依折麦布对饮食性高胆固醇血症大鼠胆固醇吸收及代谢相关靶点的调节作用

依折麦布对饮食性高胆固醇血症大鼠胆固醇吸收及代谢相关靶
点的调节作用
方沐潮;曹乐;贝伟剑
【摘要】目的探讨依折麦布对饮食性高胆固醇血症大鼠胆固醇吸收及代谢相关靶点的调节作用.方法雄性SD大鼠,正常组喂食普通饲料,其余组喂食高脂饲料,复制
饮食性高胆固醇血症大鼠模型.依折麦布组除喂食高脂饲料外,每天灌胃给药,连续给药4周,测定大鼠血清、粪便、肝脏的总胆固醇,并测定大鼠肝脏CYP7A1、LXRα、小肠NPClL1 mRNA和蛋白的表达水平.结果与正常组比较,模型组大鼠血清、粪
便总胆固醇含量均显著上升(P＜0.01),肝脏总胆固醇含量上升(P＜0.05).与模型组
比较,依折麦布组大鼠血清、肝脏总胆固醇含量均显著下降(P＜0.01),粪便总胆固醇含量显著上升(P＜0.01).依折麦布组大鼠肝脏CYP7A1、LXRα、小肠NPC1L1 mRNA和蛋白的表达与模型组、正常组比较均显著下降(P＜0.01).结论依折麦布
能降低饮食性高胆固醇血症大鼠血清和肝脏总胆固醇含量,增加粪便总胆固醇排出,
并能抑制肝脏CYP7A1及小肠NPC1L1的表达,其抑制CYP7A1表达可能与下调LXRα有关.
【期刊名称】《广东药学院学报》
【年(卷),期】2015(031)002
【总页数】5页(P219-223)
【关键词】依折麦布;NPC1L1;CYP7A1;LXRα;高胆固醇血症
【作者】方沐潮;曹乐;贝伟剑
【作者单位】广东药学院中医药研究院/国家中医药管理局脂代谢三级实验室及高
脂血症调肝降脂重点研究室,广东广州510006;广东药学院中医药研究院/国家中医药管理局脂代谢三级实验室及高脂血症调肝降脂重点研究室,广东广州510006;广
东药学院中医药研究院/国家中医药管理局脂代谢三级实验室及高脂血症调肝降脂
重点研究室,广东广州510006
【正文语种】中文
【中图分类】R965
尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick-C1-Like 1，NPC1L1)主要表达在人、猴子及大、小鼠的小肠和肝脏，可调控胆固醇的吸收[1]。

NPC1L1蛋白是胆固醇
跨膜转运的关键蛋白，在人肠表皮细胞膜和肝实质细胞膜上大量表达，是人体胆固醇代谢调节网络的关键节点之一[2-3]。

大量的细胞及动物实验表明，NPC1L1在
肠道胆固醇吸收及代谢过程中发挥重要作用[4-6]。

依折麦布(Ezetimibe，EZ)是先灵葆雅与默克公司合作研发的降脂药[7]，研究发现其作用靶点是位于小肠绒毛的
胆固醇吸收转运蛋白NPC1L1[8]，能抑制NPC1L1的活性，从而抑制肠腔胆固醇的吸收，降低血清胆固醇水平。

胆固醇7α羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1)是细胞色素P450家族成员之一，亦是胆汁酸经典合成途径的限速酶，其在肝内将胆固醇转化成胆汁酸，从而将机体胆固醇排出体外。

肝X受体(liver X-activated receptors，LXR)是核
受体超家族的成员，包括2种亚型LXRα(NR1H3)及LXRβ (NR1H2)。

LXRα是CYP7A1的转录调控因子，体内胆固醇的中间代谢产物是LXRα的天然配体，可激活LXRα，促进CYP7A1的表达[9]。

1．1 材料与试剂
依折麦布[Schering-Plough(Singapore)Pte Ltd，2EZPA060001]；
MaxRecoveroyTMBiooPureTMRNA Isolation Reagent(Bioo Scientific，5301-01)；ReveraidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific，00094711)；Maxima SYBR qPCR Master Mix(2×) (Thermo Scientific，00115021)。

引物由Invitrogen公司合成，引物序列见表1。

一抗 CYP7A1(ab65596)、LXRα(ab3585)、GAPDH(ab22555)、二抗(ab2761)均购于Abcam公司；NPC1L1(NB400-128)购于Novus公司；RIPA裂解液(碧云天，P0013B)；总胆固醇(CHO)测定试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，121431)；普通饲料和高脂饲料均购于广东省实验动物中心，高脂饲料配方如下(质量分数)：猪油10%、胆固醇2%、胆盐0．5%、蛋黄粉5%、基础饲料87．5%。

