一种从土壤样品中高效筛选大丽轮枝菌拮抗细菌的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611010097.X
(22)申请日 2016.11.14
(71)申请人 江苏省农业科学院
地址 210014 江苏省南京市玄武区孝陵卫
钟灵街50号
(72)发明人 王卿　邓晟　林玲　
(51)Int.Cl.
C12Q 1/18(2006.01)
C12R 1/645(2006.01)
(54)发明名称一种从土壤样品中高效筛选大丽轮枝菌拮抗细菌的方法(57)摘要本发明涉及一种高效、快速筛选大丽轮枝菌拮抗细菌的方法。

首先将样品不同梯度的土壤悬浮液涂布在平板上，待细菌长出后直接在平板上喷雾接种大丽轮枝菌孢子液，继续培养，当大丽轮枝菌菌丝长满平板时，观察细菌周围是否产生抑菌圈，如果有抑菌圈产生，说明抑菌圈内的细菌为拮抗细菌。

将拮抗细菌挑出进行划线纯化，再对拮抗菌进行平板对峙实验，进一步验证拮抗菌的作用。

本发明不需要将涂布后平板中长出的所有细菌逐一挑出，较传统方法大大减少了工作量，提高了筛选效率，对促进拮抗菌的筛选，加快生防菌的开发利用，
具有重要的实际应用价值。

权利要求书1页 说明书3页 附图1页CN 106755277 A 2017.05.31
C N 106755277
A
1.一种从土壤样品中高效、快速筛选拮抗细菌的方法，其特征在于按照以下几个步骤进行：
a.称取10g待分离拮抗细菌的土壤样品加入100mL含玻璃珠的无菌水中，静置20min，在200r/min摇床中振荡30min，即为土壤悬液，用无菌移液枪吸取5mL土壤悬液加入45mL无菌水中，按1∶10进行系列稀释，得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5的稀释液，取适宜的稀释度，用无菌移液枪吸取100μL不同稀释梯度的稀释液均匀涂布于直径为15cm的LB培养基平板上，每梯度重复涂布3个平板，平板置于30℃培养箱中培养2d；
b.将大丽轮枝菌接种在PDA培养基中活化，取菌落边缘处菌块接种于PDB液体培养基中，25℃，200r/min振荡培养7d，无菌纱布过滤除去菌丝后，用血球计数板对大丽轮枝菌孢子计数，并将孢子液浓度稀释为1×107CFU/mL；
c.将喷雾器放入70℃烘箱加热1h灭菌，将大丽轮枝菌孢子液加入灭菌的喷雾器中，在长有细菌的平板上喷1.5mL大丽轮枝菌孢子液，待平板中喷雾的孢子液在超净工作台中晾干后，将平板用封口膜封好后置于28℃培养箱中培养2-3d；
d.喷雾接种2-3d后，平板中长满大丽轮枝菌菌丝，如果平板中的细菌周围出现明显的抑菌圈，说明该抑菌圈内的细菌对大丽轮枝菌有一定的拮抗能力，为拮抗菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将所有抑菌圈内的拮抗菌挑出，在另一LB 平板中划线，纯化，用平板拮抗实验进一步验证拮抗菌的拮抗作用，将确定为拮抗菌的菌株接种于LB液体培养基，30℃，200r/min摇床培养24h，吸取菌液加入同体积30％的甘油，混匀后于-70℃保存。

权　利　要　求　书1/1页CN 106755277 A
一种从土壤样品中高效筛选大丽轮枝菌拮抗细菌的方法
技术领域
[0001]本发明涉及大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)拮抗菌高效的筛选方法，属于生物防治研究领域。

背景技术
[0002]大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)是一类分布广泛、破坏力极强的植物土传病病原真菌，可引起世界范围内寄主植物产生黄萎病害。

该病菌不仅地区分布广，而且寄主范围也十分广泛，可以侵染400多种植物，包括一年生及多年生农作物、蔬菜、花卉、果蔬、木本观赏植物和纤维油料作物，且该病菌的寄主范围仍在继续扩大。

大丽轮枝菌可以在棉花、马铃薯、生菜和橄榄等许多作物上造成50％或者更加惨重的经济损失；在未经土壤熏蒸处理的草莓田中可造成的经济损失高达75％；与根结线虫共存时可导致的损失更大。

