的蓝光受体，但是直到现在，在蓝光受体ＣＲＹ２信号传导方面的研究一直没有重大突破；因此，首先有必要通过各种分子生物学与遗传学的方法找到与蓝光受体ＣＲＹ２相互作用的蛋白，为进一步研究ＣＲＹ２介导的信号传导途径奠定基础。

本研究首先构建了酵母双杂交载体ｐＢｒｉｄｇｅ—ＣＲＹ２，然后以ｐＢｒｉｄｇｅ·ＣＲＹ２作为Ｂａｉｔ对构建在Ｐｒｅｙ载体ＰＡＣＴｌ中的酵母双杂交文库进行了筛选。

通过筛选酵母双杂交文库发现蓝光下ＣＲＹ２可能与多种蛋白发生相互作用。

其中包括生物钟核心振荡器组分蛋白ＬＨＹ与ＣＣＡｌ，翻译起始因子ＥＩＦ４Ｅ，磷酸酶ＡＴ３Ｇ５１３７０，以及激酶ＣＫＡ２和ＣＫＩ。

本课题重点对ＣＲＹ与生物钟相关蛋白的相互作用进行了深入研究。

通过ＲＴ－ＰＣＲ克隆了ＣＫＡ２，￡日】，，ＣＣＡｌ基因，并成功构建了ｐＧＡＤＴ７．ＣＫＡ２，ｐＧＡＤＴ７．ＬＨＹ，ｐＧＡＤＴ７．ＣＣＡｌ载体。

我们通过营养缺陷型培养试验，滤纸显色反应和液相显色反应检测了在蓝光和黑暗条件下ｐＢｒｉｄｇｅ．ＣＲＹ２与ｐＧＡＤＴ７．ＣＫＡ２，ｐＧＡＤＴ７．ＬＨＹ，ｐＧＡＤＴ７．ＣＣＡｌ在酵母体内的相互作用。

结果发现：ＣＲＹ２蛋白在蓝光条件下与ＣＫＡ２有较强的相互作用，而与ＬＨＹ，ＣＣＡｌ的相互作用较弱，而且ＣＲＹ２与ＣＫＡ２，ＬＨＹ，ＣＣＡｌ的相互作用强度与蓝光光强呈正相关；而在黑暗条件下ＣＲＹ２与所检测蛋白均无相互作用。

成功构建了ｐＣｏｌｄＴＦ．ＣＫＡ２，ｐＣｏｌｄＴＦ．ＬＨＹ，ｐＣｏｌｄＴＦ．ＣＣＡｌ原核表达载体，并采用大肠杆菌ＢＬ２１表达得到了可溶的重组蛋白。

载体图谱

一、pGADT7(Amp)酵母表达载体(AD-Amp)AD forward primer: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGC-3'AD reverse primer: 5'-AGATGGTGCACGATGCACAG-3'F：GC AT CGA TAC ATG GC T TG T GCTACTCTGAR：GGCC GGATCC TTAAGAGAGGTAGCTGGGAGAD forward primer: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGC-3'AD reverse primer: 5'-AGATGGTGCACGATGCACAG-3'二、pGBKT7(Kan0酵母表达载体(BD-Kan)三、BIFC(Kan)验证互做蛋白表达载体（德国）四、pGR107(Kan)表达载体（PVX-10kb）吴建国MCS:ClaI/SmaI/SalI(pgR107)MCS:ClaI/AscI/NotI/SalI(pgR106) 五、BIFC(Amp)载体（美国）3075（nEYFP-329bp）3076 (cEYFP-218bp)F：GGC GAATTC ATG GCTTGTGCTACTCTGA R：GGC CCTAGG AGAGAGGTAGCTGGGAG TAA TAG TGA六、RNAI(Kan)载体-pFGC5941（王宗华）七、pGEX-4T-1(Amp)原核表达载体八：pET-29a(Kan)原核表达载体九、. pEGAD(Kan)植物表达载体*XbaⅠ cleavage blocked by overlapping dam methylation. Must grow in dam-strain to cut. Note, XhoⅠ is not unique.pTRV2(a) Genome organization of TRV. The TRV-RNA1 open reading frames (ORFs) correspond to 134 and 194 kDa replicase, movement protein (MP) and a 16-kDa cysteine-rich protein. The TRV-RNA2 ORFs corresponds to coat protein (CP), and the 29.4 and 32.8 kDa proteins. gRNA, genomic RNA; sgRNA, subgenomic RNA. Asterisks (*) indicate the readthrough of 134 kDa protein.(b) TRV based VIGS vectors. TRV cDNA clones were placed in betweenthe duplicated CaMV 35S promoter (2×35S) and the nopaline synthase terminator (NOSt) in a T-DNA vector. LB and RB refer to left and right borders of T-DNA. Rz, self-cleaving ribozyme. MCS, multiple cloning sites.十、十一、1103-YFP十二：pBINPLUS十三、pBin438。

2023~2024学年北京市朝阳区高三上学期期末生物试题

2023~2024学年北京市朝阳区高三上学期期末生物试题1.研究者在果蝇的肠吸收细胞中发现了一种新的细胞器——PXo小体，如图所示。

该细胞器具有多层膜，膜的结构与细胞膜相似。

当饮食中磷酸盐不足时，PXo小体膜层数减少，最终被降解。

相关叙述不合理．．．的是（）A．PXo小体膜以磷脂双分子层为基本骨架B．PXo小体的功能与粗面内质网非常相似C．胞内磷酸盐充足时PXo小体膜层数可能增加D．PXo小体动态解体利于维持胞内磷酸盐稳态2.为研究神经元胞体和轴突末梢处细胞呼吸的差异，科研人员单独培养神经元的胞体和突触体（主体为突触小体），检测二者的耗氧速率和胞外酸化速率，结果如图。

下列推测正确的是（）A．突触体无氧呼吸速率高于神经元的胞体B．突触体有氧呼吸速率高于神经元的胞体C．突触体产生ATP的速率低于神经元的胞体D．CO 2产生速率较低导致突触体胞外酸化速率低3.端粒酶是细胞中催化端粒延长的一种酶。

为了研究端粒、DNA损伤与个体衰老之间的关系，研究人员分别构建了端粒酶缺失（G3 KO）、DNA损伤诱导蛋白缺失（d KO）和双缺失（G3-d KO）的三种模型小鼠，并检测小鼠的存活率，结果如图。

下列叙述错误．．的是（）A．端粒是染色体两端一段特殊序列的DNA-蛋白质复合体B．和野生型小鼠相比，G3 KO小鼠存活比率显著下降C．端粒酶缺失可能通过减少细胞中的DNA损伤影响衰老D．DNA损伤诱导蛋白的缺失能延长G3 KO小鼠的寿命4.真核生物转录形成前体RNA，再通过剪接成为成熟的mRNA。

