小檗碱对5种临床常见念珠菌体外抑菌作用分析

小檗碱对5种临床常见念珠菌体外抑菌作用分析
姚冬婷;胡骏;张雪清;张俊;胡晓波
【摘要】目的检测小檗碱对5种临床常见念珠菌的抑菌效果.方法收集分离自临
床样本的56株念株菌(白念珠菌23株、光滑念珠菌20株、热带念珠菌6株、克
柔念珠菌4株、近平滑念珠菌3株),采用微量肉汤稀释法对其进行体外药物敏感性试验.结果小檗碱对白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌及近平滑念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)50分别为32、16、8、4和16μg/mL,对白念珠菌的抑菌效果与其他4种念珠菌比较差异均有统计学意义(P<0.05),小檗碱对光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌的抑菌效果比较差异无统计学意义(P>0.05),小檗碱对敏
感及非敏感光滑念珠菌的抑菌效果差异亦无统计学意义(P=0.063).结论小檗碱对
临床常见的5种念珠菌(包括非敏感光滑念珠菌)均有较好的抑菌效果,对非白念珠菌的抑菌效果优于白念珠菌.
【期刊名称】《检验医学》
【年(卷),期】2019(034)007
【总页数】4页(P587-590)
【关键词】念珠菌;小檗碱;抑菌作用;最小抑菌浓度
【作者】姚冬婷;胡骏;张雪清;张俊;胡晓波
【作者单位】上海中医药大学附属龙华医院,上海 200032;上海中医药大学附属龙
华医院,上海 200032;上海中医药大学附属龙华医院,上海 200032;上海中医药大学附属龙华医院,上海 200032;上海中医药大学附属龙华医院,上海 200032
【正文语种】中文
【中图分类】R379.4
近20年来，念珠菌感染率呈逐年上升的趋势，已成为医院获得性血流感染的第4位主要致病菌，临床病死率高达35%～40%[1]。

念珠菌感染往往与人类免疫缺陷病毒感染、器官和骨髓移植、广谱抗菌药物滥用、激素应用以及静脉插管、血液透析等介入性操作的增加有关[1]。

目前，临床感染率居前5位的念珠菌为：白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌[2]。

临床用于治疗念珠菌感染的抗真菌药物包括两性霉素B、5-氟胞嘧啶、唑类药物和棘白菌素等，其中唑类药物，尤其是氟康唑，是临床最常用的抗真菌药，然而长期反复的使用已导致菌株对其产生耐药性[3]。

传统中药在感染性疾病的预防和控制方面发挥了积极作用。

黄连、黄檗等常见中草药具有清热燥湿、泻火解毒、清虚热等功能，临床上常作为清热剂及湿熏洗剂的中药成分之一，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等均具有一定的抑菌作用[4-6]。

有研究发现，黄连、黄檗等中草药的有效抑菌成分是小檗碱。

小檗碱又名黄连素，是一种异喹啉类季铵型生物碱，在我国已经有很长时间的临床应用史，主要作为传统抗菌药物治疗细菌性腹泻，其疗效和安全性均得到普遍认可[7-8]。

本研究通过分析小檗碱对5种临床常见念珠菌的抑菌效果，为中草药用于临床念珠菌感染治疗提供实验室依据。

1 材料和方法
1.1 菌株来源
收集2017年1—12月分离自龙华医院56例患者临床样本的56株念珠菌（剔除重复菌株），其中白念株菌23株、光滑念珠菌20株、热带念珠菌6株、克柔念
珠菌4株、近平滑念珠菌3株。

所有菌株均经全自动微生物分析仪鉴定到种。

质
控菌株近平滑念珠菌（ATCC 22019）和克柔念珠菌（ATCC 6258）购自美国菌
种保藏中心。

1.2 仪器和试剂
VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪（法国生物梅里埃公司）及酵母菌ATB FUNGUS 3种药物敏感性试验板条，小檗碱（上海友思生物科技有限公司），RPMI 1640液体培养基（美国Invitrogen公司），沙保弱平板（上海博赛生物技术有限公司），96孔板（浙江拱东公司）。

1.3 体外药物敏感性试验
按ATB FUNGUS 3 药物敏感性试验板条说明书操作。

将菌液用0.85%无菌氯化钠溶液配成2.0麦氏单位浓度，取20 μL菌悬液加入ATB F Mediμm管中混匀，每孔加135 μL，35 ℃孵育24 h后观察结果，如果生长对照孔生长不佳，可延长至48 h观察结果。

