基因工程的基本操作程序课件

3.将目的基因导入动物细胞 (1)方法：__显__微__注__射__法____。 (2)常用受体细胞：_____受__精__卵_____。
4．将目的基因导入微生物细胞 (1)方法 ①用____C__a_2_＋______处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环 境中 DNA 分子的生理状态(这种细胞称为__感__受__态__细__胞____)。 ②感受态细胞吸收____重__组__表__达__载__体__D__N_A__分__子______。 (2)受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌细胞)。 (3)原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 等。
基因工程的基本操作程序
知识点一 目的基因的获取
1.目的基因：主要是指__编__码__蛋__白__质____的基因，也可以是一些 具有调控作用的因子。
2.目的基因的获取方法 (1)从基因中获取 ①基因：将含有某种生物不同基因的许多 DNA 片段，导入 __受__体__菌__的__群__体__中储存，各个受体菌包一含种一生种物生物__的__所____有一____的部____分________基___因_基因 ③提取依据：基因的核苷酸序列、基因的功能、___基__因__在__染__色___ ___体__上__的__位__置_______、基因的转录产物 mRNA，以及基因的表达 产物蛋白质等特性。
2．基因表达载体的组成
启动子 终止子
标记基因
基因表达载体的组成 两子启动和终止；目的基因在中间；标记基因来筛选。
3．基因表达载体的功能：通过基因表达载体将___目__的__基__因_____ 导入受体细胞。
1．真核细胞的基因结构 (1)结构：①编码区：内含子、外显子；②非编码区：启动子、 终止子。基因结构如下图所示：
的新基因
工作量大、操作过程较麻 需要严格控
缺点 盲目性大、烦，技术要求过 制温度、技 适用范围小
专一性差 高
术要求高
知识点二 基因表达载体的构建
1．构建基因表达载体的目的 (1) 使 目 的 基 因 在 ___受__体__细__胞_____ 中 稳 定 存 在 ， 并 且 可 以 ______遗__传______给下一代。 (2)使目的基因能够______表__达______和发挥作用。
交汇点 1 启动子、终止子和起始密码子、终止密码子 (1) 启 动 子 、 终 止 子 是 基 因 表 达 载 体 上 的 具 有 特 殊 结 构 的 ____________片段。 (2)起始密码子、终止密码子是____________上的三个相邻碱基。 交汇点 2 复制原点和启动子 (1)复制原点位于载体的开始端，驱动载体的________，若复制 原点被破坏，则重组载体将无法复制。 (2)启动子则位于某基因的首端，负责驱动该基因的________。
(3)人工合成
如果目的基因较小，核苷酸序列又已知，可通过 DNA 合成仪 用___化__学__方__法_____人工合成。1．cDNA 与基因组的区别类型
cDNA 基因组大小小大
基因中启动子
无
有
基因中内含子
无
有
基因多少
某种生物的部分 某种生物的全部基因
基因
物种间的基因交流
1．农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA 上；第二次 拼接(非人工操作)是指插入目的基因的 T­DNA 被拼接到受体 细胞的染色体 DNA 上。第一次导入是将含目的基因的 Ti 质粒 导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。
1．目的基因的检测与鉴定方法
2．关于不同分子检测的原理、场所、探针的异同 (1)原理：转录水平的检测原理与复制水平的检测原理是相似的， 只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组 DNA，而是 mRNA；翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的 原理。 (2)场所：不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都 是在体外进行的。
(3)探针：在 DNA 分子、mRNA 分子水平上检测目的基因是否 插入、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标 记的含有目的基因的 DNA 片段。
3．常见不同转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法 个体水平的鉴定实际上是检测目的基因是否表达出所控制的 性状，不同的转基因生物检测方法不同。
可以
部分基因可以
2.PCR 技术与 DNA 复制的区别
项目
DNA 复制
PCR 技术
解旋方式 解旋酶催化
DNA 在高温作用下变性解旋
场所
细胞内(主要在细 细胞外(主要在扩增仪内)
胞核内)
解旋酶、普通的
酶
耐热的 DNA 聚合酶(Taq 酶)
DNA 聚合酶等
温度条件 细胞内温和条件 需控制温度，在较高温度下进行
(2)表达：只有编码区能转录生成 RNA，且内含子转录生成的 部分要剪切掉，即转录生成的 mRNA 只有外显子的对应部分。 因此，以 mRNA 为模板，反转录产生的目的基因中没有内含 子、启动子和终止子。
目的基因本：质主：要一是段指有编特码殊蛋结白构质的的D基NA因片段 基因启动子位 功置 能：：基是因RN的A首聚端合酶识别和结合的
合成的对象 DNA 分子
DNA 片段或基因
3.获作简单
专一性强
专一性强， 可在短时间
可产生自然 内大量扩增
界中不存在 目的基因
合到受体细胞 精卵发育→获 合→感受态细
的 DNA 中→表 得具有新性状 胞吸收 DNA 分
达
的动物
子
知识点四 目的基因的检测与鉴定
1.分子水平检测 (1)检测转基因生物的 DNA 上是否插入了目的基因。 方法：_D__N_A__分__子__杂__交__技术。 (2)检测目的基因是否转录出 mRNA。 方法：____分__子__杂__交____技术。 (3)检测目的基因是否翻译成蛋白质。 方法：__抗__原__—__抗__体____杂交技术。 2.个体生物学水平鉴定：抗虫、抗病、抗逆性状的有无及程度。
转基因生物 抗虫植物 抗病毒(菌)植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物 的转基因生物
检测方法
观察目标
害虫吞食
害虫死亡
病毒(菌)感染
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产 细胞产物功
品进行功能活性比较 能活性正常
表达 2.载体
的组 成
部位，驱动目的基因转录出mRNA
终止子本 位质 置： ：一 基段 因有 的特 尾殊 端结构的DNA短片段 功能：使转录在所需要的地方停止下来
复制原点：使目的基因复制和传递
标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，
从而将含有目的基因的细胞筛选出来
基因表达载体易错点剖析 (1)基因工程中的基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相 比增加了目的基因。 (2)目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与 终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部 位，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。 (3)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶。如果两种不 同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在 DNA 连接酶的作用 下目的基因与载体也可以连接起来。
答案：交汇点 1 (1)DNA (2)mRNA 交汇点 2 (1)自我复制 (2)转录
知识点三 将目的基因导入受体细胞
1.转化的概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内 __维__持__稳__定__和__表__达____的过程。 2.将目的基因导入植物细胞 (1)__农__杆__菌__转__化____法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植 物。 (2)基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。 (3)__花__粉__管__通__道____法：我国科学家独创的一种方法。
(2)利用 PCR 技术扩增目的基因 ①PCR 的含义：是一项在生物体外复制_特__定__D__N_A__片__段__的核酸 合成技术。 ②目的：短时间内大量扩增目的基因。 ③原理：_D__N_A__双__链__复__制__。
④过程 第一步：加热至 90～95 ℃，___D_N__A_解__链_____； 第二步：冷却至 55～60 ℃，_____引__物_______结合到互补 DNA 链； 第三步：加热至 70～75 ℃，____热__稳__定__D_N__A_聚__合__酶____ (Taq 酶) 从引物起始进行互补链的合成。 如此重复循环多次。 ⑤特点：指数形式扩增。
2．不同受体细胞的常用导入方法
种类 项目
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法 显微注射法 Ca2＋处理法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
目的基因插入 目的基因表达 Ca2＋处理细胞
Ti 质粒的 T 载体提纯→取 →感受态细胞
DNA 上→导入 卵(受精卵)→ →表达载体与
转化过程 植物细胞→整 显微注射→受 感受态细胞混