下图表示拟南芥F基因的转录及加工过程。

当Fβ过多时，拟南芥响应高温开花的时间延后。

有关分析正确的是（）A．F基因和前体RNA的基本组成单位相同B．F基因结构改变导致转录出不同的mRNAC．促进F基因表达Fγ拟南芥将提前开花D．开花时间受环境及RNA剪接形式的影响5.人与黑猩猩由共同祖先进化而来。

黑猩猩有48条染色体，人却只有46条染色体。

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本氏烟组蛋白H4_与番茄斑驳花叶病毒外壳蛋白互作调控病毒侵染

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(２):３４４￣３５１ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ刘亚楠ꎬ孙㊀枫ꎬ涂丽琴ꎬ等.本氏烟组蛋白Ｈ４与番茄斑驳花叶病毒外壳蛋白互作调控病毒侵染[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(２):３４４￣３５１.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０２.００６本氏烟组蛋白Ｈ４与番茄斑驳花叶病毒外壳蛋白互作调控病毒侵染刘亚楠１ꎬ㊀孙㊀枫２ꎬ㊀涂丽琴２ꎬ㊀高丹娜２ꎬ㊀李㊀硕２ꎬ㊀吴淑华２ꎬ㊀季英华１ꎬ２ꎬ㊀郭青云１(１.青海大学农林科学院/青海省农业有害生物综合治理重点实验室/农业农村部西宁作物有害生物科学观测实验站ꎬ青海西宁８１００００ꎻ２.江苏省农业科学院植物保护研究所ꎬ江苏南京２１００１４)收稿日期:２０２３￣０２￣１０基金项目:国家重点研发计划项目(２０２２ＹＦＤ１４０１２０２)ꎻ国家自然科学基金项目(３２０７２５０６)ꎻ江苏省农业科技自主创新基金项目[ＣＸ(２１)１０１１]ꎻ现代农业产业技术体系项目(ＣＡＲＳ￣２４￣Ｃ￣０１)ꎻ沿海集团揭榜挂帅项目(２０２２ＹＨＴＤＪＢ０３)ꎻ高端外国专家引进计划项目(Ｇ２０２２０１４０７３Ｌ)ꎻ江苏省农业科学院科学仪器开放共享自主研究课题[ＧＸ(２２)１００１]作者简介:刘亚楠(１９９７－)ꎬ女ꎬ河南驻马店人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为作物病毒ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)２２２８２３９７６１＠ｑｑ.ｃｏｍꎮ孙枫为共同第一作者ꎮ通讯作者:郭青云ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)Ｇｕｏｑｉｎｇｙｕｎｑｈ＠１６３.ｃｏｍꎻ季英华ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｊｉｙｉｎｇｈｕａ＠ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ㊀㊀摘要:㊀以番茄斑驳花叶病毒(ＴｏｍａｔｏｍｏｔｔｌｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＴｏＭＭＶ)外壳蛋白(ＣｏａｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＣＰ)为研究对象ꎬ通过荧光素酶互补技术(ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｍａｇｉｎｇａｓｓａｙꎬＬＣＩ)研究ＴｏＭＭＶＣＰ与本氏烟组蛋白Ｈ４在植物体内的互作情况ꎮ亚细胞共定位结果显示ꎬＴｏＭＭＶＣＰ定位于细胞核和细胞质中ꎬ组蛋白Ｈ４定位于细胞核中ꎬ两者共定位于细胞核中ꎮ双分子荧光互补(ＢｉＦＣ)试验结果表明ꎬＴｏＭＭＶＣＰ与组蛋白Ｈ４的互作位置主要在细胞核中ꎮ上述２种试验结果证明ꎬ烟草花叶病毒ＣＰ与本氏烟组蛋白Ｈ４在植物体内存在互作ꎮ采用病毒诱导的基因沉默(Ｖｉｒｕｓ￣ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇꎬＶＩＧＳ)技术沉默本氏烟烟草中的Ｈ４基因ꎬ对沉默Ｈ４基因的植株接种ＴｏＭＭＶꎬ接种后第４ｄꎬ通过实时荧光定量ＰＣＲ检测方法检测系统叶的病毒含量ꎬ发现病毒含量显著低于对照组ꎬ结果表明Ｈ４基因的沉默会影响ＴｏＭＭＶ在植株中的复制ꎬ组蛋白Ｈ４可能是ＴｏＭＭＶ侵染植株的本氏烟感病因子ꎮ病毒编码的ＣＰ可能与寄主组蛋白Ｈ４在细胞核内发挥作用ꎬ进而使病毒完成系统侵染ꎮ关键词:㊀番茄斑驳花叶病毒ꎻ外壳蛋白ꎻ组蛋白ꎻ蛋白质互作中图分类号:㊀Ｓ４３６.４１２.１＋１㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０２￣０３４４￣０８ＶｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｈｉｓｔｏｎｅＨ４ｏｆＮｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａａｎｄｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｏｆｔｏｍａｔｏｍｏｔｔｌｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＬＩＵＹａ￣ｎａｎ１ꎬ㊀ＳＵＮＦｅｎｇ２ꎬ㊀ＴＵＬｉ￣ｑｉｎ２ꎬ㊀ＧＡＯＤａｎ￣ｎａ２ꎬ㊀ＬＩＳｈｕｏ２ꎬ㊀ＷＵＳｈｕ￣ｈｕａ２ꎬ㊀ＪＩＹｉｎｇ￣ｈｕａ１ꎬ２ꎬ㊀ＧＵＯＱｉｎｇ￣ｙｕｎ１(１.ＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＱｉｎｇｈａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＰｅｓｔＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆＱｉｎｇｈａｉＰｒｏｖｉｎｃｅ/Ｓｃｉ￣ｅｎｔｉｆｉｃＯｂｓｅｒｖｉｎｇａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔａｔｉｏｎｏｆＣｒｏｐＰｅｓｔｉｎＸｉｎｉｎｇꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＸｉｎｉｎｇ８１００００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｔｈｅｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ(ＣＰ)ｏｆｔｏｍａｔｏｍｏｔｔｌｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ(ＴｏＭＭＶ)ｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｂｊｅｃｔꎬａｎｄｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＣＰｏｆＴｏＭＭＶａｎｄｈｉｓｔｏｎｅＨ４ｏｆＮｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｍａｇｉｎｇａｓｓａｙ(ＬＣＩ).Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉ￣ｚａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＣＰｏｆＴｏＭＭＶｗａｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓａｎｄｃｙｔｏｐｌａｓｍꎬｈｉｓｔｏｎｅＨ４ｗａｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓꎬａｎｄｂｏｔｈｗｅｒｅｃｏ￣ｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓ.Ｉｎｔｈｅｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ(ＢｉＦＣ)ａｓｓａｙꎬｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｉｔｅｓｂｅｔｗｅｅｎＣＰｏｆＴｏＭＭＶａｎｄｈｉｓｔｏｎｅＨ４ｗｅｒｅｍａｉｎｌｙｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅａｂｏｖｅｔｗｏｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓａｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｈｉｓｔｏｎｅＨ４ｏｆＮ.ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａｉｎｐｌａｎｔｓ.４４３Ｈ４ｗａｓｓｉｌｅｎｃｅｄｉｎＮ.ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａｂｙｖｉｒｕｓ￣ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ(ＶＩＧＳ).ＰｌａｎｔｓｗｉｔｈｓｉｌｅｎｃｅｄＨ４ｗｅｒｅｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈＴｏＭＭＶꎬａｎｄｔｈｅｖｉｒｕｓｃｏｎｔｅｎｔｉｎｓｙｓｔｅｍｉｃｌｅａｖｅｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｏｎｔｈｅｆｏｕｒｔｈｄａｙａｆｔｅｒｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ.ＩｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｖｉｒｕｓｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆＨ４ｇｅｎｅｗｏｕｌｄａｆｆｅｃｔｔｈｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＴｏＭＭＶｉｎｐｌａｎｔｓꎬａｎｄｈｉｓｔｏｎｅＨ４ｍａｙｂｅｔｈｅｃａｕｓｅｏｆＴｏＭＭＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄｐｌａｎｔｓ.ＴｈｅＣＰｅｎｃｏｄｅｄｂｙｔｈｅｖｉｒｕｓｍａｙｐｌａｙａｒｏｌｅｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓｗｉｔｈｔｈｅｈｏｓｔｈｉｓｔｏｎｅＨ４ꎬｔｈｅｒｅｂｙａｓｓｉｓｔｉｎｇｔｈｅｖｉｒｕｓｔｏｃｏｍｐｌｅｔｅｔｈｅｓｙｓｔｅｍｉｃｉｎｆｅｃｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｔｏｍａｔｏｍｏｔｔｌｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎻｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎꎻｈｉｓｔｏｎｅꎻｐｒｏｔｅｉｎ￣ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ㊀㊀番茄斑驳花叶病毒(ＴｏｍａｔｏｍｏｔｔｌｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＴｏＭＭＶ)主要侵染茄科和十字花科植物及部分豆科㊁葫芦科植物[１]ꎮ被ＴｏＭＭＶ侵染后ꎬ番茄植株病叶上往往出现斑驳皱缩等症状ꎬ严重者导致番茄叶片坏死ꎬ进而影响植株发育ꎬ最终影响番茄的品质和产量[２]ꎮＴｏＭＭＶ属帚状病毒科(Ｖｉｒｇａｖｉｒｉｄａｅ)㊁烟草花叶病毒属(Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ)[３￣５]ꎬ为正义单链ＲＮＡ(＋ｓｓＲ￣ＮＡ)病毒[６]ꎮ番茄斑驳花叶病毒基因组由４个开放阅读框(ＯｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅꎬＯＲＦ)构成ꎬ编码４个大小不同的蛋白质[７]ꎬ分别为相对分子质量为２９８００的运动蛋白(ＭｏｖｅｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＭＰ)㊁相对分子质量为１７７００的外壳蛋白(ＣｏａｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＣＰ)[６]㊁相对分子质量为１８３０００的ＲＮＡ依赖型ＲＮＡ聚合酶(ＲＮＡ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅꎬＲｄＲＰ)蛋白㊁相对分子质量为１２６０００的甲基转移酶/解旋酶蛋白(Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ/ｈｅｌｉｃａｓｅ)[８]ꎮ对与番茄斑驳花叶病毒同属的烟草花叶病毒属其他成员的研究发现ꎬ很多外壳蛋白作为病毒结构蛋白存在[９]ꎬ在组装病毒粒子的过程中扮演着非常重要的角色[１０]ꎮ同时ꎬＣＰ也参与多项生物功能的行使ꎬ如病毒运动[１１]㊁病毒致病过程中症状的形成[１２]㊁病毒复制酶在合成负链ＲＮＡ过程中的位点识别[１３]㊁病毒复制复合物(ＶｉｒｕｓｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘｅｓꎬＶＲＣ)的调控[１４]等ꎮ上述研究结果显示ꎬＣＰ在病毒的侵染循环中扮演着重要角色[１５]ꎮ但是ꎬ目前关于ＴｏＭＭＶＣＰ与寄主植物本氏烟间分子互作的研究还比较少ꎮ组蛋白参与ＤＮＡ的包装和转录调控ꎬ是染色质的主要成分[１６]ꎮ组蛋白家族包括３２个成员ꎬ分别是６个Ｈ１㊁１１个Ｈ２Ａ㊁８个Ｈ２Ｂ㊁５个Ｈ３和２个Ｈ４[１７]ꎮＨ３㊁Ｈ４组蛋白在调节染色质的结构和功能方面起着重要的作用[１８￣１９]ꎮ在相应酶的作用下ꎬ组蛋白会发生甲基化[２０]㊁乙酰化㊁磷酸化[２１]㊁腺苷酸化㊁泛素化和腺苷５ᶄ￣二磷酸(ＡＤＰ)核糖化等进而达到组蛋白修饰[１９ꎬ２２]ꎮ修饰组蛋白会通过适配器分子㊁染色质修饰酶㊁转录因子和转录抑制因子读取等影响染色质的组装ꎬ从而对转录过程起到调控作用[２３]ꎮ本研究利用荧光素酶互补技术(Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｃｏｍ￣ｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｍａｇｉｎｇａｓｓａｙꎬＬＣＩ)㊁亚细胞共定位和双分子荧光互补技术(Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｏｍｐｌｅ￣ｍｅｎｔａｔｉｏｎꎬＢｉＦＣ)验证ＴｏＭＭＶＣＰ与本氏烟Ｈ４蛋白的分子互作ꎬ并利用病毒诱导的基因沉默(Ｖｉｒｕｓ￣ｉｎ￣ｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇꎬＶＩＧＳ)技术明确本氏烟Ｈ４蛋白在ＴｏＭＭＶ侵染过程中的作用ꎬ使人们进一步了解ＴｏＭＭＶ侵染植物的机制ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料与试剂本氏烟植株种植于２５ħ光照培养箱中ꎬ１６ｈ/８ｈ光照/黑暗交替培养ꎮＧａｔｅｗａｙ入门载体ｐＤＯＮＲ㊁荧光素酶载体(ｃＬＵＣ㊁ｎＬＵＣ)㊁亚细胞共定位载体(ｐＨＹＧ￣ＹＦＰ㊁ｐＨＹＧ￣ＣＦＰ)㊁ＢｉＦＣ载体(ＹＮ㊁ＹＣ)㊁农杆菌ＧＶ３１０１感受态菌株和ＡＢＩ感受态菌株均由笔者所在实验室保存ꎬ大肠杆菌ＴｒｅｌｉｅｆＴＭ５α购自北京Ｔｓｉｎｇｋｅ公司ꎮＶＩＧＳ载体ＴＲＶ１㊁ＴＲＶ２由笔者所在实验室保存ꎬＴＲＶ１㊁ＴＲＶ２￣ＧＵＳ㊁ＴＲＶ２￣ＰＤＳ㊁ｍＣｈｅｒｒｙ￣Ｈ２Ｂ㊁农杆菌菌液由笔者所在实验室保存ꎮＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔＤ６２９４微量胶回收试剂盒㊁常规质粒提取试剂盒(ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉＫｉｔＩＤ６９４３￣２)ꎬ购自ＯｍｅｇａＢｉｏ￣Ｔｅｋ公司ꎻ克隆载体ｐＭＤ１８￣Ｔ㊁Ｔ４ＤＮＡ连接酶㊁限制性快切酶ꎬ购自宝日医生物技术(北京)有限公司ꎮ１.２㊀基因克隆与载体的构建以实验室保存的ＴｏＭＭＶＣＰ和本氏烟ｃＤＮＡ为模板ꎬ设计特异性引物(表１)进行目的基因扩增ꎬ经ＢＰ反应连接到ｐＤＯＮＲ上后转化大肠杆菌ＴｒｅｌｉｅｆＴＭ５αꎬ测序正确后ꎬ提取质粒ꎬ经ＬＲ反应连接至终载５４３刘亚楠等:本氏烟组蛋白Ｈ４与番茄斑驳花叶病毒外壳蛋白互作调控病毒侵染体ｃＬＵＣ㊁ｎＬＵＣ㊁ｐＨＹＧ￣ＹＦＰ㊁ｐＨＹＧ￣ＣＦＰ㊁ＹＮ㊁ＹＣ[２４]上ꎬ分别获得质粒ｃＬＵＣ￣Ｈ４㊁ｎＬＵＣ￣ＣＰ㊁ｐＨＹＧ￣ＹＦＰ￣Ｈ４㊁ｐＨＹＧ￣ＣＦＰ￣ＣＰ㊁ＹＮ￣ＣＰ㊁ＹＣ￣Ｈ４ꎮ用构建的质粒转化农杆菌感受态后进行ＰＣＲ检测ꎮ设计含有合适酶切位点的引物(表１)对Ｈ４基因进行扩增ꎬ与同样经过酶切处理的ＴＲＶ２连接ꎬ得到ＴＲＶ２￣Ｈ４载体ꎬ将其转入农杆菌ＧＶ３１０１中ꎮ表１㊀本试验所用引物Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ引物名称㊀㊀引物序列(５ᶄң３ᶄ)ＣＰ￣ａｔｔｂ￣ＦＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣ￣ＴＴＡＣＧＣＴＡＴＴＡＣＴＴＣＣＰ￣ａｔｔｂ￣ＲＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＡＧＧＡ￣ＣＧＣＴＧＧＣＧＣＡＧＡＡＧＨ４￣ａｔｔｂ￣ＦＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣ￣ＴＧＧＡＣＧＴＧＧＡＡＡＧＧＧＨ４￣ａｔｔｂ￣ＲＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡＣＣＴＣＣ￣ＡＡＡＴＣＣＧＴＡＣＡＡＧＧＨ４￣ＦＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＣＴＧＧＡＣＧＴＧＧＡＡＡＧＧＧＨ４￣ＲＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＣＣＴＣＣＡＡＡＴＣＣＧＴＡＣＡＨ４￣ｑＰＣＲ￣ＦＧＣＧＧＴＣＡＧＴＴＴＡＡＧＣＴＡＧＧＧＴＨ４￣ｑＰＣＲ￣ＲＡＡＧＡＧＣＧＡＧＧＡＴＡＴＧＣＡＡＴＧＴＣＰ￣ｑＰＣＲ￣ＦＣＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＣＧＡＡＡＣＡＴＣＰ￣ｑＰＣＲ￣ＲＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＡＮｂＡｃｔｉｎ￣ＦＣＡＡＴＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＴＡＣＴＴＴＣＴＣＴＣＮｂＡｃｔｉｎ￣ＲＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＣＣＡＴＧＡＧＡＣＴＡ１.３㊀农杆菌接种本氏烟分别将携带ｎＬＵＣ￣ＣＰ㊁ｃＬＵＣ￣Ｈ４㊁ＹＦＰ￣Ｈ４㊁ＣＦＰ￣ＣＰ㊁ＹＮ￣ＣＰ㊁ＹＣ￣Ｈ４㊁ＴＲＶ２￣Ｈ４㊁ＴＲＶ２￣ＧＵＳ㊁ＴＲＶ２￣ＰＤＳ㊁ＴＲＶ１的农杆菌于２８ħ恒温摇床内培养至ＯＤ６００ʈ０６ꎬ离心去上清后将菌体分别重悬于悬浮液(１０ｍｍｏｌ/ＬＭｇＣｌ２㊁５０ｍｍｏｌ/Ｌ２￣吗啉乙磺酸ｐＨ５６㊁１００μｍｏｌ/Ｌ乙酰丁香酮)中ꎬ使其ＯＤ６００为１０ꎬ于２８ħ恒温培养箱中悬浮１~２ｈꎮ在荧光素酶互补试验中以ｎＬＵＣ￣ＣＰ:ｃＬＵＣ￣Ｈ４㊁ｎＬＵＣ￣ＣＰ:ｃＬＵＣ㊁ｎＬＵＣ:Ｈ４￣ｃＬＵＣ㊁ｎＬＵＣ:ｃＬＵＣ分别共浸润本氏烟叶片ꎮ双分子荧光互补试验中以ＹＮ￣ＣＰ:ＹＣ￣Ｈ４共浸润本氏烟叶片ꎮ在注射２ｄ后使用化学发光/荧光图像分析系统进行观察ꎬ进行荧光素酶互补分析ꎮ在亚细胞共定位和双分子荧光互补试验中ꎬ使用激光共聚焦显微镜(ＺＥＩＳＳ公司产品ꎬ德国)观察注射菌液４８ｈ后的本氏烟叶片ꎮ在ＶＩＧＳ试验中ꎬ分别以ＴＲＶ１:ＴＲＶ２￣Ｈ４㊁ＴＲＶ１:ＴＲＶ２￣ＧＵＳ(阴性对照)㊁ＴＲＶ１:ＴＲＶ２￣ＰＤＳ(阳性对照)３种组合共浸润接种本氏烟ꎬ接种后的本氏烟以ＴＲＶ￣Ｈ４本氏烟㊁ＴＲＶ￣ＧＵＳ本氏烟(阴性对照)㊁ＴＲＶ￣ＰＤＳ本氏烟(阳性对照)命名ꎮ每个组合接种７株ꎬ以待进行进一步试验ꎮ１.