[0003]黄萎病是土壤传播的维管束病害，该病的病原菌大丽轮枝菌以微菌核的休眠结构在土壤中存活可达十几年之久，防治难度较大，目前尚无特效的防治药剂。

选育抗病品种是防治黄萎病最经济有效的措施，但抗病育种的抗源材料短缺、抗病水平不高，且黄萎病抗性稳定性遗传研究至今尚无确切结论，单纯依靠选育抗病品种对黄萎病的防治具有一定的局限性；在过去的50多年中，用溴甲烷进行土壤熏蒸成为防治黄萎病不可或缺的手段，然而化学防治对生态环境及人类健康带来较大威胁，2005年1月溴甲烷在发达国家已全面禁止使用，发展中国家也于2015年全面淘汰溴甲烷。

[0004]生物防治是一种有潜力的防治方法，以其高效、绿色环保见长，尤其是在防治黄萎病这类土传病害方面具有重要意义。

至今已有多种生防菌被用于黄萎病防治方面的研究。

拮抗菌包括细菌如芽孢杆菌、荧光假单孢杆菌，真菌如木霉、淡紫拟青霉菌以及菌根真菌。

生物防治的前提，是筛选出高效的拮抗菌。

然而传统的拮抗细菌筛选过程较为繁杂，将采集的样品进行梯度稀释后涂布培养，然后需要将平板长出的所有细菌一一挑出划线纯化，然后再将所有的菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上采样平板对峙法逐一进行拮抗实验。

平板涂布培养时长出的成百上千个细菌，大部分细菌是没有拮抗作用的，这样没有针对性的逐一筛选，造成许多重复和繁杂的工作，工作量大，效率低。

发明内容
[0005]本发明的目的在于针对传统拮抗菌筛选工作量大、效率低的的实际问题，建立了一种从土壤样品中高效、快速的拮抗细菌筛选方法。

[0006]本发明的目的是这样实现的：
[0007] 1.拮抗细菌的筛选：
[0008] a.称取10g待分离拮抗细菌的土壤样品加入100mL含玻璃珠的无菌水中，静置20min，在200r/min摇床中振荡30min，即为土壤悬液。

用无菌移液枪吸取5mL土壤悬液加入45mL无菌水中，按1∶10进行系列稀释，得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5的稀释液，取适宜的稀释度，用无菌移液枪吸取100μL不同稀释梯度的稀释液均匀涂布于直径为15cm的LB培养基
平板上，每梯度重复涂布3个平板，平板置于30℃培养箱中培养2d。

[0009] b.将大丽轮枝菌接种在PDA培养基中活化，取菌落边缘处菌块接种于PDB液体培养基中，25℃，200r/min振荡培养7d。

无菌纱布过滤除去菌丝后，用血球计数板对大丽轮枝菌孢子计数，并将孢子液浓度稀释为1×107CFU/mL。

[0010] c.将喷雾器放入70℃烘箱加热1h灭菌，将大丽轮枝菌孢子液加入灭菌的喷雾器中，在长有细菌的平板上喷1.5mL大丽轮枝菌孢子液，待平板中喷雾的孢子液在超净工作台中晾干后，将平板用封口膜封好后置于28℃培养箱中培养2-3d。

[0011] d.喷雾接种2-3d后，平板中长满大丽轮枝菌菌丝，如果平板中的细菌周围出现明显的抑菌圈，说明该抑菌圈内的细菌对大丽轮枝菌有一定的拮抗能力，为拮抗菌。

[0012] 2.拮抗细菌分离纯化：将所有抑菌圈内的拮抗菌挑出，在另一LB平板中划线，纯化，平板置于30℃培养箱中培养1d，使平板上长出单菌落，观察每个平板上单菌落的形态、大小颜色等性状，如果有性状不一致的菌落，则需要再次重复划线纯化过程，直到每个平板中的菌落性状一致。

[0013] 3.拮抗细菌验证：用直径为7mm的打孔器在大丽轮枝菌菌落边缘打孔，将菌饼倒置接种至PDA平板中间，在距中心2.5cm的圆周上均匀取四个点，点接四个纯化好的拮抗菌。

