菌种传代与保藏
菌种保藏方法
菌种保藏方法
菌种保藏方法，如下：
1、传代保藏，传代保藏菌种是微生物保存中最常用的方法之一。
很多微生物在低温或者干燥处理时，会很快死亡，为了保存菌种的活性，就要定期不断的进行菌种转接、培养后再保存。
2、斜面低温保藏，将待保藏的菌种接种在合适的斜面培养基上，在相应的条件下培养至得到充足的菌体或者孢子，随后密封试管置于4℃左右保存，具体保存温度按照保存菌种设定。
保藏时间依微生物的种类从1个月到4个月不等。
3、冷冻干燥保藏，冷冻干燥保藏法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，这种方法适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年。
我国大多数生物制品菌种都是采用该法保藏。
4、半固体穿刺保藏，配制半固体培养基，高压湿热灭菌后倒于无菌试管中至约1/3，待培养基凝固，用接种环从平面培养基上挑取单菌落，穿入培养基若干次。
在合适的条件下进行培养至菌体旺盛生长，之后密封试管，根据菌种特点在4 ℃左右或者凉爽干燥处保存。
保存时间至少可以达到
1 年，对于有些菌种甚至能达到20 年之久。
5、液氮超低温保藏，液氮超低温保藏法是菌种长期保藏的最有效最可靠的方法。
液超低温保藏法是把菌种装在含有冷冻保护剂的安瓶瓶内，将该安瓶瓶放人液氮（-196℃）中保藏。
菌种传代与保藏PPT
食品安全保障
通过菌种传代与保藏技术的优化， 保障食品生产和加工过程中的食品 安全。
环境保护
优化菌种传代与保藏技术，降低生 产过程中的环境污染，促进可持续 发展。
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04 菌种传代与保藏的未来发 展
菌种传代与保藏的技术创新
自动化技术
利用机器人和自动化设备 进行菌种传代与保藏，提 高工作效率和准确性。
基因编辑技术
通过基因编辑技术改良菌 种，提高其生产效率和适 应性。
生物反应器技术
利用生物反应器进行大规 模的菌种培养和保藏，实 现工业化生产。
菌种传代与保藏的科研进展
当菌种长到适宜大小时，可将其保存或进 行下一步实验，同时记录相关信息。
02 菌种保藏
菌种保藏的目的
01
02
03
长期保存菌种
通过保藏菌种，可以在长 时间内保持菌种的遗传稳 定性和活性，避免菌种衰 退或变异。
防止菌种丢失
对于具有重要应用价值的 菌种，通过保藏可以防止 意外丢失或遗忘。
维持菌种多样性
保藏多种类型的菌种，有 助于维持生物多样性，促 进微生物资源的保护和利 用。
新型保藏方法研究
研究更加高效、稳定的菌种保藏方法，如低温、真空、 干燥等。
菌种遗传稳定性研究
探究菌种在传代过程中的遗传稳定性，防止菌种变异 和退化。
菌种互作机制研究
研究不同菌种之间的互作机制，为菌种组合和优化提 供理论支持。
菌种传代与保藏的社会影响
工业生产变革
菌种传代与保藏技术的发展将推 动工业生产的变革，提高生产效
保存菌种
通过传代可以将菌种保存起来，以备将来使 用或进行研究。
《菌种传代与保藏》课件
去除杂菌和变异株
在菌种传代和保藏过程中，难免会混入杂菌或产生变异株。通过鉴定和纯化，可以去除这些杂菌和变 异株，保持菌种的纯度和一致性。这有助于保证实验的可重复性和结果的可靠性。
02 菌种传代技术
液体培养传代法
总结词
通过液体培养基进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到液体培养基中，经过一定时间的培养后，再进行菌种分离和纯化 ，用于后续的实验和研究。该方法操作简便，适用于大规模生产。
固体培养传代法
总结词
在固体培养基上进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到固体培养基表面，经过一定时间的培养后，形成菌落并进行纯化。 该方法常用于分离和鉴定微生物，能够较好地保持菌种的特性。
真空冷冻干燥保藏法
结合低温与干燥两种保藏方法，通过 真空冷冻干燥技术延长菌种存活时间 的方法。
将菌种在低温下进行真空处理，去除 水分，然后保存在干燥的环境中，这 种方法可以显著延长菌种存活时间， 并保持菌种的活性和稳定性。
液氮保藏法
通过将菌种保存在极低温度的液氮中，以延长菌种存活时间 的方法。
将菌种悬浮在液氮中，利用液氮的超低温特性（-196°C）来 延长菌种存活时间。这种方法可以长期保存菌种，但需要专 业的设备和操作技术，且成本较高。
03
及时发现并处理变异菌株
在菌种传代过程中，应密切关注菌种的生长和性状变化。一旦发现变异
菌株，应及时进行分离和鉴定，并采取相应的措施进行处理，以防止其
扩散和影响后续实验结果。
保持菌种的纯度和活性
定期进行菌种鉴定和纯化
菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程
菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程传代用菌种采用甘油冷冻管保存法。