４㊀实时定量ＲＴ￣ＰＣＲ(ｑＲＴ￣ＰＣＲ)首先使用ＴｒａｎｓＺｏｌＵｐＰｌｕｓＲＮＡ试剂盒提取样品ＲＮＡꎬ然后将ＲＮＡ稀释至相同含量进行反转录(参照说明书)ꎬ按照比例制备反应液ꎬ之后进行定量分析ꎬ每个样品设置３个生物学重复ꎬ设３个技术重复ꎮｑＰＣＲ反应体系(总体积２００μｌ):１００μｌ２ˑＳｕ￣ｐｅｒＦａｓｔＵｎｉｖｅｒｓａｌＳＹＢＲＭａｓｔｅｒＭｉｘꎬ０５μｌ正向引物ꎬ０５μｌ反向引物ꎬ１０μｌ模板ＤＮＡꎬ８０μｌｄｄＨ２ＯꎮｑＰＣＲ反应程序:９５ħ预变性３０ｓꎻ９５ħ变性１０ｓꎬ６０ħ退火/延伸３０ｓꎬ４５个循环ꎮ熔解曲线:９５ħ１５ｓꎬ９５ħ１ｍｉｎꎬ６０ħ１５ｓꎮ１.５㊀ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ取０１ｇ本氏烟叶片ꎬ用２００μｌ蛋白质提取缓冲液[０１２５ｍｏｌ/Ｌ三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ)ꎬ４００％十二烷基硫酸钠(ＳＤＳ)ꎬ２０００％甘油(Ｇｌｙｃｅｒｏｌ)ꎬ２００％巯基乙醇(Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ)ꎬ００５％溴酚蓝(Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ)]研磨ꎬ于９５ħ㊁１０ｍｉｎ煮沸后置于预冷的４ħ离心机中ꎬ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ取上清液ꎬ获得蛋白质提取液ꎬ取适量蛋白质提取液ꎬ进行１０％十二烷基硫酸钠￣聚丙烯酰胺凝胶电泳(ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ)(１３０Ｖꎬ８０ｍｉｎ)ꎬ电泳结束后ꎬ电转至聚氯乙烯膜ꎬ在室温下置于自动摇床上ꎬ于７０ｒ/ｍｉｎ孵育１ｈꎬ用磷酸盐吐温缓冲液(１ˑＰＢＳＴ)洗脱３次ꎬ每次５ｍｉｎꎮ以α￣ＴｏＭＭＶ蛋白质抗体(由笔者所在实验室保存)作为一抗孵化１５ｈ后ꎬ用１ˑＰＢＳＴ溶液洗脱３次ꎬ每次５ｍｉｎꎬ用ＨＲＰ标记二抗(碧云天公司产品ꎬ中国)于脱色摇床常温孵育１ｈ后ꎬ再用１ˑＰＢＳＴ溶液洗脱３次ꎬ每次５ｍｉｎꎮ使用高敏型ＥＣＬ(化学发光底物)化学发光试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品)检测电转化后的聚氯乙烯膜ꎬ取１ｍｌ化学发光底物(ＥＣＬ)ＢｕｆｆｅｒＡ㊁１ｍｌＥＣＬＢｕｆｆｅｒＢ液体等体积混匀后均匀滴加到电转后的聚氯乙烯膜上ꎬ在室温下孵育１~２ｍｉｎ后放在化学发光成像仪器(Ｔａｎｏｎ５２００全自动化学发光图像分析系统)下观察结果ꎮ６４３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期２㊀结果与分析２.１㊀本氏烟组蛋白基因Ｈ４的克隆及组蛋白Ｈ４特征分析㊀㊀Ｈ４基因全长３１２ｂｐ(图１Ａ)ꎬ编码１个由１０２个氨基酸组成的蛋白质(相对分子质量为１１４００)ꎬ该蛋白质具有１个保守的组蛋白折叠域(ＨＦＤ)[２５]ꎬ其中包含３个串联的α￣螺旋ꎬ两端是Ｎ末端㊁Ｃ末端ꎬ这２个区段易发生转录后修饰ꎬ对基因转录的调控作用明显[２６]ꎬ组蛋白Ｈ４的结构见图１ＢꎮＡ:组蛋白基因Ｈ４的克隆结果ꎻＢ:组蛋白Ｈ４结构ꎮ图１㊀组蛋白基因Ｈ４的克隆和组蛋白Ｈ４结构示意Ｆｉｇ.１㊀ＣｌｏｎｉｎｇｏｆｈｉｓｔｏｎｅｇｅｎｅＨ４ａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｈｉｓｔｏｎｅＨ４２.２㊀ＴｏＭＭＶ外壳蛋白(ＣＰ)与组蛋白Ｈ４的互作验证㊀㊀近年来ꎬ荧光素酶互补成像(Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｃｏｍｐｌｅ￣ｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｍａｇｉｎｇꎬＬＣＩ)技术因具有可量化㊁高灵敏度的特征而在蛋白质互作试验中被广泛使用[２６]ꎬ本试验拟通过此方法分析ＣＰ与组蛋白Ｈ４之间的互作关系ꎮｎＬＵＣ￣ＣＰ与ｃＬＵＣ￣Ｈ４共浸润本氏烟ꎬ２ｄ后对烟草叶片喷施荧光素酶ꎬ用化学发光成像系统观察荧光素酶的活性ꎮ如图２Ａ所示ꎬ与含有空载体的农杆菌一起被浸润的所有阴性对照中ꎬ荧光信号都没有被检测出来ꎬ只有共表达的ｎＬＵＣ￣ＣＰ＋ｃＬＵＣ￣Ｈ４试验组能检测到明显的荧光信号ꎮ上述结果表明ꎬＴｏＭＭＶＣＰ与组蛋白Ｈ４能在烟草细胞中发生相互作用ꎮ㊀㊀为了进一步验证ＣＰ与组蛋白Ｈ４在植物体内的互作情况ꎬ笔者将ＣＰ基因㊁Ｈ４基因分别连入双分子荧光互补(ＢｉＦＣ)载体ＹＮ㊁ＹＣ中ꎬ用农杆菌浸润烟草叶片２ｄ后ꎬ通过激光共聚焦观察本氏烟细胞内的黄色荧光ꎮＢｉＦＣ结果表明ꎬＹＮ￣ＣＰ和ＹＣ￣Ｈ４共浸润烟草叶片后可以在细胞核位置观察到点状ＹＦＰ荧光ꎬ表明ＴｏＭＭＶＣＰ和组蛋白Ｈ４能够在烟草叶片细胞中互作ꎬ其他组合均未观察到荧光(图２Ｂ)ꎮＡ:荧光素酶互补成像试验验证ＴｏＭＭＶＣＰ与本氏烟组蛋白Ｈ４的互作关系(左侧为荧光图ꎬ右侧为叶片不同区域菌液组合的示意图)ꎻＢ:双分子荧光互补试验验证ＴｏＭＭＶＣＰ与本氏烟组蛋白Ｈ４的互作关系ꎮ图２㊀番茄斑驳花叶病毒(ＴｏＭＭＶ)外壳蛋白(ＣＰ)与本氏烟组蛋白Ｈ４互作的验证Ｆｉｇ.２㊀Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｈｉｓ￣ｔｏｎｅＨ４ｏｆＮｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａｉｎｐｌａｎｔｓ２.３㊀ＴｏＭＭＶＣＰ和本氏烟组蛋白Ｈ４的亚细胞定位㊀㊀为了明确ＴｏＭＭＶＣＰ及本氏烟组蛋白Ｈ４的亚细胞定位ꎬ本研究分别构建ｐＨＹＧ￣ＣＦＰ￣ＣＰ㊁ｐＨＹＧ￣ＹＦＰ￣Ｈ４重组表达载体ꎮ用含有ｐＨＹＧ￣ＣＦＰ￣ＣＰ㊁ｐＨＹＧ￣ＹＦＰ￣Ｈ４质粒的农杆菌菌液和含有ｍＣｈｅｒｒｙ￣Ｈ２Ｂ质粒的农杆菌菌液共浸润本氏烟叶片ꎬ其中ｍＣｈｅｒｒｙ￣Ｈ２Ｂ的主要作用为细胞核红色荧光标记ꎬ７４３刘亚楠等:本氏烟组蛋白Ｈ４与番茄斑驳花叶病毒外壳蛋白互作调控病毒侵染接种后２ｄꎬ通过激光共聚焦显微镜观察荧光ꎮ结果显示ꎬＴｏＭＭＶＣＰ定位于细胞核㊁细胞质中ꎬ组蛋白Ｈ４定位于细胞核中(图３Ａ)ꎬ两者共定位于细胞核中(图３Ｂ)ꎮＡ:ＴｏＭＭＶＣＰ与本氏烟组蛋白Ｈ４的亚细胞定位Ｂ:ＴｏＭＭＶＣＰ与本氏烟组蛋白Ｈ４的亚细胞共定位ꎮ图３㊀番茄斑驳花叶病毒(ＴｏＭＭＶ)外壳蛋白(ＣＰ)与本氏烟组蛋白Ｈ４的亚细胞定位Ｆｉｇ.