流感病毒RNA荧光RTPCR检测技术样本

流感病毒RNA荧光RT-PCR检测技术
实时荧光定量PCR是在常规PCR基本上发展起来定量PCR技术，通过在PCR反映体系中加入荧光基团，运用荧光信号累积，实时监测整个PCR进程，最后依照ct值和原则曲线，对未知模版进行定量分析。

惯用实时荧光定量PCR又分为非特异性荧光标记SYBR Green法和特异性荧光标记TaqMan法和分子信标法。

一、实时荧光定量PCR原理：
1、SYBR Green法：
SYBR Green是一种双链DNA结合染料，游离状态下不发光，非特意地掺入到双链DNA中后发出荧光信号，其强度与双链DNA数量有关，随着扩增产物量增长，检测到荧光信号增强。

2、TaqMan法：
在扩增反映液中，加入一特异性探针，该探针5‘端和3’端分别标记一种荧光报告基团和一种荧光淬灭基团，探针完整时，两基团位置接近，5‘端报告基团荧光能量被3’端淬灭基团吸取，此时检测不到荧光信号，在扩增过程中，探针与模板结合形成Taq 酶5‘
→3’外切活性底物，当Taq酶沿模板向前延伸到探针结合处时，发生链置换，Taq酶5’→3’外切活切将探针5‘端连接报告基团从探针上切割下来，5’端报告基团荧光能量脱离3’端荧光淬灭基团吸取，可检测到荧光信号，每通过一种PCR循环，荧光信号也和扩增产物同样，有一种同步增长过程。

3、分子信标法：
探针设计成茎环构造发夹状，环部核苷酸序列与扩增产物序列互补，两端核苷酸序列互补形成茎部，且一端标记有报告基团，另一端标记有淬灭基团，探针未与模板结合时，报告基团和淬灭基团空间位置接近，报告基团荧光能量被淬灭基团吸取，此时，检测不到荧光信号，与模板结合后，探针构象由发夹状变化为链状，报告基团和淬灭基团分离，可检测到荧光信号。

核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组有力办法，虽然基因组含量很低或死病毒也可以检测到。

本章将简介检测流感病毒聚合酶链式反映（PCR）。

流感病毒基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必要合成与病毒RNA互补DNA，即为cDNA。

逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA多聚酶，因而，扩增流感病毒基因组过程称为RT-PCR。

RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；一方面由逆转录酶将病毒RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反映经25～30个循环，使DNA产物达到倍增效果。

二、试剂器材设备和器械
咽拭子液配制：一瓶MEM液500ml，+8万单位庆大1.25ml，分装在5ml小管中，每管4ml。

小管最佳高压。

1、RNA提取试剂盒荧光PCR检测试剂盒
提取试剂盒组分：洗脱液（Elution Buffer）、载体核酸（Carrier RNA）、裂解结合增强液（Lysis/Binding Enhance）、裂解/结合液（Lysis/Binding Soln）、磁珠（RNA Binding Beads）、洗涤液1（Wash Soln 1）、洗涤液2（Wash Soln 2）
荧光PCR检测试剂盒组分：2×RT-PCR反映液（2×RT-PCR Buffer）、25×RT-PCR酶混合液（25×RT-PCR Enzyme Mix）、高G/C含量引物/探针检测增强剂（Detection Enhancer）、无核酸降解酶水（Nuclease-free Water）
无水乙醇无水异丙醇
2、生物安全柜移液器微型离心机微型漩涡式混合器微型离心管PCR管冷冻盒带滤头吸头低温冰箱U型样品解决板96孔磁力板
三、操作环节
一．样本解决（在样本解决区进行）
依照咽拭子标本数，计算好所需配制裂解液和磁珠混合液量，即待测样本数+阴性对照+
甲型对照+乙型对照+ 一种样本量为损耗。