以最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值位于美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M27-A2文件[9]规定的范围为试验有效。

判读标准见表1。

1.4 体外抑菌试验
采用微量肉汤稀释法进行小檗碱对念珠菌的体外抑菌试验。

按照M27-A2文件[9]推荐的酵母菌微量肉汤稀释法进行体外抗真菌抑菌试验。

表1 酵母菌体外药物敏感性试验结果判定标准（μg/mL）注：两性霉素B以
MIC≥2 μg/mL判断为低耐药；ND为CLSI文件未作定义药物名称敏感中介耐
药5-氟胞嘧啶≤4 8～16 ≥32两性霉素B ND ND ND氟康唑≤8 16～32 ≥64伊曲康唑≤0.125 0.25～0.5 ≥1伏立康唑≤1 2 ≥4
1.4.1 念珠菌悬液制备将单个菌落在沙保弱平板上连续转种2次，37 ℃孵育24 h，以保证其纯度和活力，挑取纯菌落用0.85%无菌氯化钠溶液制备菌悬液，调整菌
悬液浓度至0.5麦氏单位，此时细菌浓度为5×106 CFU/mL，用RPMI 1640液
体培养基将菌悬液浓度稀释至（1～5）×103 CFU/mL，2倍终浓度。

1.4.2 小檗碱药物贮存液配置取20 mg小檗碱加入1 mL二甲基亚砜，加热至完
全溶解，得到2×104 μg/mL的贮存液，4 ℃保存备用。

1.4.3 微量肉汤稀释法体外抑菌试验 96孔微量板每孔中加入RPMI 1640液体培养基100 μL，小檗碱药物贮存液用RPMI 1640液体培养基稀释，使其浓度为测定
时所需最高浓度的4倍，加入微量板后作倍比稀释，使小檗碱的浓度范围为2×（0.125～64）μg/mL，加入制备好的菌悬液100 μL，以第11孔作为生长对照，以12孔作为空白对照。

置于35 ℃孵育24～48 h观察结果。

1.4.4 体外抑菌试验结果判定读取肉眼观测到的MIC，读取结果时将每个受试孔
中念珠菌的生长情况与生长对照孔进行比较，以肉眼未见念珠菌生长的孔位作为MIC判断终点。

重复3次测试，取MIC平均数作为该菌的MIC值。

1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行统计分析。

抑制效果的比较采用秩和检验，以P＜0.05
为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 56株念珠菌对临床常用抗真菌药物的敏感性
23株白念珠菌中，对5-氟胞嘧啶耐药1株，对氟康唑耐药1株，对伊曲康唑耐药5株、中介4株，对伏立康唑耐药4株；20株光滑念珠菌中，对氟康唑耐药9株、中介1株，对伊曲康唑、伏立康唑耐药各10株；6株热带念珠菌中，对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑耐药各2株；4株克柔念珠菌中，对5-氟胞嘧啶中介2株，
对氟康唑和伊曲康唑耐药各2株、中介各1株，对伏立康唑中介1株；3株近平
滑念珠菌对5种抗真菌药物均敏感。

见表2。

表2 56株念珠菌对临床常用抗真菌药物的敏感性 [株（%）]菌株名称 5-氟胞嘧
啶两性霉素B 氟康唑伊曲康唑伏立康唑白念珠菌 22（95.7） 23（100） 22（95.7） 14（60.9） 19（82.6）光滑念珠菌 20（100） 20（100） 10（50）
10（50） 10（50）热带念珠菌 6（100） 6（100） 4（67） 4（67） 4（67）
克柔念珠菌 2（50） 4（100） 1（25） 1（25） 3（75）近平滑念珠菌 3（100）3（100） 3（100） 3（100） 3（100）
2.2 小檗碱对临床常见念珠菌的抑菌效果
23株白念珠菌中，17株（73.9%）小檗碱MIC=32 μg/mL，MIC50=32 μg/mL；20株光滑念珠菌中，9株（45%）小檗碱MIC=16 μg/mL，MIC50=16 μg/mL；6株热带念珠菌中，4株（67%）小檗碱MIC=8 μg/mL，MIC50=8 μg/mL；4
株克柔念珠菌中，2株（50%）小檗碱MIC=4 μg/mL，MIC50=4 μg/mL；3株近平滑念珠菌中，2株（66.7%）小檗碱MIC=16 μg/mL，MIC50=16 μg/mL。