３㊀ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｈｉｓｔｏｎｅＨ４ｏｆＮｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ２.４㊀本氏烟沉默Ｈ４基因抑制ＴｏＭＭＶ的侵染为了进一步明确组蛋白Ｈ４对ＴｏＭＭＶ侵染植株的影响ꎬ利用ＴＲＶ诱导的基因沉默技术沉默Ｈ４基因ꎬ以ＴＲＶ￣ＧＵＳ㊁ＴＲＶ￣ＰＤＳ为对照ꎬＴＲＶ￣Ｈ４通过农杆菌浸润对六叶期的本氏烟进行Ｈ４基因沉默ꎬ相关结果见图４ꎮ当阴性对照ＴＲＶ￣ＰＤＳ出现白化症状时ꎬ取试验组的系统叶进行实时荧光定量ＰＣＲꎬ检测Ｈ４基因的沉默效率ꎮ结果显示ꎬＨ４基因的相对表达量显著下降(图４Ｂ)ꎮ㊀㊀对沉默后的植株浸润接种ＴｏＭＭＶꎬ并于接种后第４ｄ取其系统叶进行实时荧光定量ＰＣＲ以检测病毒含量ꎮ结果表明ꎬＨ４基因沉默后ꎬＴｏＭＭＶＣＰ基因在本氏烟中的积累量降低(图４Ａ)ꎬ病毒在系统叶中的复制水平显著低于对照(图４Ｂ)ꎬ表明Ｈ４基因的沉默会影响ＴｏＭＭＶ的侵染ꎬ组蛋白Ｈ４可能是ＴｏＭＭＶ侵染植物的感病因子ꎮ３㊀讨论病毒外壳蛋白的主要功能是形成衣壳ꎬ保护病毒基因组ꎬ以防降解[２７]ꎮ然而ꎬ除了结构功能外ꎬ外８４３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期Ａ:接种病毒４ｄ后植株的表现ꎻＢ:Ｈ４基因的沉默效率检测和接种病毒４ｄ后外壳蛋白基因(ＣＰ)相对表达量的检测结果(∗∗∗∗表示差异极显著ꎬＰ<０.０００１)ꎻＣ:接种病毒４ｄ后ＣＰ的ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测结果ꎮ图４㊀沉默本氏烟Ｈ４基因抑制番茄斑驳花叶病毒(ＴｏＭＭＶ)侵染Ｆｉｇ.４㊀Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｏｍａｔｏｍｏｔｔｌｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｂｙｓｉ￣ｌｅｎｃｉｎｇＨ４ｇｅｎｅｉｎＮｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ壳蛋白在病毒的感染周期和寄主植物对病毒感染的防御反应中还有许多其他重要功能[２８]ꎬ包括参与病毒的蚜传[２９]㊁病毒的长距离运动[３０]和胞间运动[３１]㊁病毒症状的形成等[３２￣３３]ꎮ以此可见ꎬＣＰ在病毒侵染植株的过程中发挥了重要作用ꎬ因此研究ＣＰ的互作因子对了解病毒侵染过程及其致病机制有着十分重要的意义[３４]ꎮ已有的研究结果表明ꎬ水稻矮缩病病毒外壳蛋白Ｐ２可以与植物体内恩特￣贝壳杉烯氧化酶(Ｅｎｔ￣ｋａｕｒｅｎｅｏｘｉｄａｓｅｓ)互作ꎬ导致水稻产生矮缩症状[３５]ꎮＬｉ等[３６]研究发现ꎬ烟草ＩＰ￣Ｌ与烟草花叶病毒(ＴｏＭＶ)ＣＰ间存在相互作用ꎬＴｏＭＶＣＰ同ＩＰ￣Ｌ的互作会影响植物的光合作用ꎬ从而引起植株黄化症状ꎮ黄瓜绿斑驳花叶病毒外壳蛋白与烟草ＲＰＬ１４存在互作ꎬ这种互作可能会影响病毒的增殖机制[３７]ꎮ本研究选择番茄斑驳花叶病毒ＣＰ作为诱饵筛ꎬ在烟草中筛选到与其互作的组蛋白Ｈ４ꎬ这是关于ＴｏＭＭＶＣＰ与植物组蛋白互作的首次报道ꎬ为ＴｏＭＭＶＣＰ功能的后续研究奠定了基础ꎮ组蛋白是构成真核生物染色体的基本结构蛋白[３８￣３９]ꎬ在某些情况下组蛋白中的特定氨基酸位点可发生甲基化㊁乙酰化等表观遗传学修饰[４０]ꎮ在表观遗传调控中ꎬ这些不同位点的不同修饰作用是不一样的[４１]ꎮ研究发现ꎬ酿酒酵母组蛋白Ｈ４Ｋ１６位点与酵母乙酸耐受性相关[４２]ꎮ对拟南芥的研究发现ꎬ通过减少开花抑制因子ＦＬＣ的组蛋白Ｈ４赖氨酸５(Ｈ４Ｋ５ａｃｅ)的乙酰化ꎬ会使植物提前开花[４３￣４４]ꎮ此外ꎬ组蛋白Ｈ４的乙酰化是基因表达激活的标志ꎬ这些标志在动物病毒基因组特别是动物病毒基因激活和再激活的调控区域的富集ꎬ是病毒从感染潜伏状态到烈性感染状态转变的重要因素[４５]ꎮ本研究在沉默本氏烟Ｈ４后发现ꎬＴｏＭＭＶ的侵染能力下降ꎬ表明Ｈ４在ＴｏＭＭＶ与寄主互作的过程中发挥重要作用ꎬ由此笔者推测ꎬ病毒编码的ＣＰ在细胞核内通过影响组蛋白的修饰等ꎬ进而使病毒完成系统侵染ꎮ参考文献:[１]㊀李月月ꎬ周文鹏ꎬ路思倩ꎬ等.番茄斑驳花叶病毒在我国茄科作物上的发生及生物学特性[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０２０ꎬ５３(３):５３９￣５５０.[２]㊀ＡＭＢＲÓＳＳꎬＭＡＲＴÍＮＥＺＦＡꎬＩＶＡＲＳＰꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｂｉ￣ｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｉｓｏｌａｔｅｏｆＴｏｍａｔｏｍｏｔｔｌｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ(ＴｏＭＭＶ)ｉｎｆｅｃｔｉｎｇｔｏｍａｔｏａｎｄｏｔｈｅｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｈｏｓｔｓｉｎｅａｓｔｅｒｎＳｐａｉｎ[Ｊ].ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ１４９(２):２６１￣２６８.[３]㊀金凤媚ꎬ薛㊀俊ꎬ孙海波ꎬ等.基于小ＲＮＡ技术的天津地区番茄花叶病毒分子检测与基因组部分序列分析[Ｊ].华北农学报ꎬ２０２１ꎬ３６(５):１７６￣１８３.[４]㊀隋雪莲.美国三种新兴蔬菜病毒病特性研究及其检测方法的建立[Ｄ].福州:福建农林大学ꎬ２０１７.[５]㊀中国检验检疫科学研究院ꎬ中华人民共和国天津出入境检验检疫局ꎬ中华人民共和国甘肃出入境检验检疫局.番茄花叶病毒检疫鉴定方法:ＧＢ/Ｔ３６７７１２０１８[Ｓ].北京:国家市场监督管理总局ꎬ中国国家标准化管理委员会ꎬ２０１８:２４. [６]㊀ＩＳＨＩＫＡＷＡＭꎬＯＫＡＤＡＹ.ＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓＲＮＡ[Ｊ].９４３刘亚楠等:本氏烟组蛋白Ｈ４与番茄斑驳花叶病毒外壳蛋白互作调控病毒侵染ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＪａｐａｎＡｃａｄｅｍｙꎬＳｅｒｉｅｓＢꎬ２００４ꎬ８０(５):２１５￣２２４.[７]㊀杨作坤.柑橘衰退病毒与寄主蛋白互作的生物学功能及其ｖｓｉＲＮＡ靶向寄主基因的鉴定[Ｄ].武汉:华中农业大学ꎬ２０２０. [８]㊀涂丽琴ꎬ干射香ꎬ吴淑华ꎬ等.瓜类褪绿黄化病毒编码的Ｐ６蛋白亚细胞定位及致病特征分析[Ｊ].园艺学报ꎬ２０２１ꎬ４８(８):１５３１￣１５４０.[９]㊀范小燕ꎬ杨㊀柳ꎬ季英华ꎬ等.