将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合甘油并分装至冷冻管中，冷冻管标注菌种名称、代数、保存日期等信息，然后放置于-80℃冰箱中保存。
每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。
5.3.2.2液体石蜡保存法对于一些难以保存的菌种，采用液体石蜡保存法。
将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合液体石蜡并分装至玻璃瓶中，瓶口用铝箔密封，标注菌种名称、代数、保存日期等信息，保存温度为-70℃。
每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。
5.4菌种的传代传代用菌种每年进行一次复苏和传代。
复苏后，将菌种接种至适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，按照规定的传代代数制备传代用菌种，并及时更新菌种库存记录。
5.5菌种的使用使用菌种前，应先确认菌种的品质和纯度，并按照规定的传代代数制备工作用菌种。
使用后，应及时更新菌种库存记录，并进行相应的消毒处理。
5.6菌种的销毁菌种在使用过程中，如出现变异或污染等情况，应及时进行应灭活处理，并填写《菌种销毁记录表》，经主管部门审核同意后，进行销毁处理。
菌种库存中长期未使用的菌种，应定期进行清理和销毁处理。
菌复苏、复壮；Sabouraud葡萄糖琼脂培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮；青霉素-链霉素琼脂培养基：用于铜绿假单胞菌复苏、复壮。
5.4.1.1.3复苏步骤：1.取出保存好的菌种管，用接种针在酒精灯上消毒；2.将接种针在75%酒精中消毒，再用酒精棉球擦拭消毒；3.用接种针在相应的培养基上进行接种；4.置于适宜温度下孵育，待菌落出现后进行传代或进行实验。
5.4.1.2标准菌株的确认通过形态学、生理生化特性、分子生物学等方法进行鉴定，确认菌株的纯度和种属。
5.4.1.3标准菌株的传代将菌株从原始保存方式中转移到新的保存方式中，确保菌株的保存和传承。
传代次数不宜过多，一般不超过10代。
《菌种的传代与保藏》课件
04
CATALOGUE
菌种传代与保藏的注意事项
防止菌种污染与变异
01
02
03
严格控制传代过程
在菌种传代过程中，应采 取无菌操作，避免污染。
选择适当的培养基
选择适当的培养基，以保 证菌种的正常生长和代谢 。
避免频繁传代
频繁传代会导致菌种变异 ，因此应合理控制传代次 数。
保持菌种遗传稳定性
通过菌种传代，可以持续获得相同特 性的菌株，为科学研究、产品开发、 质量控制等提供可靠的实验材料。
菌种保藏的原理与重要性
菌种保藏是长期保存菌种的有效方法，其原理在于创造不适宜菌种生长的环境条 件，使其处于休眠状态，从而延长菌种的保存期限。
菌种保藏对于保护生物多样性、防止菌种丢失、保障实验结果的可靠性等方面具 有重要意义。
尊重他人的知识产权，不得侵犯他 人的合法权益。
05
CATALOGUE
菌种传代与保藏的应用前景
在生物科学研究中的应用
要点一
基础生物学研究
菌种传代与保藏技术对于基础生物学研究至关重要，如微 生物分类学、进化生物学和生态学等。通过菌种传代与保 藏，科学家可以深入研究微生物的生理生化特性、基因组 学和蛋白质组学等，以揭示微生物生命活动的奥秘。
03
CATALOGUE
菌种的保藏技术
低温保藏法
总结词
一种常用的菌种保藏方法，通过降低温 度来降低菌种的代谢活性，延长菌种存 活时间。
VS
详细描述
将菌种保存在低温环境下，如冰箱的冷藏 室或冷冻室内，使菌种处于休眠状态，降 低其代谢活性，减少菌种变异和污染的机 会。适用于大多数微生物菌种的短期保藏 。
业的发展。
生物农药和生物肥料
菌种的传代、保藏及菌液
微生物菌种的使用、保存与管理、验证。 微生物菌种的使用、保存与管理、验证。 一.制定菌种使用保藏管理程序 （1）做好菌种的来源登记，确保溯源性 清楚. 清楚. （2）菌种的接收与复活
标准菌种的保藏形式 我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式 包装于熔封的厚玻璃容器中。在这种容器中， 微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须 的环境条件，一般呈休眠状态。
铜绿假单胞菌
形态特征：G 形态特征：G-杆菌、直或微弯、较细长、散在排列、无 芽胞、有荚膜、单端有1 芽胞、有荚膜、单端有1～3根鞭毛。 培养特性：专性需氧，最适温度为35℃，但在42 ℃生 培养特性：专性需氧，最适温度为35℃，但在42 长是铜绿假单胞菌的一个特点。营养无特殊要求，普通 培养基上均能生长，菌落大小不一，扁平湿润，边缘不 齐，可产生各种水溶性色素，故使培养基变为蓝绿色。 在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长，常在其表面形成 菌膜。 分离培养：十六烷三甲基溴化铵培养基 生化反应：氧化酶试验（＋）（培养物呈粉红色渐变为 紫红色） 绿脓菌素试验（＋）（盐酸溶液呈粉红色）
