NADH对二乙基亚硝胺所致L02人肝细胞株p53基因突变和c-erbB2基因表达的影响

背景和目的:研究NADH对二乙基亚硝胺(DENA)诱导L02细胞p53和c-erbB2基因突变的影响。

材料和方法:通过PCR-SSCP和PCR-RFLP分析，研究NADH对DENA诱导的L02细胞p53基因突变的抗诱变作用。

通过Southern blotting检测NADH对c-erbB2基因扩增的影响。

结果:PCR-SSCP分析显示，NADH保护组DL02-和DL02- b细胞p53 exon7的突变率分别减少至33.3%(4/12)和50%(6/12)。

与DENA诱变组比较，差异有显著性(P＜0.01)。

PCR-RFLP分析显示，NADH降低了DENA诱导的L02细胞中p53第249密码子的突变频率。

Southern blotting显示，NADH下调了DENA诱导的L02细胞中c-erbB2基因的扩增。

结论:还原型辅酶NADH具有抗诱变作用，能降低DENA诱导的L02细胞中p53的突变，抑制c-erbB2的表达。

亚硝胺类化合物是一种公认的环境致突变剂和致癌物, 与原发性肝癌、食管癌等多种恶性肿瘤的发生有关。

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( nicotinamide adeninedinucleotide_reduced , NADH) 是呼吸链电子传递和能量代谢过程的重要辅酶, 参与细胞氧化还原反应和调节膜受体的表达。

近年来研究表明NADH 与细胞生长、增殖、分化和细胞凋亡有关, 能够抑制化疗药物顺铂、阿霉素和细胞毒药物鱼藤酮等的细胞毒作用, 防护和修复因化学、辐射及缺血缺氧造成的细胞损伤。

研究表明,NADH 具有一定的抗突变作用, 可以抑制某些诱变剂和致癌剂所致的突变, 保护遗传物质DNA 免受损伤, 但关于其抗突变作用的具体机制, 尚缺乏深入的研究。

本试验通过研究NADH 对环境致突变剂二乙基亚硝胺( diethylamine, DENA) 诱导L02 人肝细胞株p53 基因突变及对c_erbB2 表达的影响, 探讨NADH 抗突变作用可能的分子机制。

本研究结果显示, 在致突变剂致癌剂DENA 作用下, 正常人肝L02 细胞p53 第7 外显子发生了突变。

进一步使用RFLP 分析发现, 在DENA 诱变组DL02_ Ó和DL02_B 细胞检测到基因片段多态性改变, 说明p53 第7外显子第249~ 250 位密码子存在突变。

经DNA 片段测序亦证实了这一点。

本研究通过Southern blot 分析, 也检测到了c_erbB2 基因在DL02_ Ó细胞和DL02_B 细胞中的高表达, 提示p53 基因突变和c_erbB2 基因高表达可能在肝细胞癌变过程中发挥作用。

我们曾用Ames 试验来研究NADH 的抗突变作用: 通过受试物直接灭活致突变物试验发现, NADH 在添加哺乳动物微粒体酶( 大鼠S9) 情况下, 可以直接灭活致突变物。

可能是由于S9 的主要成分是细胞色素P450,而NADH 作为呼吸链中重要的辅酶, 在其和S9 的共同作用下, 将致突变物转变为对DNA 无损伤效应或损伤效应小的物质所致。

但NADH 中、高剂量组, 在加或不加S9 的情况下, 均能不同程度地抑制致突变物对菌株的致突变作用, 对移码型和碱基置换型突变均有抑制作用。

在本研究中, 各组L02 细胞株中, 均未加入活化体系, 缺乏代谢酶类, 但研究结果显示: NADH 可降低DENA 所诱发的L02 细胞p53 第7 外显子的基因突变率, 抑制DENA 所致的L02 细胞c_erbB2 基因的表达上调。

这与以往的研究结果一致。

表明NADH 可在一定程度上, 降低DENA 作用下相关癌基因的突变率, 具有一定的抗突变作用, 为其作为一种抗突变剂和肿瘤预防药物提供了理论基础。

但是, 关于NADH 对相关癌基因突变的抑制和调控机制, 尚有待进一步深入研究, 外源性添加NADH 后, 其在体内的代谢、利用和可能的抗突变作用, 也需进行动物体内实验来深入研究和探讨。

温居一, 张积仁, 李鹏, et al. NADH 对二乙基亚硝胺所致L02 人肝细胞株p53 基因突变和c- erbB2 基因表达的影响[J], 癌变、畸变、突变, 2009, 21(5): 329-333。