黄瓜绿斑驳花叶病毒ＣＰ基因克隆及亚细胞定位[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０１８ꎬ３４(２):２８１￣２８７. [１０]郑肖娟.传染性法氏囊病病毒感染细胞的差异蛋白质组学研究[Ｄ].杭州:浙江大学ꎬ２００７.[１１]ＢＥＮＤＡＨＭＡＮＥＭꎬＳＺÉＣＳＩＪꎬＣＨＥＮＩꎬｅｔａｌ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｎｔｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓｗｉｔｈｖｉｒｕｓｃｅｌｌ￣ｔｏ￣ｃｅｌｌｍｏｖｅｍｅｎｔ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２００２ꎬ９９:３６４５￣３６５０. [１２]ＢＡＮＥＲＪＥＥＮꎬＷＡＮＧＪＹꎬＺＡＩＴＬＩＮＭ.Ａｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｃｈａｎｇｅｉｎｔｈｅｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｏｆｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｓｅｖｅｒｅｃｈｌｏｒｏｓｉｓ[Ｊ].Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ１９９５ꎬ２０７(１):２３４￣２３９.[１３]ＧＡＬＬＩＥＤＲꎬＷＡＬＢＯＴＶＪＧ.ＲＮＡｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔｄｏｍａｉｎｏｆｔｏｂａｃ￣ｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｃａｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒａｐｏｌｙ(Ａ)ｔａｉｌｉｎｐｌａｎｔａｎｄａｎｉｍａｌｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬ１９９０ꎬ４(７):１１４９￣１１５７.[１４]ＡＳＵＲＭＥＮＤＩＳꎬＢＥＲＧＲＨꎬＫＯＯＪＣꎬｅｔａｌ.Ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｒｅｇｕ￣ｌａｔｅｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘｅｓｄｕｒｉｎｇｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２００４ꎬ１０１(５):１４１５￣１４２０. [１５]何晓玥.核盘菌ＧＡＴＡ转录因子ＳｓＡＲＥＡ和ＳｓＳＲＥ的功能研究[Ｄ].长春:吉林大学ꎬ２０２１.[１６]ＯＫＡＤＡＴꎬＥＮＤＯＭꎬＳＩＮＧＨＭＢꎬｅｔａｌ.ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｈｉｓｔｏｎｅＨ３ｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍａｌｅ￣ｇａｍ￣ｅｔｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｖａｒｉａｎｔＡｔＭＧＨ３[Ｊ].ＰｌａｎｔＪꎬ２００５ꎬ４４(４):５５７￣５６８. [１７]ＹＡＮＧＨꎬＹＡＮＧＮꎬＷＡＮＧＴ.Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｓｔｈｅｄｉｆ￣ｆｅｒｅｎｔｉａｌｈｉｓｔｏｎｅｐｒｏｇｒａｍｓｂｅｔｗｅｅｎｍａｌｅｇｅｒｍｌｉｎｅｃｅｌｌｓａｎｄｖｅｇｅｔａ￣ｔｉｖｅｃｅｌｌｓｉｎＬｉｌｉｕｍｄａｖｉｄｉｉ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪꎬ２０１６ꎬ８５(５):６６０￣６７４. [１８]ＴＡＬＡＳＺＨꎬＬＩＮＤＮＥＲＨＨꎬＳＡＲＧＢꎬｅｔａｌ.ＨｉｓｔｏｎｅＨ４￣ｌｙｓｉｎｅ２０ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｐｒｏｍｏｔｅｒａｎｄｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｓｏｆａｃｔｉｖｅｇｅｎｅｓａｎｄｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｈｙｐｅｒａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＪＢｉｏｌＣｈｅｍꎬ２００５ꎬ２８０(４６):３８８１４￣３８８２２.[１９]李㊀霞.水稻ＯｓＨ４ａ基因的克隆与抗逆性分析[Ｄ].雅安:四川农业大学ꎬ２０１８.[２０]李咏欣.基于多肽化学反应的荧光探针的设计㊁合成与生物应用[Ｄ].兰州:兰州大学ꎬ２０２１.[２１]ＷＡＮＧＺꎬＣＡＳＡＳ￣ＭＯＬＬＡＮＯＪＡꎬＸＵＪＰꎬｅｔａｌ.ＯｓｍｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｉｎｄｕｃｅｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｈｉｓｔｏｎｅＨ３ａｔｔｈｒｅｏｎｉｎｅ３ｉｎｐｅｒｉｃｅｎｔｒｏ￣ｍｅｒｉｃｒｅｇｉｏｎｓｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].ＰＮＡＳꎬ２０１５ꎬ１１２(２７):８４８７￣８４９２.[２２]ＭＥＳＳＮＥＲＳꎬＨＯＴＴＩＧＥＲＭＯ.ＨｉｓｔｏｎｅＡＤＰ￣ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｎＤＮＡｒｅｐａｉｒꎬｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌꎬ２０１１ꎬ２１(９):５３４￣５４２.[２３]ＷＯＮＪꎬＫＩＭＴＫ.ＨｉｓｔｏｎｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｏｎｃｈｒｏｍａｔｉｎＣｈＩＰ￣ＰＣＲａｓｓａｙｓ[Ｊ].ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌꎬ２００６ꎬ３２５:２７３￣２８３.[２４]李㊀阳ꎬ谢㊀理ꎬ祝建烜ꎬ等.水稻条纹病毒ｐ２与本氏烟柯浩体蛋白互作[Ｊ].病毒学报ꎬ２０２１ꎬ３７(６):１４７６￣１４８３. 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质粒图谱大全