大肠埃希菌—EMB平板菌落形态 大肠埃希菌—EMB平板菌落形态
大肠埃希菌— 大肠埃希菌—显微镜下菌体形态
大肠埃希菌— 大肠埃希菌—电镜下菌体形态
金黄色葡萄球菌
形态特征： G＋球菌、呈单个、成双、短链或排 列呈葡萄串样，无鞭毛、芽胞。 培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，在普通营 养琼脂培养基上形成较大的圆形、光滑、湿润、 隆起、边缘整齐、不透明的菌落。菌落因种不同 而出现不同的色素。在营养肉汤培养基中呈均匀 混浊生长。 分离培养：高盐甘露醇培养基 生化反应：血浆凝固酶试验结果：＋ 生化反应：血浆凝固酶试验结果：＋
枯草芽孢杆— 枯草芽孢杆—琼脂平板的形态
菌种传代与保藏
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感谢聆听
菌种传代与保藏
目
CONTENCT
录
• 引言 • 菌种保藏 • 菌种传代与保藏的应用 • 总结与展望
01
引言
目的和背景
菌种传代与保藏是微生物学实验中的重要环节，其目的是保持菌 种的活性和纯度，确保实验结果的准确性和可靠性。
在生物学、医学、农业和工业领域，菌种传代与保藏是进行科学 研究、产品开发和生产的重要基础。
传代与保藏对菌种遗传稳定性的影响研究深入
近年来，关于传代与保藏对菌种遗传稳定性的影响研究逐渐深入，研究者们通过基因组学、表观遗传学 等技术手段，揭示了菌种在传代与保藏过程中的遗传变异机制。
未来研究方向与挑战
探索新型传代与保藏方法
随着生物技术的不断发展，未来需要继续探索新型的菌种传代与保藏方法，以提高菌种的活性和 稳定性，减少遗传变异。
菌种传代注意事项
80%
保证无菌操作
在传代过程中，要严格遵守无菌 操作规程，避免交叉污染。
100%
保持菌种纯度
传代时要注意保持菌种的纯度， 避免混入杂菌或其它微生物。
80%
控制传代次数
传代次数过多可能导致菌种退化 或变异，因此要控制好传代次数 。
菌种传代的影响因素
培养基成分
不同的培养基成分对菌种的生 长和代谢有影响，进而影响传 代效果。
温度和湿度
温度和湿度对菌种的生长和代 谢也有影响，进而影响传代效 果。
氧气和二氧化碳浓度
氧气和二氧化碳浓度对某些菌 种的生长和代谢有影响，进而 影响传代效果。
02
菌种保藏
菌种保藏方法
低温冰箱保藏法
将菌种保存在-70℃至-30℃的低温冰 箱中，以降低菌种的代谢活性，延长 菌种存活时间。
菌种的传代与保藏12
大肠杆菌斜面
金黄色葡萄球菌斜面
生孢梭菌 需气菌、厌气菌培养基
白色念珠菌 真菌培养基
各类菌种保藏条件及时间
菌种
培养基
保存温 度
传种时间
细菌
一般多用于营养琼脂 或根据菌种规定选用 培养基
4~6℃
芽 孢 杆 菌 3~6 个 月 ， 其它细菌每个月
酵母菌
一般用麦芽汁琼脂或 麦芽汁酵母膏琼脂
6个月 2年
6个月
（3）特点： 本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法， 该法主要使菌种与空气隔绝。
（4）注意事项： ① 保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征 后，方可进行保藏。 ② 保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥， 需重新移种。 ③ 使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一 边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培 养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上 即可使用。
固体高层培养基中，培养好备用。
取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管 10~15ml，加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压灭 菌30min，取出置37℃温箱或 110~ 170 ℃烤箱 中 1 ~ 2 h 或干燥器内除去液体石蜡中的水分。
将上述液体石蜡加 入培养好的菌种试管 内，液体石蜡液面以 高出培养基最上端 1 ㎝为宜，将试管直立， 放 入 4℃ 冰 箱 中 保 藏 。
三、常用菌种保藏方法
(一) 菌种保藏的原理 根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造