需要配制液体仅仅是洗液：洗液1：向Wash Soln Conc. 1瓶中加入12毫升无水异丙醇（100%）。

摇匀后室温保存；洗液2：向Wash Soln Conc. 2瓶中加入32毫升无水乙醇（100%）。

摇匀后室温保存。

将含拭子转运液震荡2分钟，取50微升上清液进行核酸抽提。

剩余溶液-80℃保存。

1. 配制裂解/结合液
每反映1ul Carrier RNA，每反映65ul Lysis/Binging Conc.,每反映65ul 无水异丙醇。

摇匀后室温保存备用。

2. 配制磁珠混合液
每反映10ul Lysis/Binging Enhance，每反映10ul RNA binding Beads。

混匀后4℃保存备用。

3. 裂解/ 结合
U型板中顺次加入20ul磁珠混合液、50ul预解决后样品、130ul裂解/ 结合液。

漩涡振荡器上轻微振荡5分钟，完毕溶液混匀和核酸结合。

将U型板移至96孔磁力板上，静置3分钟。

将U型板保持在磁力板上，移去上清液。

4. 洗涤液1洗涤2次：
将U型板从磁力板上拿下，加入150微升洗涤液1，漩涡振荡30秒
将U型板移至96孔磁力板上，静置2分钟。

将U型板保持在磁力板上，移去上清液
用150微升洗涤液1再洗涤一次。

尽量吸干上清液。

5. 洗涤液2洗涤2次
将U型板从磁力板上拿下，加入150微升洗涤液2，漩涡振荡30秒
将U型板移至96孔磁力板上，静置1分钟。

将U型板保持在磁力板上，移去上清液
用150微升洗涤液2再洗涤一次。

尽量吸干上清液
6. 洗脱
将U型板从磁力板上拿下，漩涡振荡2分钟让剩余溶液挥发。

加入50微升Elution Buffer，漩涡振荡3分钟。

将U型板移至96孔磁力板上，静置4分钟。

纯化核酸在上清液中，可直接用于PCR 或转入干净离心管中-20℃储存。

二．扩增试剂准备与配备（在反映混合物配制区进行）
1、引物简介（不全，待续）：
2、甲型H1N1流感病毒及其他流感病毒Real-time PCR引物和探针稀释办法：
1．引物工作浓度（40μM）
配制办法：
（1）将新合成引物开盖前短暂离心（1rpm，15s）。

（2）用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100μM，可作为储存液。

（例如：假设合成引物每管2OD，若1OD量为4.75 nmol （0.00475μmol），则一管引物总摩尔数为2×4.75=9.5nmol，加水量为
10×9.5＝95μl）
（3）将100μM引物2.5倍稀释，此时浓度为40μM，可作为工作浓度。

2．探针工作浓度（20μM）
配制办法：
（1）将新合成探针管开盖前短暂离心（1rpm，15s）。

（2）用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100μM，可作为储存液。

（3）将100μM探针5倍稀释，此时浓度为20μM，可作为工作浓度。

以上配制仅仅是咱们工作中惯用配制详细配制核心是：注意各引物管实际所标记OD数，以及各型引物探针规定工作浓度。

此为下发引物探针：
溶解前4℃保存，溶解后-20℃或如下保存。

3、反映体系配制：
试剂盒中取出所需试剂，在室温下融化后，4000r/min离心30s，配制反映体系：
无RNA酶水（Rnase Free Water) 每反映5μl
2×RT-PCR Buffer 每反映12.5μl
上游引物每反映0.5μl
下游引物每反映0.5μl
探针每反映0.5μl
25×RT-PCR Enzyme Mix 每反映1μl
充分混合均匀，向每个PCR管（指定仪器专用）中每支各分20ul，转移至样本解决区。

三．加样（在样本解决区进行）
领回阳性RNA-20℃保存，5倍稀释使用。

在各设定PCR管（指定仪器专用）中每支分别加入提取样品RNA溶液以及阴、阳性对照各5ul，盖紧管盖后，4000r/min离心30s。

四．荧光RT-PCR反映（在检测区进行）
1．将装有反映体系和样品RNAPCR反映管放入荧光PCR检测仪内
2．循环条件设立
a) _50_℃ __30__min
b) _95_℃ __10__min
c) _95_℃ __15__sec
d) _55_℃ _31__sec (注：荧光收集设立在此步进行)
e) 从第c)步（_95_℃ __15__Sec）开始循环__44___周期
五.成果鉴定
1.成果分析条件设定
反映结束后，自动保存检测数据文献，调节噪音基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线最高点，读取成果。

2．成果描述及鉴定原则
在质控原则有效地状况下进行成果判断：阴性对照检测成果阴性；阳性对照Ct值≤28.0。

否则本次实验视为无效。

依照Ct值判断成果，Ct值无数值样本为阴性样本。

Ct值≤40.0样本为阳性样本；Ct值＞37.0样本建议重做。

重做成果无数值者为阴性，否则为阳性。

六、输入新程序：
生成程序文献程序文献包括一种程序，这个程序控制热循环仪运营参数，定制什么时候Opticon 2检测器对分派有样品、定量原则及空白孔中荧光进行测定。

程序环节可以在程序文献窗口中进行输入和编辑，并有一种列表和一种简图来显示各个环节。

按主文献中Protocol Setup一节New按纽可以生成一种新程序文献。

选取温度和热盖控制模式点击温度和热盖模式一栏Set Modes(设定模式)按纽，来显示热盖模式窗口，你可以定制运营时所使用温度控制办法（Control Method）及热盖控制(Lid Control)办法。