1．2 实验动物
SPF级雄性SD大鼠，购于广州中医药大学实验动物中心，体质量150～170 g，合格证号：检证字2012A056。

1．3 主要仪器
实时荧光定量 PCR仪(Applied Biosystems，Stepone Plus)；超微量分光光度计(Quawel，Q5000)；全自动生化分析仪(北京北方奥普森科技发展有限公司，AMS-18A)；高速匀浆机(ART，MICCRA D-1)；SC-3610低速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；PS265电泳仪电源(Hoefer)；miniVE垂直电泳槽(Hoefer)。

2．1 动物分组与处理
将大鼠随机分成正常组、模型组、依折麦布组，每组10只，除正常组喂食普通饲料，其余组均喂食高脂饲料，喂养15 d后，眼眶取血检测血清生化指标，模型组与依折麦布组大鼠血清总胆固醇(TC)、血清三酰甘油(TG)均比正常组高，差异有统计学意义(P＜0．05)，复制饮食性高胆固醇血症大鼠模型成功[10]。

模型组与依折
麦布组继续喂食高脂饲料，依折麦布以0．5%CMC-Na的生理盐水为溶媒，配制成0．25 g/ L，并按照2．5 mg/kg每天灌胃给药1次，模型组则给予等体积的
溶媒。

正常组继续喂食普通饲料，并每天给予等体积的生理盐水，连续给药4周。

2．2 样品采集
实验结束前36 h，单独饲养于代谢笼中，正常喂食，自由饮水，收集24 h内每只大鼠的粪便。

实验结束前12 h，所有大鼠均禁食，自由饮水，禁食11 h后按既定方案最后一次给药，给药1 h后乙醚麻醉，眼眶静脉丛取血，离心，分离血清，然后脱臼处死大鼠，取大鼠肝脏、小肠，预冷PBS清洗干净后，肝组织取距离肝边
缘0．5 cm处取相同部位肝右叶剪取0．1 g组织2份，分别放入1．5mL EP管内；小肠则取近胃一端，距离胃约2 cm处空肠处取0．1 g组织2份，分别放入1．5 mL EP管内，所有组织取出后立即放入-80℃冰箱内低温保存，待用于mRNA和蛋白表达水平检测。

再剪取肝组织0．5 g，放入5 mL离心管内，立即放入-80℃冰箱内低温保存，待用于检测肝脏生化指标[10]。

2．3 生化指标检测
采用全自动生化分析仪检测，以酶法测定血清总胆固醇。

粪便于80℃烘箱中干燥48 h，烘干后，研磨成粉。

称取干燥粪便0．5 g，加入氯仿甲醇溶液(V/V＝
7∶3)2 mL，气浴恒温摇床80 r/min，45℃提取12 h，3 000 r/min离心10 min 取上清，上清液中加入0．5 mL生理盐水涡旋振荡30 s，洗去可溶性杂质，3 000 r/min离心10 min取下层有机相作为样品，以酶法检测粪便总胆固醇[11]。

肝脏组织中的总胆固醇，按上述方法加入提取液后，匀浆，并按照上述粪便方法提取，以酶法检测肝脏总胆固醇。

2．4 Q-PCR法检测肝脏细胞 CYP7A1、LXRα mRNA及小肠细胞NPC1L1 mRNA表达水平
肝脏、小肠组织样品从-80℃冰箱取出后，立刻移至已用液氮预冷的研钵中，迅速
研磨，此间向研钵中及时补充液氮，至磨成粉末，趁液氮未挥发完将粉末迅速移至1．5 mL EP管中，每100 mg组织加入1 mL BiooPure，并按BiooPure说明书提取总RNA，超微量分光光度计检测总RNA浓度，然后逆转录为cDNA。

PCR
扩增采用20μL反应体系，反应条件为95℃预变性，持续10 min，95℃变性，持续15 s，CYP7A1、LXRα、NPC1L1、GAPDH退火及延伸温度均为62℃，持续
1 min，40个循环，溶解曲线分析，加热至95℃，持续15 s，95℃ -60℃，持续1 min。

反应完毕，设定正常组大鼠的基因表达水平为1，各实验组大鼠与其进行对比。

用2-ΔΔCt表示实验组大鼠目的基因表达相对于正常组的变化倍数，ΔΔCt
＝实验组大鼠(Ct目的基因-Ct内参基因)-正常组大鼠(Ct目的基因-Ct内参基
因)[12]。

2．5 Western blot法检测肝脏细胞CYP7A1、LXRα及小肠细胞NPC1L1蛋白表达
肝脏、小肠组织样品从-80℃冰箱取出后，每0．1 g加入1 mL含有1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，于冰上匀浆机匀浆，4℃充分裂解15 min，然后12 000
r/min离心15 min，取上清经BCA法测定蛋白样品浓度，调整样品上样量，使蛋白最终上样量为40μg。

经SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后转移至PVDF膜上，
室温下加5%脱脂奶粉封闭2 h；洗膜，加一抗稀释液(均为1∶2 000)4℃过夜孵育，第2天室温下孵育30 min；洗膜，加二抗稀释液(1∶5 000)，室温孵育2 h，洗膜后，加ECL进行化学发光反应。

2．6 统计学方法
采用SPSS13．0统计软件，实验数据用±s表示，各组间检验方差齐性后采用AVOVA进行比较，P＜0．05为差异有统计学意义。

3．1 依折麦布对饮食性高胆固醇血症大鼠血液、粪便及肝脏中总胆固醇含量的影
响
与正常组比较，模型组血清、粪便及肝脏的胆固醇含量均显著上升(P＜0.01或P
＜0.05)。

依折麦布组的粪便胆固醇显著上升(P＜0.01)。

与模型组比较，依折麦布组的大鼠粪便胆固醇含量显著上升(P＜0．01)，肝脏胆固醇含量显著下降(P＜
0.01)。

见表1。

3．2 依折麦布对饮食性高胆固醇血症大鼠肝脏CYP7A1和LXRαmRNA和蛋白表达的影响
与正常组比较，模型组大鼠CYP7A1及LXRα mRNA的表达量均有所下降，但其差异均无统计学意义(P＞0．05)。

与正常组比较，依折麦布组肝脏CYP7A1、LXRαmRNA的表达量降低(P＜0．01)；与模型组比较，依折麦布组大鼠肝脏
LXRα的表达量降低(P＜0．01)。

见图 1、3。

Western blot结果与mRNA结果
一致。

见图2、图4。

3．3 依折麦布对饮食性高胆固醇血症大鼠小肠NPC1L1 mRNA和蛋白表达的影
响
与正常组比较，模型组小肠NPC1L1 mRNA表达量显著升高(P＜0．01)。

与正常组、模型组比较，依折麦布组小肠NPC1L1 mRNA表达量均显著性下降(P＜0．01)。

见图5。

Western blot结果与mRNA结果一致。

见图6。

依折麦布能够显著降低饮食性高胆固醇血症大鼠的血清胆固醇水平，与其抑制大鼠小肠绒毛NPC1L1的活性有关[8，13]。

本研究发现，在饮食性高胆固醇血症大鼠中，依折麦布不仅通过抑制NPC1L1活性来发挥作用，亦能在基因水平上抑制NPC1L1 mRNA的表达，从而抑制胆固醇吸收，让未被小肠吸收的胆固醇经肠腔
通过粪便排出体外，本研究结果与During A等[14]的体外实验结果相符。

另一方面，依折麦布能抑制饮食性高胆固醇血症大鼠肝脏CYP7A1 mRNA的表达，同时还发现LXRαmRNA的表达下调，与Genvigir等[15]的体外实验结果不完全
一致，Genvigir等的研究使用依折麦布(1．0～5．0μmol/L)孵育HepG2细胞，
发现依折麦布能够下调HepG2细胞LXRβ的mRNA表达，但对LXRαmRNA表
达无调节作用，这可能是体内和离体实验不同所致。

Sugizaki等[16]在研究中给予雄性肥胖小鼠依折麦布，发现依折麦布能够减少肥
胖小鼠肝内的氧化甾醇类的含量。

由于氧化甾醇类是LXR的配体，氧化甾醇减少，LXR则不会被激活，Sugizaki T认为依折麦布是通过减少肝脏甾醇类的含量，从
而抑制LXR的活性。

本研究发现，依折麦布组大鼠肝脏胆固醇含量，与正常组比
较差异无统计学意义，因此依折麦布对CYP7A1的下调作用，可能并不是通过降
低肝内胆固醇含量，从而抑制LXRα的激活产生的。

依折麦布对CYP7A1及LXRα的下调作用，可能与依折麦布直接抑制其表达有关，具体机制仍需进一步研究。

依折麦布通过抑制大鼠小肠NPC1L1的活性及表达，从而抑制胆固醇的吸收，降
低血清胆固醇，但其对肝脏CYP7A1存在明显的抑制作用，CYP7A1在体内的主
要作用是将胆固醇转化为胆汁酸，这是机体降低胆固醇的重要途径，因此临床上对高胆固醇血症患者使用依折麦布需更加谨慎，特别是对非饮食性引起的高胆固醇血症患者可能不但不能降低胆固醇水平，还可能因CYP7A1受抑制，而减少过高的
胆固醇向胆汁酸转化，加重高胆固醇血症和胆汁酸生成过少带来的不良作用，包括脂肪类消化不良等。

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