的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细 胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不 至于死亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥、 缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代 谢作用。 低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。
药品检验用菌种的传代和保藏
标准菌种的保藏形式
我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的 形式包装于熔封的厚玻璃容器中。在这 种容器中，微生物通常与赋形剂共存， 由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈 休眠状态。
4
纯培养
所谓微生物的纯培养是指在一个微 生物的菌落形成单位中，所有的微生物 细胞或孢子都属于生物学的同一个种。 严格地说，纯培养是在培养基上由一个 细胞或孢子分裂、繁殖而产生的后代。 在该细胞或孢子的生长过程种，不受其 他微生物的侵犯，不会在培养物中产生 另外微生物种的后代，在整个生长过程 中不发生变异或死亡。
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大肠埃希菌
该菌为微生物限度检查规定不得检出 的控制菌，有一整套完整的鉴定手段， 也可参考该方法用于判断所保藏的菌种 有无发生变异。 该鉴定方法主要内容即为经典的 IMViC试验，结果为++--。
45
铜绿假单孢菌
确认该菌未发生变异的主要方法为： 1、通过显微鉴别，为单个，成对或呈短链排列 的杆菌，有运动性，革兰氏染色为阴性。 2、营养琼脂斜面上菌苔生长旺盛，薄，白色， 闪光，培养基变为绿色至暗褐色或黑色，发荧 光。 3、生化试验可选做明胶穿刺、吲哚和硝酸盐还 原试验，结果迅速液化明胶，液体呈浅黄绿色 或浅蓝绿色，吲哚试验阴性，硝酸盐还原试验 阳性。
36
菌种管理
1、标准菌种必须从认可的菌种收集途经获得；实验室 必须建立和保存所有菌种的收集、贮藏、保存、确认 试验的记录。 2、实验室应有文件管理标准菌种（从原始菌种到工作 用菌种）。该程序应包括： a:标准菌种必须定期传代，并做确认试验，包括实验室在 所需要关键诊断指标，实验室必须记录并保存。 b：每一子菌种都应以适当标签、标记来表示名称、标准 号、接种日期和传代日期。 C:每一子菌种都应以标记从原始菌种传代到工作用菌种的代数； 记录菌种生长的培养基及培养条件；菌种生存条件等。
菌种的保藏管理制度
菌种的保藏管理制度一、前言随着微生物研究领域的不断发展，菌种的保藏和管理变得日益重要。
菌种在科学研究、工业生产、医药卫生等领域起着重要作用。
菌种的保藏管理制度不仅是对菌种进行有效保护和管理的重要手段，也是对科研机构和生产企业负责任的表现。
本文将从菌种的保藏目的、原则、保藏管理程序、管理机构和管理人员的职责等方面进行详细阐述，以便各单位建立完善的菌种保藏管理制度。
二、菌种的保藏目的1. 保证菌种的纯度、活力和保存性能；2. 保证菌种在长时间内可以被有效使用；3. 促进菌种资源的共享和交流；4. 保证菌种在科研、生产和应用中的安全性和可追溯性。
三、菌种的保藏原则1. 选择适宜的保藏方法，确保菌种的长期保存和传代；2. 严格按照操作规程操作，保证菌种的纯度和活力；3. 建立完善的菌种信息档案，保证菌种的可追溯性；4. 定期检测保藏菌株的纯度和活力，确保菌种的质量；5. 加强对菌种的安全管理，防止菌种的交叉污染和泄露。
四、菌种的保藏管理程序1. 菌种的采集、分离和鉴定（1）菌种的采集应按照规范程序进行，同时将采集信息记录在案，包括采集地点、采集时间、样品编号等；（2）菌种的分离和鉴定应由具有相关资质和经验的专业人员进行，并建立菌种信息档案。
2. 菌种的保存和传代（1）选择适宜的保存方法，如低温、冷冻、干燥等；（2）菌种的传代应按照规范程序进行，记录传代信息并定期对保存菌株进行检测。
3. 菌种的信息管理（1）建立菌种信息档案，包括菌种的采集信息、分离和鉴定信息、保存和传代信息等；（2）对菌种信息进行分类归档，方便查阅和管理。
4. 菌种的质量控制（1）定期对保存菌株进行纯度和活力检测；（2）对检测结果进行记录和分析，并定期进行质量评估。
5. 菌种的安全管理（1）加强菌种管理的安全防护措施，防止菌种的交叉污染和泄露；（2）对涉及菌株管理的人员进行相关培训和教育，提高他们的安全意识。
六、菌种的管理机构和管理人员的职责1. 菌种管理机构（1）设立专门的菌种管理机构，负责菌种的保藏和管理工作；（2）建立菌种管理制度，制定相关管理规定和操作程序。
菌种保存方法
菌种保存方法微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
