illumina Hiseq [Miseq] 测序原理

Hiseq/Miseq测序原理简介
主要内容
一．Solexa技术简介
二．测序原理
①Follow Cell
②可逆阻断技术
③边合成边测序
④桥式PCR
⑤碱基读取
三．工作流程
四．测序类型
五．仪器构造
六．测序结果展示
一．Solexa测序技术前世今生
—Illumina平台
•Solexa高通量测序技术是由英国剑桥大学派生的Solexa公司建立起来的。

该方法以单分子阵列技术为基础，是对合成测序技术的发展与延伸。

二．测序原理
Solexa是一种基于边合成边测序技术（Sequencing-By-Synthesis，SBS）的新型测序技术。

通过单分子阵列实现在小型芯片（Flow Cell）上进行桥式PCR反应。

通过可逆阻断技术实现每次只合成一个碱基，再利用相应的激光激发荧光集团，捕获激发光，从而读取碱基信息。

Flow Cell
70mm×25mm
可逆阻断技术
边合成边测序（SBS ）
➢加入测序引物➢Cycles1
a)合成第一个碱基
b)清除未反应的碱基和试剂c)
激发荧光信号并读取
d)去除荧光基团和阻断基团
➢Cycle2……Cycle n
A
T
G C C C
A T
T
G
G
G
G A
A T
A A T G T T C C G G G G A A A A T
T T T C C C 5’-3’-可逆阻断技术
桥式PCR
——簇生成之“起始延伸”
桥式PCR
——簇生成之“扩增”
桥式PCR
——簇生成之“测序”
碱基读取
三．工作流程
四．测序类型
a)单端测序（single-read sequencing，SR）
b)双端测序（Paired-end sequencing，PE）
c)混样测序（Index sequencing）
Follow Cell
接头差异
Single Read Paired End
Periodate Linearization 高碘酸盐切割位点
Uracil Specific Excision Reagent (USER)
尿嘧啶切割位点
Formamidopyrimidine Glycosylase (fpg)
糖基化酶切割位点
a)双端测序
➢Paired-End sequencing（PE/双端测序）−检测基因片段两端的基因信息。

b)单端测序
➢Single-read sequencing（SR，单端测序）−只检测基因片段一段的基因信息。

c)混样测序
➢Index Sequencing：将多种样本混合测序−充分利用solexa高通量测序特点。

A B C D E
A：Adepter
B：Fragment DNA
C：Index seq primer
D：Index
E：Adapter
五．仪器构造➢Miseq
➢Hiseq
•Read 1
•Read 2Fastq ：Fastq 是Solexa 测序技术中一种反映测序序列的碱基质量的文件格式。

第一行以“@”开头，由文件识别标志和读段名（ID ）组成；
第二行为碱基序列；第三行以“+”开头，也是由文件识别标志和读段名（ID ）组成，其ID 可以省略，但“+”不能省略；第四行是第二行中的序列内容每个碱基所对应的测序质量值。

ASCII TABLE
六．测序结果展示
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