接种好后，用封口膜包好，置于28℃培养箱中培养7d，观察抑菌圈的有无及大小，进一步确定该菌的拮抗作用。

[0014] 4.拮抗菌的保存：将确定为拮抗菌的菌株接种于LB液体培养基，30℃，200r/min摇床培养24h，吸取菌液加入同体积30％的甘油，混匀后于-70℃保存。

[0015]本发明的优点在于：从样品中用稀释涂布法分离出来的细菌量非常大，传统的方法需将所有的细菌逐一挑出进行拮抗实验，十分繁琐。

对筛选方法改善后，将样品稀释液涂布在直径15cm的大平板上，待细菌菌落长出后，直接在同一平板上喷雾接种大丽轮枝菌，待大丽轮枝菌长满平板时，只需将抑菌圈内的细菌挑出，进行划线纯化，再进行平板拮抗实验，筛选拮抗菌。

与传统的筛选方法比较，该发明大大缩小了筛选对象的范围，极大的减少了工作量，节约了人力、物力及财力，对促进拮抗菌的筛选，加快生防菌的开发利用，具有重要的实际应用价值。

附图说明
[0016]图1是大丽轮枝菌拮抗细菌在LB平板上的初筛照片
具体实施方式
[0017]下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

[0018]实施例1 培养基配制
[0019]配方一、普通细菌LB培养基
[0020]蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L，NaCl 2.0g/L，琼脂15～20g/L，pH 7.0-7.5。

[0021]配方二、普通真菌PDA培养基
[0022]马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15～20g/L。

[0023]实施例2 土壤样品中拮抗细菌筛选
[0024] a.采集江苏省南京市田间病土，称取10g土样加入100mL含玻璃珠的无菌水中，静
置20min，在200r/min摇床中振荡30min，即为土壤悬液。

用无菌移液枪吸取5mL土壤悬液加入45mL无菌水中，按1∶10进行系列稀释，得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5的稀释液，取适宜的稀释度，用无菌移液枪吸取10-4、10-5两个稀释梯度的稀释液各100μL，均匀涂布于直径为15cm的LB培养基平板上，每梯度重复涂布3个平板，平板置于30℃培养箱中培养2d。

[0025] b.将大丽轮枝菌V茄nj接种在PDA培养基中活化，取菌落边缘处菌块接种于PDB液体培养基中，25℃，200r/min振荡培养7d。

无菌纱布过滤除去菌丝后，用血球计数板对V茄nj孢子计数，并将孢子液浓度稀释为1×107CFU/mL。

[0026] c.将V茄nj孢子液加入灭菌的喷雾器中，在长有细菌的平板上喷1.5mL大丽轮枝菌孢子液，待平板中喷雾的孢子液在超净工作台中晾干后，将平板用封口膜封好后置于28℃培养箱中培养2-3d。

[0027]实施例3 拮抗细菌的纯化
[0028]喷雾接种2-3d后，平板中长满V茄nj菌丝，平板中出现明显的抑菌圈(见图1)，将所有抑菌圈内的30株拮抗菌挑出，在另一LB平板中划线，纯化，平板置于30℃培养箱中培养1d，使平板上长出单菌落，观察每个平板上单菌落的形态、大小颜色等性状，如果有性状不一致的菌落，则需要再次重复划线纯化过程，直到每个平板中的菌落性状一致。

[0029]实施例4 拮抗细菌的验证
[0030]用直径为7mm的打孔器在V茄nj菌落边缘打孔，将菌饼倒置接种至PDA平板中间，在距中心2.5cm的圆周上均匀取四个点，点接四次纯化好的拮抗细菌。

接种好后，用封口膜包好，置于28℃培养箱中培养7d，进一步确定挑出的30株菌是否为拮抗菌，结果表明30株细菌均有拮抗作用，筛选效率为100％，其中1株细菌的抑菌圈达到8.0mm，拮抗效果最好。

[0031]实施例5 拮抗细菌的保存
[0032]通过复筛确定对V茄nj有拮抗作用的细菌，将拮抗细菌的菌株接种于LB液体培养基，30℃，200r/min摇床培养24h，吸取700μL菌液加入同体积30％的甘油，混匀后于-70℃保存，备用。

图1。