保藏方法大致可分为以下几种：1．传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。
2．液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
3．载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
4．寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。
病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。
5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
三、器材细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
菌种传代与保藏作业指导书
菌种传代与保藏作业指导书1、标准菌得来源标准菌株必须购买具备资质得菌种保藏中心提供得冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。
2、标准菌得验收从菌种保藏中心购买得原始菌种管就是玻璃安瓿装得冻干菌，接收同时应检查就是否有随菌种附有得相关资料。
接收菌种时应检查安瓿得数量与名称，与每一支安瓿得完整性。
在相应得菌种接收记录上记上所有得关于菌种得信息，如名称、数量与接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入得0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。
购买得已接种好得菌种斜面（3代）应检查菌种管就是否完好。
储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。
3、标准菌得复苏、复壮及标准储备菌株得制备3、1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3、2培养基改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮、营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
3、3操作步骤：a、打开洁净工作台。
b、在安瓿得外表面用75%得酒精擦拭并让其自然风干。
c、用一小砂轮在安瓿得上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。
d、以无菌方法用一无菌吸管从已准备好得上述液体培养基中移取0、5～0、8 ml到安瓿中。
e、轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种与液体培养基充分混合并完全溶解。
f、用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应得液体培养基。
g、根据安瓿上所标明得不同菌种类型而将其培养于相应得温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。
观察就是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。
h、取经复苏后得上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。
《中国药典》菌种的传代与保藏
酵母菌
一般用麦芽汁琼脂或 麦芽汁酵母膏琼脂
4~6℃
一般4~6个月
丝状真 菌
一 般 用 PDA 琼 脂 、 蔡 氏琼脂或麦芽汁琼脂 等
4~6℃
精品课件
每4个月移植一次 （每于推广；一
般不需要另选择保藏用培养基；对大多数微 生物都适用。
缺点是——保藏期太短；传代次 数多，易发生变异及污染。
▪ 适用范围：适用于保 藏部分霉菌，酵母菌 和放线菌，对细菌保 藏效果较差。
精品课件
液体石蜡对各类菌种保藏效果
菌
种 菌株数
细菌
87
霉菌
586
酵母菌
400
放线菌
380
保存时间 （年）
5 5 2 4
存活率 （%）
20.9 83.6 88.9 91.3
精品课件
（3）特点： 本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法，
若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进 行移种。
精品课件
1.琼脂斜面低温保存法