质粒图谱大全质粒图谱大全质粒图谱大全（转载）一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C, pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA二.克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS( )L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体ProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETDsbFusionSystems39band40bProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETExpressionSystem33bProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETExpressionSystemsProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETGSTFusionSystems41and42ProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETNusAFusionSystems43.1and44 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?p ETVectorDNA ProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKits四.PGEX系列表达载体TEcoR?pGEX-1I/BAP pGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3五.PTYBsystem PTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-) pCDNA3.1( )pPICZalphaApGAPZαAPYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

分裂纳米荧光素酶二元技术报告基因

分裂纳米荧光素酶二元技术报告基因分裂纳米荧光素酶二元技术（Split NanoLuciferase Enzyme Bimolecular Technique）是一种用于报告基因表达的方法。

该技术利用纳米荧光素酶（NanoLuciferase）作为报告基因，将其分裂为两个部分，分别称为NLuc1和NLuc2。

这两个部分分别与两个相应的生物素结合，形成生物素–NLuc1和生物素–NLuc2的复合物。

当这两个复合物相互结合时，产生的复合物（生物素–NLuc1–NLuc2）能够发出荧光信号。

荧光信号的强度与基因表达水平成正比，因此可以作为基因表达的指标。

该技术可用于研究基因的转录水平、转录调控因子的活性以及蛋白质相互作用等领域。

使用分裂纳米荧光素酶二元技术的步骤如下：1. 构建含有NLuc1和NLuc2的报告基因表达载体。

这两个部分需要分别与适当的启动子和调控元件相连，以确保其在感兴趣的细胞中能够产生荧光信号。

2. 将NLuc1和NLuc2的表达载体转染到感兴趣的细胞中。

可以使用适当的转染剂或病毒载体来实现载体的转染效率。

3. 确定感兴趣的基因的转录水平或蛋白质相互作用的影响因素，例如数量、时间、环境等。

4. 通过荧光检测仪或相关设备测量细胞中的荧光信号。

荧光信号的强度可用于评估基因表达水平的变化。

5. 分析和解释实验结果，并与其他实验条件进行比较。

总之，分裂纳米荧光素酶二元技术能够可靠地报告基因表达水平，并且具有灵敏度高、动态范围广和操作简便的优势。

它在生命科学研究中的应用前景广阔，并有望为相关领域的研究人员提供有力的实验工具。