肺癌转基因小鼠构建

硕士学位论文结果（二）结果
１，ＳＰＯ－ｎｅｕ及ｓＰｃ＊Ｒａｓ（ｒｏｕｔ）质粒的构建结果
Ｉ．ＩＫ．妣（ｒｏｕｔ）测序结果
测序结果表明已经成功克隆Ｋ－ｌｈｓ突变体（ＧＧＴ突变为ＡＧＴ）如图佃所示。

＾ＧＴＣ６Ｂ＾ＧＣＴ▲ＤＴ６６ＣＧＴ＾Ｇ
ＧＧＡＧＣ哦ＧＴＡＧＧ突变序列
ＩｌＩｌＩｌｌｌＩＩＩＩｌｌＩＩ
＇ＧＧＡＧＣ嘶ＧＴＡＧＯ正常序列
图７．ｋ－ｒｕ（ｒｏｕｔ）测序结果（箭头示变异位点）图８．ｋ－ｒａｓ（ｒｏｕｔ）ｂｌａｓｔ结果
１．２酶切检验ＳＰＣ－Ｋ－Ｉ跏（ｒｏｕｔ）结果，及线性化片断
以酶切检验构建ＳＰＣ·Ｋ－Ｒａｓ（ｒｏｕｔ）预计结果如表１，经琼脂糖电泳检测结果
正确如图９，ｚｏ所示。

表１．ｓＰｃ－Ｉ－ＲａＩ（ｍｕｔ）酶切表
图９．ＳＰＣ．Ｋ－Ｒａｓ（ｒｏｕｔ）酶切检验结果泳道Ｍ：ＤＮＡＬＡＤＤＥＲＭＩＸ；ｌ：ＮｄｅＩ
２：ＮｏｔＩ：３：ＮｄｅＩ＋ＮｏｔＩ图１０．ＳＰＣ．Ｋ－Ｒａｓ（ｍａｔ）线性化回收结果泳道Ｍ：ＤＮＡＬＡＤＤＥＲＭＩＸ；ｈＮｄｅＩ＋ＮｏｔＩ
经ＮｄｅＩ＋ＮｏｔＩ酶解后所获彳导的供显微注射用的ＳＰＣ－Ｋ－Ｒａｓ（ｍｕｔ）ＤＮＡ片
断结构如图１１所示
硕士学位论文结果
图１１．ｓｐｃ－ｋ－ｒａｓ０ｍｔ）ＤＮＡ线性化片断
１．３酶切检验ＳＰＣ－ｎｅｕ及线性化片断回收结果
以酶切检验构建ＳＰＣ－ｎｅｕ预计结果如表２，经琼脂糖电泳检测结果正确如图
１２。

１３所示。

表２．ＳＰＣ－ｎｏｕ酶切表图１２．ＳＰＣ－ｎｅｕ酶切检验结果
泳道Ｍ：ＤＮＡ
ＬＡＤＤＥＲＭＩＸ；１：ＮｈｅＩ＋ＮｏｔＩ２：ＢｇｌＩ；３：ＫｐｎＩ；４：Ｎｄｅ
Ｉ；５：ＳａｌＩ；６：ＳｃａＩ：７：Ｘｂａ
Ｉ图１３．ＳＰＣ－－ｎｅｕ线性化回收结果泳道Ｍ：ＤＮＡＬＡＤＤＥＲＭＩＸ；１：ＮｈｅＩ＋ＮｏｔＩ经ＮｈｅＩ＋ＮｏｔＩ酶解后所获得的供显微注射用的ＳＰＣ．１ｉｅｕＤＮＡ片段结构如图１４所示
图１４．ＳＰＣ－ｎｅｕ线性化片断
从以上结果判断转基因载体已经构建成功，回收线性化片段正确，稀释后用
于注射受精卵。

硕士学位论文结果２、转基因小鼠的构建
２．１结扎公鼠ｉ
结扎４．８周龄昆明白公鼠２０只，其中１６只术后成活，恢复两星期后，与促排卵母鼠交配，第二天见拴，十天之后处死母鼠，查看子宫，均无发育胚胎，结扎成功。

２．２得到子代小鼠
ＳＰＣ－－ｎｅｕ得到代孕母鼠１０只，其中７只产下子代小鼠，总计４０只，所有小鼠均为黑色毛发，非代孕母鼠亲缘后代。

如图１５所示，代孕母鼠和结扎公鼠均为白色皮毛，子代小鼠为棕黑色皮毛
图１５代孕母鼠以爰后代
ＳＰＣ－Ｉ－Ｒａ￥舢ｔ）得到代孕母鼠６只，其中３只产下予代小鼠，一窝出生后被母鼠咬死吃掉，最后得到１６只子代小鼠。