▪ （1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接 种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上， 按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把 培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养 基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏 管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱 中保藏。每隔 2~3个月移种一次，继续进行保 藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可 保藏半年 ~ 一年。有的甚至更长时间。
▪ （2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。
精品课件
大肠杆菌斜面 斜面
金黄色葡萄球菌
精品课件
生孢梭菌 白色念珠菌 需气菌、厌气菌培养基
真菌培养基
精品课件
各类菌种保藏条件及时间
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。
2、传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。
常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。
方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。
保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤（5克）置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基（以含水量为土壤最大持水量的60%为宜），然后高压灭菌。
菌种的传代与保藏
分子生物学鉴定
总结词
通过分析菌种的基因组或特定基因序列，对菌种进行高精度鉴定。
详细描述
分子生物学鉴定主要基于DNA或RNA的序列分析，通过比较基因组的相似性和差异性，可以更准确地 确定菌种的分类地位和亲缘关系。该方法具有很高的灵敏度和特异性，适用于各种复杂环境中的微生 物鉴定。
04
菌种安全性
安全性评估
05
菌种传代与保藏的应用
在工业生产中的应用
生产食品和饮料
例如酸奶、面包、啤酒等，需要使用传代和保藏的菌种来发酵和 生产。
生产酶和生物催化剂
某些菌种可以产生特定的酶或生物催化剂，通过传代和保藏这些菌 种，可以持续生产所需的酶或生物催化剂。
生产抗生素和药物
某些菌种可以产生抗生素和其他药物，传代和保藏这些菌种对于药 物的持续生产和质量控制至关重要。
病原性评估
对菌种进行病原性评估，确保其不具有致病性 或致病性较低。
耐药性评估
对菌种进行耐药性评估，确保其不携带耐药基 因或耐药性较低。
毒力因子评估
对菌种进行毒力因子评估，确保其不具有强毒力或毒力因子较少。
安全措施
操作规范
消毒措施
制定严格的菌种操作规范，确保实验 人员遵循安全准则。
对实验区域和器具进行定期消毒，以 消除潜在的污染源。
空气
保持一定的空气流通，以防厌氧菌的 生长繁殖。
保藏期限
低温保藏
一般可保存数月至数年不等，具体时间取决于菌种的特性和保藏条件。
真空干燥保藏
一般可保存数年至数十年不等。
液体石蜡保藏
一般可保存数年至十余年不等。
甘油保藏
一般可保存数月至一年左右。
03
菌种鉴定
形态学鉴定
菌种传代与保藏
菌种传代与保藏
菌种保藏的原则
根据微生物生理、生化特点，人工创造条件，主要是
低温、干燥、缺氧三者，使微生物的代谢处于不活泼、 生长繁殖受抑制的休眠状态，以达到保持纯种优良性 状的目的。
菌种传代与保藏
长期保藏法： -80℃低温保藏法 真空冷冻干燥法 液氮超低温保藏法 沙土管保藏法
菌种传代与保藏
菌种传代与保藏
标准菌株主要来源 美国菌种保藏中心（ATCC） American Type Culture Collection Center 中国普通微生物菌株保藏中心（CGMCC） China General Microbiological Culture
Collection Center 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC） China Center for Industrial Culture Collection 中国医学微生物菌种保藏中心（CMCC） China Center for Medical Culture Collection
5.6.3.4 实验室应有程序和措施以保证标准菌种的安 全，防止污染、丢失或损坏，确保其完整性（具体措 施）。
谢谢！
菌种都应注明 ：名称、标准号、接种日期、传代数、 操作者； 菌种使用记录，流转记录。 销毁记录
菌种传代与保藏
菌种保藏管理要求相关标准： 《病原微生物实验室生物安全管理条例》 GB 19489—2008 实验室生物安全通用要求 GB/T 27405-2008 实验室质量控制规范 食品微生物检测 CNAS CL05 实验室生物安全认可准则 CNAS-CL09 实验室认可准则在微生物检测实验室的应用说