小檗碱对白念珠菌的抑菌效果与其他4种念珠菌比较差异均有统计学意义（P＜
0.05），而其他4种念珠菌之间小檗碱的抑菌效果差异均无统计学意义（P＞
0.05）。

见表3。

表3 小檗碱对56株念珠菌的抑菌效果（株）小檗碱浓度（μg/mL）白念珠菌光
滑念珠菌热带念珠菌克柔念珠菌近平滑念珠菌64 5 2 0 0 0 32 17 3 0 1 0 16 1 9 2 1 2 8 0 6 4 0 1 4 0 0 0 2 0
2.3 小檗碱对光滑念珠菌敏感株和非敏感株的抑菌效果
20株光滑念珠菌按其对唑类药物的敏感性分为2组，敏感组（10株）对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑均表现为敏感，非敏感组（10株）9株对氟康唑、伊曲康唑
和伏立康唑耐药，1株对氟康唑中介、对伊曲康唑和伏立康唑耐药。

小檗碱对2组光滑念珠菌的抑菌效果差异无统计学意义（P=0.063）。

3 讨论
目前，临床主要应用两性霉素B、5-氟胞嘧啶、唑类药物治疗念珠菌感染。

两性霉
素B长时间以来被认为是系统性念珠菌感染最有效的抗真菌药物，但副作用较大；5-氟胞嘧啶尽管通常也对治疗念珠菌有效，但因其会频繁地引发血液学疾病和较
早地发生耐药，应用也受到限制；氟康唑等唑类药物相对安全，服药方便，是应用最广泛的抗真菌药，然而由于唑类药物仅具有抑菌作用，长期、反复使用会导致耐药菌的产生。

本研究收集了临床分离的5种常见念珠菌，除了近平滑念珠菌，其
他4种念珠菌对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑均有不同程度的耐药，且存在交叉
耐药的现象。

传统中药数千年来在人类疾病治疗中发挥了巨大的作用。

由于中药的特殊性，细菌较少对其产生耐药，而且中药来源广泛，价格低廉，因此研究和开发抗菌中药对解决耐药菌株的产生和抗菌药物选择具有重要意义。

小檗碱在我国用于治疗细菌性痢疾已有数千年历史，对白念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等具有一定的抑菌效果[10-14]。

QUAN等[15]采用微量肉汤稀释法检测了小檗碱对临床耐药的白念珠菌的抑菌效果，发现40株菌的MIC值均＞32 μg/mL，平均MIC值为64
μg/mL。

WEI等[16]发现念珠菌属对小檗碱的敏感性依次为克柔念珠菌＞光滑念
珠菌＞热带念珠菌＞近平滑念珠菌和白念珠菌（各1株），MIC为1.95～31.25
μg/mL。

有研究发现小檗碱对2株耐药热带念珠菌、2株耐药近平滑念珠菌和3
株耐药白念珠菌的MIC均为8 μg/mL[17]。

本研究检测了小檗碱对5种临床常见念珠菌的抑菌效果，发现小檗碱对光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌的MIC50分别为16、8、4和16 μg/mL，对白念珠菌的MIC50为32
μg/mL，光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念菌珠之间抑菌效果无
差异，而白念珠菌的抑菌效果与其他4种念珠菌比较均有显著性差异（P＜0.05）。

由此可见，小檗碱对临床常见念珠菌具有良好的抑菌效果，且对非白念珠菌的抑菌效果优于白念珠菌。

本研究还比较了小檗碱对光滑念珠菌敏感株和非敏感株的抑菌效果，结果显示二者差异无统计学意义（P=0.063），这表明小檗碱在治疗临床耐
药念珠菌感染方面具有一定的优势。

沈雪敏等[18]采用流式细胞仪测定小檗碱对白念珠菌细胞周期的影响，发现小檗碱作用12 h后，随着药物浓度的升高，白念珠菌（ATCC 76615）增殖指数均显著
降低，提示小檗碱对白念珠菌的细胞生长周期具有抑制作用。

XU等[19]发现小檗
碱可能通过转变线粒体有氧呼吸和增加内源性活性氧来抑制耐药白色念珠菌的生长。

综上所述，小檗碱对临床常见念珠菌均有良好的抑菌效果，对非白念珠菌的抑菌效果优于白念珠菌，而且小檗碱对光滑念珠菌敏感株与非敏感株的抑菌效果相似，这为临床治疗念珠菌感染，尤其是耐药念珠菌感染提供了重要的依据。

由于本研究收集的菌株数有限，有待扩大样本量进一步研究，以便为临床提供更有效的实验室依据。

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