醒脑静注射液对内毒素诱导脓毒症大鼠脑线粒体氧化应激的影响

醒脑静注射液对内毒素诱导脓毒症大鼠脑线粒体氧化应激的影
响
陈东;王金华;车頔;曾其毅
【摘要】Objective Mitochondrial dysfunction, cell energy metabolism, and oxidative stress play important roles in sepsis-induced acute brain injury.This study was to investigate the effects of Xingnaojing Injection (XNJ) on brain mitochondrial oxidative stress in rats with lipopolysaccharide (LPS)-induced sepsis.Methods Totally, 252 male SD rats were randomly divided into a normal control group, 3 LPS-induced sepsis model groups (LPS 6, 24, and 48 h), and 3 XNJ treatment groups (XNJ 6, 24, and 48 h), with 36 in each group.After treatment, the mitochondrial membrane potential (MMP) was monitored by flow cytometry and the levels of manganese superoxide dismutase (Mn-SOD), malondialdehyde (MDA), nitric oxide (NO), and nitric oxide synthase (NOS) were determined by chromatometry.Results The MMP was significantly increased in the XNJ 6 h group as compared with the LPS 6 h group (0.80±0.11 vs 0.54±0.19,
P<0.05).In the LPS and XNJ groups, the levels of MDA and NOS reached the peak at 6 hours and then dropped gradually, while those of NO and Mn-SOD rose to the peak at 24 hours followed by a gradual
fall.Statistically significant differences were observed in the levels of MDA, NOS and NO between the LPS 6h and XNJ 6 h groups (P<0.05), as well as in those of NOS, NO and Mn-SOD between the LPS 24 h and XNJ 24 h groups (P<0.05).Conclusion Xingnaojing Injection can elevate the level of
the brain mitochondrial membrane potential, improve anti-oxidation indexes in the mitochondria, and protect brain mitochondria in sepsis rats.%目的线粒体功能障碍、细胞能量代谢以及氧化应激在脓毒症引起的急性脑损伤中
起到重要作用.文中探讨醒脑静注射液对内毒素诱导脓毒症大鼠脑线粒体氧化应激
的影响. 方法将252只SPF级雄性SD大鼠按照随机数字表法随机分为正常对照组、脓毒症组与醒脑静组,其中脓毒症组与醒脑静组又按照不同干预时间分为脓毒
症6h组(LPS 6h组)、脓毒症24h组(LPS 24h组)、脓毒症48h组(LPS 48h组)、醒脑静6h组(XNJ 6h组)、醒脑静24h组(XNJ 24h组)和醒脑静48h组(XNJ 48h 组),共计7组,每组36只.脓毒症组大鼠腹腔注射脂多糖试剂(LPS) 10mg/kg后1h 尾静脉注射等渗盐水1mL;醒脑静组大鼠腹腔注射LPS 10mg/kg后1h尾静脉注
射醒脑静注射液1.6mL/kg;正常对照组大鼠腹腔与尾静脉注射与其他2组等体积
的等渗盐水.每组在相应时间点处理后,以流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化,比色法检测脑线粒体内锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合成
酶(NOS)及一氧化氮(NO)等氧化应激指标. 结果与LPS 6h组比较,XNJ 6h组膜电位差异有统计学意义[(0.54±0.19) vs (0.80±0.11), P<0.05].LPS组与XNJ组脑线粒体的MDA含量与NOS活性在6h达到高峰,随时间延长呈下降趋势.LPS组与XNJ组脑线粒体的NO浓度与Mn-SOD活性呈先升后降的趋势,在24h达到高峰.与LPS 6h组比较,XNJ6h组的脑线粒体MDA含量、NOS活性与NO浓度的差异均有统计学意义(P<0.05);与LPS 24h组比较,XNJ 24h组的脑线粒体NOS活性、NO浓度、Mn-SOD活性的差异有统计学意义(P<0.05). 结论醒脑静注射液可以提高脓毒症大鼠脑线粒体膜电位,改善线粒体内抗氧化指标,对脓毒症大鼠脑线粒体具有一定的保护作用.
【期刊名称】《医学研究生学报》
【年(卷),期】2017(030)007
【总页数】4页(P715-718)
【关键词】脓毒症;脑;线粒体;醒脑静注射液;氧化应激
【作者】陈东;王金华;车頔;曾其毅
【作者单位】510282 广州,南方医科大学珠江医院儿科中心;511400 广州,广州市
番禺中心医院儿科;510282 广州,南方医科大学珠江医院儿科中心;510282 广州,南方医科大学珠江医院儿科中心
【正文语种】中文
【中图分类】R631.2
脓毒症可引起急性脑损伤，临床被称为脓毒症脑病(septic encephalopathy, SE)。