短期保藏法： 传代培养保藏法 液体石蜡保藏法
菌种传代与保藏作业指导书
1.标准菌的来源标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种( 0 代) (提供菌种证书)。
2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0 代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。
购买的已接种好的菌种斜面(3 代)应检查菌种管是否完好。
储存于 2~ 8 ℃，有效期为 3 个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1 物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及 75%酒精棉球3.2 培养基改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
3.3 操作步骤：a.打开洁净工作台。
b.在安瓿的外表面用 75%的酒精擦拭并让其自然风干。
c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开 (开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂)。
d. 以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5~0.8 ml 到安瓿中。
e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并彻底溶解。
f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。
g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度(细菌培养温度 30~35℃，培养 18~24 小时；真菌培养温度23~28℃，培养 3~5 天。
观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至 7 天，真菌应延长培养时间至 14 天，若仍未浑浊，灭菌处理。
h.取经复苏后的上述细菌菌液 8-10ml 至液体培养基中按 g 项操作对菌种进行复壮。
菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程
菌种管理制度1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。
3、定义➢标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
➢传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
➢工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
➢菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
4、职责4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。
4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。
5、规程5.1菌种的申购部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。
5.2菌种的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。
5.3菌种的保存5.3.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。
将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。
此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。
保存时间根据菌种种类而不同，细菌：每个月转种一次；酵母菌及芽胞：3~6个月转种一次；丝状真菌每年转种一次。
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菌种传代与保藏
-80℃低温保藏法 将微生物菌种保藏在-80℃冰箱的一种保藏方法。原 理是低温条件可减缓微生物的新陈代谢，以达到长期 有效地保藏微生物
菌种传代与保藏
菌种传代与保藏
-20℃有效期12个月，100-1000CFU 简单、便捷、定量、活性稳定 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 黑曲霉等12种 根据说明书使用
