真菌病害拮抗菌的筛选及其对多种植物病原真菌的拮抗活性测定

真菌病害拮抗菌的筛选及其对多种植物病原真菌的拮抗活性测
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汪茜;胡春锦;黄思良;柯仿钢;黎起秦
【摘要】针对广西境内常见多发的12种植物真菌病害,对柑橘、香蕉、甘蔗、辣椒、药用植物等作物根际土壤进行拮抗菌筛选试验.结果从不同作物根际土壤中共分离得到386株菌株,其中有拮抗作用的34株,平皿拮抗效果较好的16株;再经复筛,得到一株对柑橘炭疽菌有较好抑制效果的拮抗菌Bs55;对峙培养试验表明,Bs55菌株对12种常见病原真菌具有较强的抗菌活性,抑菌率最高达87.7%.拮抗菌Bs55具有拮抗作用强、能大量繁殖、抑菌谱广等特点,是具有较好利用前景的生物防治材料.
【期刊名称】《南方农业学报》
【年(卷),期】2010(041)007
【总页数】4页(P675-678)
【关键词】Bs55菌株;枯草芽孢杆菌;病原真菌;拮抗活性
【作者】汪茜;胡春锦;黄思良;柯仿钢;黎起秦
【作者单位】广西大学农学院,南宁,530005;广西农业科学院微生物研究所,南宁,530007;广西农业科学院微生物研究所,南宁,530007;广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室,南宁,530007;南阳师范学院生命科学与技术学院,河南南
阳,473061;广西大学农学院,南宁,530005;广西大学农学院,南宁,530005
【正文语种】中文
【中图分类】S476+.1
真菌病害是阻碍植物生长、影响作物产量的主要病害［1］，给农业生产带来了严重危害。

土壤是各种微生物良好的栖息场所，生存着许多具有相互拮抗作用的微生物。

在生防菌株的筛选上，考虑到植物与微生物之间的相互作用关系，人们把重点放在从植物根表面或根际土壤中筛选，这样筛选出的微生物接种后在植物根表面具有很好的定殖能力［2］。

本研究针对广西境内常见多发的12种植物真菌病害，从不同作物根际土壤中筛选拮抗菌，为开发广西微生物资源，筛选与环境相容性好的微生物农药奠定基础。

供试病原菌有柑橘炭疽病菌［Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Sacc.］、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solaniKühn）、玉米大斑病菌［Exserohilum turcicum （Pass.） Leonard ＆ Suggs］、玉米小斑病菌［Cochliobolus heterostrophus （Dreschl.）Dreschl.］、茉莉白绢病菌（Sclerotium rolfsiiSacc.）、辣椒炭疽病菌［Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Sacc.］、香蕉炭疽病菌［Colletotrichummusae（Berk.＆Curt）Arx］、冬瓜疫霉（Phytophthora drechsleriTucker）、龙眼链格孢黑斑病菌［Alternaria alternata （Fr.） Keissler］、香蕉大灰斑病菌［Curvularia lunata （Wakker）Boedijin］、香蕉叶缘枯斑病菌（Alternaria musaeBour.et Bat）、杨桃炭疽病菌［Colletotrichum gloeosporioides（Penz.） Sacc.］等12种，均由广西农业科学院微生物研究所保存、提供。

菌株在PDA培养基上28℃活化培养后供试。

拮抗菌分离培养基采用NA培养基［3］（牛肉浸膏10 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、水1000 mL，pH 7.0～7.2），拮抗菌筛选培养基采用PDA 培养基（马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂15 g、水1000 mL）。

从广西农业科学院、南宁市金陵镇、金光农场、广西大学农场和广西药用植物园等
地采集柑橘、香蕉、甘蔗、辣椒、药用植物等不同种类作物根际土壤，分别称取土壤10 g，放入90 mL有玻璃珠的无菌水三角瓶中，200 rpm摇匀20 min，制成土壤悬浮液，梯度稀释成10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。

用接种环从10－3、10－4悬浮液中各沾取1环，分别在平板上划线［4］，于28℃下倒置培养，48 h后观察，挑取不同形态单菌落，纯化后保存，待测。

1.3.1 初筛以柑橘炭疽病菌为测试菌进行拮抗菌初筛。

将直径5 mm的病菌原菌块置于PDA平板中央，在其周围4个等距离位置上分别点接4种不同的细菌，每处理3次重复。

培养3～5 d后，观察不同细菌是否对致病菌生长有抑制作用及抑菌带的大小（取3次重复的平均值），并按抑菌圈半径的大小将拮抗菌分为强、中、弱三类，抑菌圈半径＞10 mm为强，5～10 mm为中，＜5 mm为弱。