温度控制办法DNA Engine Opticon 2可用两种不同办法来控制模块温度，每一种办法可会影响样品加热速度和精准度。

1、计算控制是默认温度控制方式。

它是大多数程序所选用方式，它一致性好，迅速并且可靠。

在使用计算控制方式时，DNA Engine Opticon 2依照模板温度、样品管传热速度以及样品体积来预计样品温度。

由于这一预计是基于已知量及热传导规则，因而样品温度控制比模块温度控制方式更精准。

使用计算控制方式可以明显缩短程序运营时间。

此外，尚有助于保持酶活性及减少引物错配。

在计算控制方式下，变性时间普通为5-30秒，复性和延伸温度也可以减少，但其时间长短因反映不同而不同。

计算控制方式通过如下三个方面来缩短程序：
?8?5 通过短而精准模板温度过高来迅速地提高样品温度
?8?5 依照样品而不是模块达到目温度时间来拟定保温时间
?8?5 仪器依照容器型号及反映液体积来自动进行补偿
2、在模块控制方式中，DNA Engine Opticon 2系统依照程序来控制模块温度，而不是样品温度。

在控制样品实际温度方面，模块控制方式精准性比计算控制方式要差。

在模块控制方式中，样品温度始终落后于模块温度。

落后时间长短与容器型号及反映液体积关于，普通在10-30秒之间。

模块控制方式普通用于运营由其她模块控制方式热循环仪得来程序，如MJ Research公司PTC-100循环仪及PTC-150型循环仪。

热盖控制当样品被加热后，水汽会向上蒸发，积到管盖或平板盖上。

这会导致样品体积、反映物浓度以及酶学反映动力学变化。

使用热盖可以使反映容器上部温度比反映液温度高，从而减少水份蒸发。

DNA Engine Opticon 2系统有三种控制热盖方式：Constant(恒定)、Tracking(追踪)或Off(关闭)。

?8?5 Constant(恒定)：维持热盖一种特定温度。

要使用恒定热盖温度控制方式，可选取
Constant(恒定)，并输入30度到110度之间一种温度或用箭头滚到想要温度。

普通推荐比程序中最高温度高5-15度。

你还可以设定一种样品-模块温度，当热盖温度低于此温度时，热盖就会关闭。

在Lid Shutoff Temperature(热盖关闭温度)中输入一种1度至50度温度，或用箭头滚到想要温度。

?8?5 Tracking(追踪)：设定热盖温度比样品模块温度略高。

这一方式对于在30-70度之间长时间保温程序来讲是有用，从而不必将热盖温度始终保持在较高温度下。

普通设定比模块温度高5度。

要使用恒定追踪温度控制方式，可选取Tracking(追踪)，在Lid Temperature=Block Temperature +(热盖温度=模块温度+)一栏中输入1度到45度之间一种温度，使得热盖温度保持比模块温度高。

要定制样品-模板温度低于一定温度时，热盖自动关闭，可在Lid Shutoff(热盖并闭)中输入1-50度之间一种温度或用鼠标箭头来滚动选取。

注意：由于热盖没有降温能力，因而在模块温度变化较快时，热盖温度变化是跟不上模块。

由于热盖质量较大，其加热速度也比模块要慢。

?8?5 Off（关闭）：不给热盖提供电源。

在这模式中，样品会发生浓缩，其速率与保温温度及所用管或板密闭剂类型有关。

只有在使用油或石蜡封口时才干使用此选项。

点击OK将温度和热盖控制设定应用到程序中，也可选Cancel(取消)来关闭此窗口而不变化程序所用设定。

这一设定将出当前程序列表和图形显示上方Control and Lid Settings区域中。

设计和输入程序本节将举一种程序例子并简介如何输入程序环节，此外还简介程序选项。

举例如下：
1、94度保温30秒；
2、复性温度为温度梯度，在12列中从55度到65度；
3、读空白、定量原则及样品孔荧光强度；
4、72度保温一分钟；
5、重复1-4环节，增长24次，然后进入第6步；
6、通过解链曲线来检测反映产物纯度，详细环节为：从55度升温到90度，温度每升高1度，测定荧光强度10秒；
7、结束程序
输入新程序：
当你向程序中输入一种环节后，该环节描述就会出当前上部程序显示窗口中，同步下部也会浮现一种图示来阐明此环节温度和时间。