合并急性脑损伤的脓毒症患者病死率明显高于单纯的脓毒症患者。

有研究发现，急性脑损伤已成为脓毒症的独立死亡因素，并越来越受到临床医师的重视[1]。

研究
发现线粒体功能障碍、细胞能量代谢以及氧化应激在脓毒症引起的急性脑损伤中起到重要作用[2-6]。

醒脑静注射液是临床上常用的中药复方制剂。

研究表明，醒脑
静注射液对卒中与全身炎症反应有一定作用[7-8]；而对于脓毒症所引起急性脑损
伤的保护作用有待进一步探讨。

本研究通过观察醒脑静注射液对脓毒症大鼠模型的脑线粒体一系列氧化应激指标变化，旨在进一步探讨脓毒症脑线粒体氧化应激损伤的程度及醒脑静注射液对脓毒症脑线粒体氧化应激的影响，为防治脓毒症引起的脑损伤提供依据。

1.1 实验动物及分组实验纳入SPF级雄性SD大鼠252只，体重230～250 g，
由广东省医学实验动物中心提供，实验动物许可证号：[SCXK(粤)2013-0002]。

适
应性喂养1周。

将SD大鼠按照随机数字表法分为7组，每组36只，分别纳入脓毒症6 h组(LPS6h组)、脓毒症24 h组(LPS 24 h组)、脓毒症48 h组(LPS 48 h 组)、醒脑静6 h组(XNJ 6 h组)、醒脑静24 h组(XNJ 24 h组)、醒脑静48 h组(XNJ 48 h组)以及正常对照组。

内毒素组和醒脑静治疗组分别于LPS注射后6、24、48 h进行处理。

脓毒症组大鼠腹腔注LPS 10 mg/kg后1 h尾静脉注射等渗盐水1 mL；醒脑静组大鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg后1 h尾静脉注射醒脑静注射液1.6 mL/kg(按照人-大鼠体表面积给药剂量公式换算)[9]；正常对照组大鼠腹腔和尾静脉注射与其他2组等体积的等渗盐水。

1.2 主要试剂与仪器 LPS购自Sigma公司；线粒体/细胞质制备试剂盒购自北京普利莱基因技术公司；蛋白浓度检测试剂盒，丙二醛、NO、一氧化氮合成酶检测试剂盒均购自南京建成科技有限公司。

荧光染料四乙基苯并咪唑基碳化氢碘
(5,5′,6,6′-tertrachloro-1,1′,3,3′-telraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide, JC-1) 购自Molecular probe公司。

流式细胞仪购自BD公司；酶标仪购自TECAN公司。

1.3 脑组织线粒体分析各实验组于相应时点处死大鼠后迅速取出50～80 mg脑组织， 3%戊二醛固定，制作电镜切片。

电镜下观察脑线粒体，按照Flameng分级方法对脑线粒体进行半定量分析[10]。

1.4 脑组织线粒体提取于相应时点处死大鼠后迅速取出脑组织150～200 mg，剪碎，加入1.5 mL预冷的Mito solution，研磨20～30次，4 ℃下匀浆液12
000×g离心5 min，取沉淀于试管底部的线粒体。

1.5 脑线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)检测采用JC-1作为MMP荧光探针进行检测。

避光，取0.1 mL总蛋白量为50 μg的脑线粒体悬液，再加入0.9 mL 5倍稀释的JC-1，37 ℃恒温水浴15 min。

常温下350×g离心4 min，取上清液进行分离线粒体膜电位的流式细胞仪分析。

以常规绿色荧光
(FITC-H)和红色荧光(PI-H)检测，实验结果采用平均荧光强度的比值(FL2/FL1)表
示线粒体膜电位。

1.6 氧化应激指标检测按照超氧化物歧化酶测定试剂盒、丙二醛测定试剂盒、NO 测定试剂盒与一氧化氮合酶测定试剂盒的说明书进行，最后在酶标仪以不同波长下测定A值并计算其浓度。

1.7 统计学分析使用SPSS 20.0进行统计学分析。

计量数据以均数±标准差±s)表示；釆用单因素方差分析(one-way ANOVA)对多组间均数进行比较，并用LSD
法分析方差齐的组间差异，用Games-Howeir法分析方差不齐的组间差异。

