培养制备外周血淋巴细胞染色体标本并使用G带技术及姐妹染色单体色差分析其遗传物质稳定性状况

培养制备王居锋同学外周血淋巴细胞染色体标本并使用G带技术及姐妹染色单体色差分析其遗传物质稳定性状况
唐浩能
（中山大学生命科学学院2013级生物技术广州 510006）
摘要：目的：对王居锋同学染色体进行G带分析和姐妹染色单体色差分析，评价其遗传物质稳定性情况。

方法：培养制备王染色体标本，经G带技术显示获得分带类型。

同时另一部分标本按姐妹染色单体互换检测方法进行培养检测，计数SCE发生率。

结果：G带显示王染色体明暗相间，每条染色体都有独特的带纹特征。

姐妹染色单体色差分析显示王SCE 互换率为3.1，而健康人群SCE互换率为3．84±O．37。

结论：王居锋同学G带核型正常，染色体结构稳定。

关键词：G带；姐妹染色单体色差；BrdU；Giemsa
引言
染色体是细胞分裂过程中出现的一种可见结构，是基因的载体，在人类染色体研究中，外周血是制备染色体标本的重要材料之一，如果染色体发生数目异常或结构畸变，都将导致多种基因的增加或缺失，产生临床效应。

人体的一毫升外周血中含有数百万个小淋巴细胞，他们几乎都处于G0期或G1期，一般情况下是不分裂的，用人工离体培养的方法，在培养基中加入植物血球凝集素，能刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂，经过短期的培养秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量中期有丝分裂细胞，最后经空气干燥法制片，便可得到质量较好的染色体标本。

G带染色技术是目前应用最广泛的染色体分带技术之一。

染色首先取决于两个噻嗪分子同DNA的结合，在此基础上他们结合一个曙红分子，其次取决于一个有助于染料沉淀物积累的疏水环境，通过胰酶预处理可以使阴性G带区的疏水蛋白被除去或使它们的构型变得更为疏水，从而造成了染色体蛋白的差异，这种差异就是明暗相间的染色体G带。

在DNA复制过程中，核苷类似物5-溴脱氧尿嘧啶核苷可以代替胸腺嘧啶核苷渗入到新复制的DNA链中，由于双股都含BrdU的DNA分子构型有变化，使这条染色单体对某些染色体的亲和力降低，用Giemsa染液染色时就可以清楚看到双股都含BrdU的DNA链所组成的单体染色浅，而仅一条链BrdU的单体染色深，这样就可以区分中期染色体的姐妹染色单体，由于姐妹染色单体染色上的明显差异，如果姐妹染色单体间在某些部位发生互换，则在互换处可见有一界限明显、颜色深浅对称的互换片段。

1材料与方法[1,2,3]
1.1 材料：
王居锋同学外周血。

1.2 方法步骤：
1.培养基的制备
RPMI-1640粉末先用约800毫升三蒸水溶解，再加入其他成分混匀，定容至1000毫升，用5%碳酸氢钠调pH至7.2，然后用过滤方式灭菌，最后分装到预先高压消毒好的培养瓶中，每小瓶装五毫升，塞进瓶塞，胶布封口备用，如不立即使用，可置0℃保藏，用前37℃恒温水浴锅中温浴10分钟。

2.采血
用两毫升灭菌注射器吸取肝素湿润管壁，然后用碘酒和乙醇消毒皮肤，从静脉采血1-2毫升，在酒精灯火焰旁，自橡皮塞向培养瓶内接种全血0.3毫升左右，轻轻摇匀。

3.培养
置37℃培养箱中培养66-72小时，终止培养前2-4小时用注射器向培养物中加入秋水仙素，最终浓度为0.4-0.8微克每毫升。

4.收集细胞
将培养72小时并经秋水仙素处理的培养瓶从温箱中取出，用吸管将贴在瓶壁上的细胞冲散均匀，并移到刻度离心管中.
5.1000转每分钟离心8分钟，用吸管吸取上清液。

6.低渗
向离心管中加入六毫升蒸馏水或0.075摩尔每升氯化钾，用吸管吹打均匀至37℃温箱内低渗20分钟，使红细胞破裂，白细胞膨胀。

7.低渗后沿管壁慢慢加入一毫升新配的固定液吹打均匀，立即以1000转每分钟离心8分
钟，吸弃上清液。

8.固定，沿管壁慢慢加入六毫升固定液，用吸管吹打均匀固定15分钟，以1000转每分钟
离心8分钟，弃上清液。

9.重复步骤八的工作一次
10.制片
加入固定液0.5毫升吹打成细胞悬液，用滴管吸取细胞悬液滴在预先经4℃冰冻的，干净玻片上，每片滴1-2滴，用嘴轻轻吹散，在酒精灯火焰上微微烤干。

11.1染色体G带显带
1)将空气干燥1-2周的染色体制片至60℃烘箱中，两小时后降至室温。

2)置于热37℃的0.25%胰蛋白酶溶液中0.5-1.5分钟，立即放入GKN溶液中漂洗15秒，
pH6.8磷酸缓冲液与Giemsa原液按20:1混合染色10到20分钟，用自来水轻微冲洗后空气干燥，镜检和显微拍照。