使用水平缩放滑块和滚动条可更清晰地观看程序简图。

在输入一种新程序前，可以看到显示窗口上方有一种加深了END（结束）环节。

Opticon 2监控软件中，所加入环节都在加深了环节之前。

温度环节温度环节拟定保温温度和时间长短。

如果不在程序中另处设定升降温速度，DNA Engine Opticon 2系统将以最迅速度达到此温度（参见本节最后”Manual Ramp Rate”）。

点击Temperature(温度)按纽进入保温环节（如举例中第1步和第4步）。

在Set Temperature to(设定温度为)一栏中输入一种0-105度之间温度，也可用滚动条来选取，如例子中第一步是94度。

在Maintain For(保温时间)一栏中输入保温时间，最长可到18小时。

点击时：分：秒并输入一种时间，也可用滚动条来选取，如例子中第一步00：00：30。

.你也可以选取Forever（永久）来将样品保存在某一温度下自定义一段时间。

普通用于程序完毕后将样品保存在较低温度中，推荐为10度。

在简图中永久保存表达为∞。

如不再作修改，点击Insert(插入)，将温度环节加到程序中。

此环节及时在上部程序显示窗口和下部简图中浮现。

注意，此时加黑环节又是END，这表白，下一种插入环节是在END 之前，第一步之后。

在将环节插入到程序中之前，你还可以通过选项来对温度环节进行修饰，可修饰选项涉及：
1、Manual Ramp Rate(升降温速率)：设定一种比最高速率低升降温速率。