菌种传代与保藏
传代培养保藏法——包括斜面培养和半固体培养等。 操作方法： 即将菌种穿刺到斜面或半固体中，培养好后放在低温干
燥处保存（2-5℃冰箱），定期传种，一般1-2个月移 植一次(视菌种特征而定)。
菌种传代与保藏
标准菌种的申购记录（出库单或发票复印件）； 从标准菌株到工作菌株操作及记录 定期转种传代记录，时间，数量 纯度、特性等实验室所需关键指标的确认记录；每支
菌种都应注明 ：名称、标准号、接种日期、传代数、 操作者； 菌种使用记录，流转记录。 销毁记录
菌种传代与保藏
菌种保藏管理要求相关标准： 《病原微生物实验室生物安全管理条例》 GB 19489—2008 实验室生物安全通用要求 GB/T 27405-2008 实验室质量控制规范 食品微生物检测 CNAS CL05 实验室生物安全认可准则 CNAS-CL09 实验室认可准则在微生物检测实验室的应用说
菌种传代与保藏
9203要求 工作菌株的传代次数不得超过 5 代（从菌种保藏机构
获得的标准菌株为第 0 代），1 代是指将活的培养物 接种到微生物生长的新鲜培养基中培养
任何亚培养的形株的特性和纯度进行确认。
菌种传代与保藏
菌种传代与保藏
菌种传代与保藏
9203要求
标准菌株：来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准 菌株
标准储备菌株：从国内或国外菌种保藏机构获得的标准 菌株经过复活并在适宜的培养基中 生长后，即为标准 储备菌株。
工作菌株：由标准储备菌株, 转接一代获得的菌株。标 准储备菌株可用于制备每月或 每周 1 次转种的工作 菌株
菌液
斜面
平板
菌种传代与保藏
根据对氧气的需要情况分为： 需氧培养 微需氧微培养 厌氧培养
菌种传代与保藏
菌种保藏的原则
根据微生物生理、生化特点，人工创造条件，主要是
低温、干燥、缺氧三者，使微生物的代谢处于不活泼、 生长繁殖受抑制的休眠状态，以达到保持纯种优良性 状的目的。
菌种传代与保藏
长期保藏法： -80℃低温保藏法 真空冷冻干燥法 液氮超低温保藏法 沙土管保藏法
明
菌种传代与保藏
CNAS-CL09《检测和校准实验室能力认可准则在微生物 检测领域的应用说明》
菌种传代与保藏
5.6 测量溯源性 5.6.2.2.2 实验室必须保存有满足试验需要的标准菌
种（标准培养物）， 除检测方法（如药物敏感试验、抗菌性能测试）中规
定的菌株外 还应包括应用于培养基（试剂）验收/质量控制、方法
菌种传代与保藏
a．保存菌株应制备成储备菌株和工作菌株。标准储备 菌株应在规定的时间转种传代，并做确认试验，包括 存活性、纯度、实验室中所需要的关键特征指标，实 验室必须加以记录并予以保存。（根据具体的品种制 定确认项目）
b．每一支标准菌种都应以适当的标签、标记或其它标 识方式来表示其名称、菌种号、接种日期和所传代数。 （标签）
5.6.3.4 实验室应有程序和措施以保证标准菌种的安 全，防止污染、丢失或损坏，确保其完整性（具体措 施）。
谢谢！
菌种传代与保藏
菌种传代与保藏
标准菌株主要来源 美国菌种保藏中心（ATCC） American Type Culture Collection Center 中国普通微生物菌株保藏中心（CGMCC） China General Microbiological Culture
Collection Center 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC） China Center for Industrial Culture Collection 中国医学微生物菌种保藏中心（CMCC） China Center for Medical Culture Collection
c．记录中还应包括（但不限于）以下内容：
—— 从原始菌种传代到工作用菌种的代数； —— 菌种生长的培养基及孵育条件； —— 菌种生存条件。
菌种传代与保藏
5.6.3.3 所有的标准菌种从原始标准菌种到储备菌株 和工作菌株传代培养次数原则上不得超过 5 次，除 非标准方法中有明确要求，或实验室能够证明其相关 特性没有改变。（传代记录及其确证记录）
确认/证实、阳性对照、阴性对照、人员培训考核和质 量保证等所需的菌株。
菌种传代与保藏
1）标准菌种必须从认可的菌种或标本收集途径获得。 （获得证据）
2）实验室应有文件化的程序管理标准菌种（原始标 准菌种、标准储备菌株和工作菌株），涵盖菌种申购、 保管、领用、使用、传代、存储等诸方面，确保溯源 性和稳定性。该程序应包括：
菌种传代与保藏
9203要求 标准储备菌株保存时，可将培养物等份悬浮于培养基
中，并分装于小瓶中，
可采用低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻（低于30℃）等方法保存。
低于-70 ℃或低温冷冻干燥方法可以延长菌种保存时 间。
冷冻菌种一旦解冻转种制备工作菌株后，不得重新冷 冻和再次使用。