11. 2人外周血细胞姐妹染色单体区分染色——BrdU-Giemsa法
1)在人体外周血淋巴细胞培养24小时后加入BrdU，最终浓度为十微克每毫升，培养瓶用
黑纸包装。

2)终止培养前4到6小时加入秋水仙素溶液0.05-0.1毫升，最终浓度0.4-0.8微克每毫升，
按常规空气干燥法制片，37℃温箱中存放备用。

染色体标本37℃条件下，搁置24小时后取出。

3)在水浴锅中放一饭盒，盒中置玻片架，加入2×SSC，液面接近玻片架面，调温至45-48
摄氏度。

4)将制片平放在玻片架上，并向玻片表面滴加2×SSC溶液，使之覆盖一薄层。

5)在水浴锅中放一带罩的15W紫外灯，与标本垂直距离5-8厘米，照射20到30分钟。

6)用蒸馏水冲去2×SSC。

7)1:10Giemsa染色5到10分钟。

8)水洗，晾干后镜检。

9)SCE计数，选择染色体分散良好，数目为2n=46的人的10个中期分裂相细胞进行观察
计数，最后求得一个平均数。

2结果与分析
2.1最佳染色体形状的预处理方法
4组不同的胰蛋白酶溶液作用时间的染色体标本制备结果比较，发现作用时间为60s 的那组染色体标本获得的淋巴细胞中期分裂相中染色体相对狭长，中小型染色体长短臂轮廓清晰，着丝点位置易辨，G带显带分明。

2.2G带显带[4]
观察到G带显带图像如图1，可知有5条染色体显示出8~9条明暗相间的带纹，其中长臂亮带约2条，短臂1条; 8条染色体显示出4~6条明暗相间的带纹，长臂亮带为2条，短臂不显示亮带。

其余染色体较小，呈现带纹不清晰。

图1染色体G带图
2.3姐妹染色单体色差分析
观察到姐妹染色单体色差分析如图2，观察可知，有4条染色体发生了一次姐妹染色单体互换，其中有两条染色体较短有两条较长。

有一条染色体发生了两次姐妹染色单体互换。

SCE出现的位置是随机的，并没有见到有明显的“热点”。

图2姐妹染色单体色差图
2.4SCE计数统计
选择染色体分散良好，数目为2n=46的10个中期分裂相细胞进行观察计数，最后求得一个平均数。

表1BrdU-Giemsa法染色结果
之间的互换，其形成主要与DNA的稳定性有关，相对于染色体畸变实验，ScE已普遍被认为是研究染色体损伤的可靠、灵敏的指标，现广泛应用于作快速检测环境中诱变、致癌等有害物质。

目前认为健康人也存在一定的SCE频率，且在一定的实验条件下，该值相对恒定，即自发SCE互换率AM，但目前各实验室研究报道结果不一，甚至差异悬殊，如贵阳张爱华等人报道的为3．84±O．37，西安赵海波等人报道为8．39±1．44[5,6]。

造成上述结果的原因除实验方法及涉及的试剂差异外，最有可能与长期周围生活环境微量的不良因素有一定关系。

最后统计得出王居锋同学平均每个细胞的SCE率为3.1，参考现有报道健康人群的SCE 互换率最低值3．84±O．37，王居锋同学的SCE互换率明显低于该值，可推测其外周血淋巴细胞的染色体结构稳定。

参考文献
[1]王金发,戚康标,何炎明.《遗传学实验教程》.第一版, 北京：高等教育出版社,2008.
P42-P46.
[2]王金发,何炎明.细胞生物学实验教程.第二版.北京：科学出版社. 2011. P48-P50.
[3]贺竹梅.《现代遗传学教程》.第二版. 北京：高等教育出版社,2011. P74-P83.
[4]张静南,刘永斌,张金吨,苏杰,李云霞,孙伟,赵丽霞,郭继彤,李喜和.阿拉伯马染色体G带核
型分析[J].华北农学报,2011,第2期p101-106
[5]张爱华，蒋宪瑶，龙曼海，等．255例健康人外周血淋巴细胞微核和姊妹染色单体交换
的检测[J]．贵阳医药，1995，19(5)：267—268．
[6]赵海波，华钰，张宛明，等．西安地区正常女性5l例自发姊妹染色单体互换率观察[J]．第
四军医大学学报，1992，13(3)：208—209．
After Cultivating and preparing chromosomes of Wang Jufeng’s Peripheral Blood lymphocyte，Analyze the stability of his genetic material with G-banding technique and SCD
Tang Haoneng
(Biotechnology, School of Life Science, Sun Yat-Sen University, Guangzhou, 510006) Abstract:Objective: Analyze the stability of Wang Jufeng’s Peripheral Blood lymphocyte chromosomes with G-banding technique and SCD.Methods: After Cultivating and preparing chromosomes of Wang Jufeng, we acquire his band type with G-banding technique. Simultaneously we treat the rest sample with SCD method and count the rate of SCE. Result: According to G-banding, we can observe that chromosomes of Wang Jufeng have light bands interspaced with dark bands, and every chromosome has its distinct characteristic. According to SCD, the rate of SCE is 3.1, while the normal one is 3．84±O．37.Conclusion: Wang Jufeng has a ordinary karyotype and stable chromosome structure.
Key words: G-banding; SCD; BrdU; Giemsa。