可在0.1-2.5度每秒之间进行设定。

保温环节之间迅速升降温可以节约总反映时间10％-30％，并有助于减少非特异性扩增产物。

2、Increment Temperature(增长或减少温度)：修改温度环节，使得每个循环增长或减少一定温度（0.1-10度/循环）。

这一办法普通用于复性这一步。

在复性时，复性温度从比计算温度高某些开始，然后每个循环逐渐减少，达到甚至低于计算温度。

这种复性温度由高到低方略有助于在循环初期得到较抱负扩增产物。

3、Extend Time(延长或缩短时间)：修改温度环节，使得每个循环延长或缩短保温时间（1-60秒/循环）。

此办法普通用于延伸环节中慢慢增长延伸时间（普通为2-5秒/循环）。

在反映最后几种循环中，由于酶活性减少和模板分子数增长，在延伸期间，每个酶分子所在合成碱基数量大大增长，因而延长延伸时间有运用延伸更完全。

4、Beep When Completed(完毕时发出嘟嘟声)：当目温度达届时，机器发出嘟嘟声。

梯度环节温度梯度功能可以使你同步优化几种不同变性或复性温度。

从左到右，96孔样品模块温
度可以相差1度至24度。

最高温度为105度，最低可为30度。

点击Gradient(梯度)按纽可在程序中插入一种梯度环节。

最左边一列（Column 1）是温度梯度低温，其设定值应在30-104度之间。

在咱们例子中，Set temperature to 一栏中，L=55。

最右边一列（Column 12）是温度梯度高温，其设定值应在31-105度之间。

在咱们例子中，R=65。

最左边一列与最右边一列最小温差为1度，最大为24度。

在输入完温度梯度范畴之后，还要在Maintain for(保温时间)一栏中输入保温时间。

可以通过点击时：分：秒并输入一种时间，也可用滚动条来选取，如例子中第二步00：00：30度。

.你也可以选取Forever（永久）来将样品保存在某一温度下自定义一段时间。

如果不再作修改，点击Insert(插入)，将环节加到程序中。

梯度环节将在程序显示窗口中显示为第2步。

注意，此时加黑环节又是END，这表白，下一种插入环节是在END之前，第2步之后。

在将梯度环节插入程序中之间，你还可以选取Extend Time选项（参见”温度”一节对这些选项解释）。

梯度计算器要理解梯度保温时每一列精准温度，可点击Tool（工具）菜单，并选取Gradient Calculator(梯度计算器)。

请注意温度梯度并不是线性，中间孔温度间隔较大。

这是模块下加热器构造导致。

每个孔温度都非常精准。

温度梯度所得到成果可以在随后非梯度程序中得到较好成果。

读板环节插入一种读板环节可以批示Opticon 2检测器对样品、定量原则及空白孔进行荧光测定。

读板在上一种保温环节完毕之后及时进行，如举例中第2步。

读板在当前保温温度下完毕，然后才开始下一步，如举例中第4步。

要插入一种读板环节，请点击Plate Read(读板)按纽，读板环节就会插入到程序中。

在咱们例子中，读板环节显示为第3步，在简图中，读板用一种眼型图标来表达。

增长各种温度环节、梯度环节和读板环节要增长各种温度环节、梯度环节和读板环节，可按恰当按纽，并按照如下环节指引进行。

在咱们例子中，第4步是72度保温00:01:00，没有其她选项。

循环环节循环环节目是让许多重复环节不必一步一步输入和显示。

当程序运营到循环环节时，程序又回到指定某一步，并运营这一步到循环环节之间所有环节。

当循环进行了指定次数之后，程序进行到循环环节下一步。

在咱们举例中，第5步是回到第1步循环环节。

再重复第1-4步24次，总共是25次，然后进行第6步。

这些都包括在了一种循环环节之中。

点击Goto(循环)按纽，输入程序返回环节号。

在咱们例子中，Goto栏中输入是1，How Many More Times?一栏中输入是24。

这个第5步将指引程序在进入第6步之前，重复1-4步共24次。

点击Insert(插入)按纽，将循环环节加入程序中去。

解链曲线环节：
解链曲线可用来拟定特定片段以及分析产物均一性。

解链曲线图受到诸多因素影响，其中涉及产物数量和浓度、片段长度和G+C含量以及其她某些影响核酸变性温度因素，如缓冲液等。

要进行解链曲线环节，可点击Melting Curve(解链曲线)按纽。

输入一种Starting Temperature(开始温度)（0.0-99.0度），以及一种Ending Temperature(结束温度)（1.0-100.0度）。

在咱们例子中，开始和结束温度分别为55度和90度。

此外，还要在进行解链曲线环节期间，让Opticon 2检测测定荧光强度。

通过Temperature Increment Between Reads一栏输入一种温度（0.1-10.0度）来拟定温度每升高多少度进行一次读板，通过在Hold Time Between Reads 一栏输入一种时间（1秒-1小时）来拟定读板期间，这一期间，温度要保持恒定。

普通推荐温度每上升0.2度读板一次，读板期间为1秒。

点击Insert（插入）按纽将解链曲线环节增长到程序中。

每个程序中只能有一种解链曲线环节。

编辑某一环节要想编辑程序某一环节，一方面点击程序显示窗口中这一种环节，使其加深，然后点击Edit Step（编辑环节）按纽。

此环节各种参数就会显示出来，修改成你想要之后，点击Replace(替代)按纽将编辑后环节加入程序中，也可点击Cancel(取消)按纽来取消这次编辑。

删除某一环节要想删除程序某一环节，一方面点击程序显示窗口中这一种环节，使其加深，然后点击Delete（删除）按纽将此环节从程序中删除。

剩余程序各环节会自动重新编号。

在已有环节中插入一种环节要想在已有环节中插入一种环节，一方面在程序显示窗口中点击想要
插入新环节后一种环节，使其加深。

所有加入环节都在此环节之前。

然后点击相应按纽来插入你想插入环节。

当你输完所有程序文献参数之后，点击程序文献窗口左上角OK按纽来保存程序文献，并回到主文献窗口。

主文献程序设计一节会显示程序简图、总读板次数、解链曲线以及大概运营时间。

点击Cancel（取消）按纽也可以不保存程序文献并回到主文献窗口。

融解曲线分析融解曲线可用来鉴别特异性片段或评估样品同质性。

融解曲线图受到各种因素影响，如片段浓度与数量、每个片段长度及G+C含量，尚有其她因素如缓冲液条件等都会影响核酸融解温度。

Opticon 2 可以自动完毕融解曲线。

这一分析可用于各种用途，涉及恒温实验、区别片段大小，运用Opticon 2 96个样品能力来完毕高通量终点分析。

要完毕一种与循环无关融解曲线分析，点击Melting Curve 按纽。

输入一种Starting Temperature(开始温度)（0.0-99.0度），以及一种Ending Temperature(结束温度)（1.0-100.0度）。

此外，还要在进行解链曲线环节期间，让Opticon 2检测测定荧光强度。

通过Temperature Increment Between Reads一栏输入一种温度（0.1-10.0度）来拟定温度每升高多少度进行一次读板，通过在Hold Time Between Reads 一栏输入一种时间（1秒-1小时）来拟定读板期间，这一期间，温度要保持恒定。

普通推荐
温度每上升0.2度读板一次，读板期间为1秒。

点击Insert 按纽来增长一种融解曲线环节到程序中。

每个程序只能有一种融解曲线分析环节。

保存一种程序文献要保存一种新生成程序文献，从主文献窗口程序设计一节中选Save按纽。

在保存窗口File name一栏中输入一种适当名字。

点击Save按纽就可保存为.prot文献了。

固然仅仅这些是远远不够，还需要做事情尚有诸多...以上总结仅仅适合咱们试剂和仪器。

仪器使用阐明见附件。