以
P≤0.05为差异有统计学意义。

2.1 实验大鼠一般情况 LPS组和XNJ组大鼠均出现心率、呼吸显著加快，体温明
显变化，拒食、拒饮，精神反应差，嗜睡，活动减少，竖毛等内毒素血症状态。

LPS组和XNJ组中，共计96只大鼠(38.1%)出现眼眶出血或其他出血倾向；151
只大鼠(59.9%)伴有腹泻。

LPS注射后30～36h后，XNJ组的大鼠较LPS组活泼，可自行饮食及饮水。

2.2 电镜下观察结果电镜下可见LPS 6 h组脑细胞质水肿明显，线粒体肿胀，嵴
变短或消失，内外膜模糊，空泡样改变；LPS 24 h组的线粒体为不同程度肿胀，
嵴断裂，内外膜不完整，空泡样改变；LPS 48 h组的线粒体与LPS 24 h组的镜下改变不大，空泡样改变较前减少。

而XNJ组各时间点镜下改变较LPS组各对应时点的线粒体形态均有所改善。

见图1。

2.3 线粒体超微结构评分与正常对照组比较，LPS 6 h组与XNJ 6 h组脑线粒体超微结构评分差异有统计学意义(P<0.05)；LPS 24 h、48 h组与XNJ 24 h、48 h
组的脑线粒体超微结构评分差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

LPS组和XNJ
组均在6 h的评分为最高，提示在脓毒症早期出现了脑线粒体超微结构性损伤，且迅速达到高峰。

2.4 各组膜电位比较 LPS 6 h组膜电位出现最低值，LPS 24 h组膜电位呈恢复趋势。

与正常对照组比较，LPS 6 h与LPS 24 h组的膜电位差异有统计学意义
(P<0.05)，LPS 48 h组、XNJ 6 h组、XNJ 24 h组、XNJ 48 h组与正常对照组
相比，膜电位差异无统计学意义(P>0.05)。

XNJ 6 h组与LPS 6 h组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。

见表1。

2.5 氧化应激指标比较 LPS组与XNJ组脑线粒体的MDA浓度与NOS活性在6 h 达到高峰，并随时间延长呈下降趋势。

LPS组与XNJ组脑线粒体的NO浓度与
Mn-SOD活性呈先升后降的趋势，在24 h达到高峰。

与正常对照组比较，LPS 6 h组、XNJ 6 h组、LPS 24 h组和XNJ 24 h组在脑线粒体MDA浓度、NOS活性与NO浓度的差异有统计学意义(P<0.05)；与正常对照组比较，LPS 24 h组和XNJ 24 h组的脑线粒体Mn-SOD活性差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

与LPS 6 h组比较，XNJ 6 h组对脑线粒体MDA浓度、NOS活性与NO浓度的
差异统计学意义(P<0.05)；与LPS 24 h组比较，XNJ 24 h组的脑线粒体NOS活性、NO浓度、Mn-SOD活性有统计学差异(P<0.05)，见表2。

大脑被认为是脓毒症最早受累的器官之一，其发病机制尚未清楚,涉及到氧化应激、钙超载、细胞因子和炎性介质损伤等方面[11-13]。

线粒体是细胞利用氧和合成ATP的主要场所。

糖类在线粒体内进行的有氧氧化提供了全身消耗的20%～25%能量。

故脑线粒体结构和功能对细胞、组织乃至整个机体功能起着关键性作用。

研究表明，脓毒症使脑线粒体功能失调引起能量代谢障碍，进而诱导细胞凋亡，是导致脓毒症脑病的发病机制之一[4-5]。

本研究观察到LPS组脑线粒体的膜电位较正常对照组低，LPS6h组的膜电位降至
最低。

随着实验时间延长，LPS组脑线粒体的膜电位逐渐上升，说明脓毒症早期存在线粒体功能损伤；膜电位的恢复可能提示脑线粒体具有自我恢复的能力。

通过电
镜观察到LPS组脑胞质水肿明显，线粒体肿胀，嵴消失，内外膜模糊，空泡样改变等形态学改变，超微结构评分较正常组明显升高，但评分并不随实验时间延长而改善。

LPS组的MDA与NOS水平明显升高，在6h达到高峰，SOD水平在24 h达到高峰，提示脓毒症大鼠的早期(6 h)即存在脑线粒体的损伤，但脑线粒体可能具有一定的自我调节能力。

研究中关于脑线粒体的可逆性功能恢复与形态学表现分离的现象，其具体机制还有待探讨。

醒脑静注射液是临床上常用的中药复方制剂，主要由麝香、冰片、栀子、郁金香等药物组成。

临床与基础研究均发现醒脑静注射液对于神经系统损伤性疾病，特别是对于脑血管性疾病的氧化应激反应具有一定作用[14-16]；但对于醒脑静注射液对脓毒症脑组织的保护作用尚未明确。