1.3.2 复筛将有抑菌作用的菌株作进一步筛选。

采用平板对峙法［5］，在培养皿中央接种培养7 d的柑橘炭疽病菌菌饼（直径5 mm），离该菌饼约3 cm处，用接种环沾取培养48 h的拮抗菌，在平板对称两侧各划一条细线，28℃培养，以只接种病原菌的平板为对照，待对照长满皿时测量柑橘炭疽病菌的菌落生长直径，每处理重复3次。

按下式计算菌落生长抑制率：
菌落生长抑制率＝(对照菌落净生长距离-处理菌落净生长距离)/对照菌落净生长距离×100%
1.3.3 拮抗菌对多种病原真菌抑菌力测定采用平板对峙法，将菌株Bs55在PDA 培养基平板上划线，距划线处4 cm接种病原菌菌饼（直径5 mm），28℃培养，以仅接种病原菌的平板为对照，待对照长满皿后测量病原菌的生长直径，计算抑制率。

每处理重复3次。

从不同作物根际土壤中共分离得到386株菌株，其中有拮抗作用的34株，平皿拮抗效果较好的16株；再经过复筛，得到一株拮抗活性最强的细菌Bs55。

Bs55分离自广西药用植物园鸡血藤根际土壤，经鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus
subtilis）。

以柑橘炭疽病菌为单一靶标菌与所有分离菌株进行对峙培养，结果显示，不同类群的微生物出现拮抗菌株的频率各有不同，其中25株放线菌中有4株对柑橘炭疽病菌具拮抗作用，拮抗菌株检出率为16.0%（表1）；不同类别作物根际分离物中拮抗菌的检出率也不同，其中甘蔗根际拮抗菌株的检出率最高，为12.5%，其次为
柑橘9.7%，玉米根际的拮抗菌检出率最低，为3.1%（表2）。

采用平板对峙法检测Bs55对12种病原真菌的抑制效果。

结果显示（表3），
Bs55菌株对供试的12种病原菌表现出较高的抑菌活性，抑菌率在59.9%～87.7%之间，表明生防菌Bs55对不同病原真菌的抑菌力虽然存在明显差异，但有较广的抑菌谱。

Bs55菌株对部分病原真菌的抑菌效果见图1。

微生物在自然界的分布非常广泛，地球上除了火山区域外，无论是土壤、空气、水、枯枝烂叶、植物病株、腐烂果实等都含有众多微生物［7～9］。

Filonow等［10］不从苹果上分离拮抗菌，而以从其他生境如空气、土壤、海水、叶片、大蒜等上分离到的28种酵母为材料，筛选到能有效防治苹果灰霉病的土生隐球酵母（Cryptococcus humicola NRRL Y1266）、花状线黑粉菌（Filobasidium floriformeNRRL Y7454）、红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloidesNRRL Y 1091）、掷孢酵母（Sporobolomyces roseusFS－43－238）等几种酵母。

可见，拮抗菌的筛选不是教条的，只要有抑菌效果且无害，都可以利用。

枯草芽孢杆菌在自然界中广泛存在［11～13］，对人畜无毒无害，不污染环境，
能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，克服了传统化学农药污染环境、危害人畜、易产生抗性等缺点，具有选择性强、安全、原料简单等优点［14～18］。

美国迄今已有4株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局（EPA）商
品化或有限商品化生产应用许可，它们分别是GBO3、MBI600、QST713和解淀粉枯草芽孢杆菌变种（B.subtilis var.amyloliquefaciensFZB24），其中生物杀菌
剂QST713为AgraQuest公司产品，商品名为Serenade，主要用于防治水果采收前后病害［19］。

我国林开春等［20］公布的含有枯草芽孢杆菌CCTC
CM204085的防腐保鲜剂（公开号：1853489）在果实采后防腐保鲜方面的应用效果较好。

杨佐忠等［21］利用枯草芽孢杆菌PRS5处理采后的苹果和脐橙，也达到了较好的防腐保鲜效果。

本研究从所采集土样中分离纯化出的386株菌株中，通过多步筛选，得到对12种病原真菌抑制效果最强的枯草芽孢杆菌Bs55作为目标拮抗菌。

Bs55对12种病原真菌均表现出显著的抑制作用，抑菌率均在59.9%以上，最高达87.7%，具有广谱抑菌活性，但对病原真菌的抑制力各有侧重。

目前有很多关于利用生防细菌防治植物真菌病害的报道，但从整体上看主要存在防治谱窄的问题［2］。

另外，生防菌发挥生防作用还涉及其在不同土壤环境中的定殖。

本研究从广西红壤土类型、气候条件、强紫外线条件下筛选出的拮抗菌Bs55具有拮抗作用强、能大量繁殖等特点，其菌株本身具有广谱生防潜力，是有较好利用前景的生物防治材料。

因此，生防菌Bs55具有很好的工业开发前景和应用价值，有必要对其菌株本身及其抑菌机理进行深入研究。

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（责任编辑麻小燕）。