本研究通过电镜观察到XNJ组在6 h和24 h 的脑线粒体较LPS组对应时点，在形态学有上改善作用，XNJ6h组膜电位明显高于LPS 6 h组。

在氧化应激指标方面，本研究发现在脓毒症早期(6 h)，XNJ组脑线粒体的SOD活性较LPS组提高，MDA、NO、NOS的含量较LPS降低，提示醒脑静注射液的应用可清除氧自由基，减少脂质过氧化产物与氮化产物的生成，恢复抗氧化系统活力，从而保护线粒体结构和功能的完整性。

本研究采用单次给药，受到血药浓度的影响，导致XNJ组在24 h后的抗氧化应激作用不明显，提示在脓毒症早期(6 h)，醒脑静注射液抗氧化应激作用能保持线粒体内膜的完整性，减轻线粒体损伤。

综上所述，本研究进一步支持了脓毒症大鼠的早期存在脑线粒体损伤的观点。

从抗氧化应激的角度发现了在脓毒症早期，醒脑静注射液能够有效降低MDA、NO、NOS的含量，提高SOD水平，清除自由基，抑制氧化应激反应，对脓毒症大鼠脑线粒体功能具有保护作用，可以作为脓毒症脑病的治疗方向之一。

但醒脑静注射液由复合成分组成，今后的研究将进一步明确阻断体内氧化应激反应的作用机制。

【相关文献】
[1] 吕娟娟，曾其毅.脓毒症相关性脑病的研究进展[J]. 中国小儿急救医学, 2014, 21(3):168-170.
[2] 吕娟娟, 陈志江, 郑贵浪, 等. 脓毒症相关脑病远期脑线粒体损伤与氧化应激的关系[J]. 中华实用儿科临床杂志, 2015, 30(11):860-862.
[3] 曾其毅，王阳，钱新华.脓毒症大鼠脑线粒体功能损伤与氧化应激的关系[J].第四军医大学学报, 2009, 30(11):997-1000.
[4] Bozza FA, D′avila JC, Ritter C, et al.Bioenergetics, mitochondrial dysfunction, and oxidative stress in the pathophysiology of septic encephalopathy[J]. Shock, 2013, 39(Suppl 1):S10-16.
[5] 赖敏, 李双杰. 脓毒症线粒体损伤的氧化应激机制及靶向抗氧化剂的研究[J]. 国际儿科学杂志，2014，41(5)：458-461.
[6] 岳超,赵允召.生长激素在脓毒症中应用的研究进展[J].医学研究生学报,2013,26(8):871-874.
[7] 杨光田, 王进. 醒脑静对内毒素致大鼠全身炎症反应综合征的影响[J]. 中国药学杂志，2006,
8(41):1142-1144.
[8] 袁芳, 高庆春. 醒脑静注射液治疗急性脑出血的系统评价[J].中国神经精神疾病杂志, 2014, 40(1): 52-54.
[9] 魏伟, 吴希美, 李元建. 药理实验方法学[M]. 北京, 人民卫生出版社, 2010.
[10] Flameng W, Borgers M, Daenen W, et al. Ultrastructural and cytochemical correlates of myocardial protect ion by cardiac hypothermia in man [J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1980, 79(3): 413-424.
[11] Ding F，Shao ZW，Yang SH，et al.Role of mitochondrial pathway in compression induced apoptosis of nucleus pulposus cells[J]．Apoptosis, 2012, 17(6):579-590.
[12] 张立涛,于织波,刘洪英,等.辛伐他汀预处理对脓毒症大鼠心肌细胞诱导型一氧化氮合酶表达的影响及意义[J].医学研究生学报,2013,26(4):356-359.
[13] Lyu J, Zheng G, Chen Z, et al. Sepsis-induced brain mitochondrial dysfunction is associated with altered mitochondrial Src and PTP1B levels[J]. Brain Res, 2015, 1620:130-138.
[14] 王金华, 车頔, 陈东, 等. 醒脑静注射液对脓毒症大鼠心肌线粒体氧化应激损伤的作用[J]. 实用医学杂志, 2015, 31(9):1403-1406.
[15] 卢志刚，刘芸, 等.醒脑静注射液对急性脑梗死患者神经功能缺损的影响及其机制[J]. 中国中西医结合急救杂志, 2016, 23(4):352-355.
[16] 钟志越, 李炳, 刘明, 等. 醒脑静注射液对全脑缺血再灌注大鼠血脑屏障ZO-1表达的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2015, 31(7):1320-1323.。