３、转基因阳性鼠的筛查
３．１ＰＣＲ筛查阳性小鼠
为避免与小鼠基因组上同源序配对出现非特异性条带，我们的引物设计跨越
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了启动子和基因，并尽量避免同源区域。

以Ｔｚ７００ｂｐ，Ｔｚ５００ｂｐ两对引物扩增检测ＳＰＣ－ｎｅｕ４０只子代小鼠，从圉１６，１７结果显示，只有ＴｚＡ３号小鼠为整合外源片段的阳性小鼠。

图１６．７００ｂｐ引物ＰｃＲ扩增筛查结果
泳道Ｍ：ｐｕｃＨＩＸ８；３：ＴｚＡ３号小鼠；１３：阳性对照；其余孔为阴性小鼠结果
图１７．５００ｂｐ引物Ｉ＇ＣＲ扩增筛查结果
泳道Ｍ：ｐｕｃＭＩｘ８；３：ＴｚＡ３号小鼠；１１：阳性对照；其余孔为阴性小鼠结果
由于人类的ｋ－ｒａｓ基因与小鼠的同源性较低，我们采用ｋ－ｒａｓ引物直接检测ｓｐｃ／ｒａｓ（ｍｕｔ）自带小鼠，结果非常遗憾，没有得到阳性小鼠，在后续章节中不予指出。

３．２ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测外源片段的完整性以及判断整合方式
我们采用７００ｂｐ引物和５００ｂｐ引物ＰＣＲ的产物作为探针，在ＴｚＡ３号小鼠以及后代中做ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交。

同位素标记好的探针通过液闪仪测定放射性强度均超过１×１０９ｃｐｍ／ｕｇ。

图１８．示探针位置，图１９，２０．显示ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果。

图１８．线性化ＳＰＣ－ｎｅｕ探针位置图
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图１９．以ＰａｇＩ醇切，７００ｂｐ探针截ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果
泳道Ｍ：ＤＮＡＬａｄｄｅｒＭＩＸｍａｒｋｅｒ；ｌ：ＴｚＡ３号４、鼠同窝阴性对照：２－６：Ｆ１代ＰＣＲ阳性小鼠；７：ＴｚＡ３号小鼠；８：１０个拷贝的阳性对照．
图２０．以Ｈｉｎｄｌｌｌ醇切，５００ｂｐ探钟截ｓｏｕｔｈｅｍ杂交结果
泳道Ｍ：ＤＮＡＬａｄｄｅｒｇｌＸｍａｒｋｅｒ；ｌ－５：Ｆｌ代阳性小鼠交配得到的Ｆ２代小鼠５只：６：阴性对照．
硕士学位论文结果
由于显微注射法的转基因方法将使外源基因随机插入小鼠基因组中，并且常常为多个拷贝的同时整合。

因此片段的插入通常存在着多种连接方式，所以
ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交也会出现不同的带型，最基本的可以分为以下三种：
片段之间以３’．５’相接的方式，得到的阳性条带根据图２ｌ可以进行判断：
图２１．ｓＰｃ．ｎｅｕ３＇－５’相接
以ＰａｇＩ酶切，７００ｂｐ探针做ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，结果应得到转基因片段的全长９．５ｋｂ的阳性条带。

以ＨｉｎｄＩＩＩ酶切，５００ｂｐ探针做ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，结果应得到５．７ｋｂ的阳性条带。

若存在５＇－５’相接的方式，得到的阳性条带根据图２２可以进行判断：
以ＰａｇＩ酶切，７００ｂｐ探针做ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，结果不能得到小片段的阳性条带。

以ＨｉｎｄＩＩＩ酶切，５００ｂｐ探针做ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，结果应得不能得到小片段的阳性条带。

若存在３＇－３’相接的方式，得到的阳性条带根据图２３可以进行判断：
图２３．ＳＰＣ－ｎｅｕ３’－３’相接
以ＰａｇＩ酶切，７００ｂｐ探针做ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，结果应得到１４．４ｋｂ的阳性条带．以ＨｉｎｄｌＩＩ酶切，５００ｂｐ探针做ｓｏｕｔｈｃｍ杂交，结果应得到１１．６ｋｂ的阳性条带。

图１９从探针的位置分析，阳性条带应该大小为９５１３ｂｐ的片段全长因此推测可能为头尾串联整合。

图２０进一步证实了这一结论，得到了５．７ｋｂ的阳性条带。

图１９显示该片段与对照组ｌＯ拷贝的浓度相似，我们估计在小鼠中整合大约有５－１０个拷贝数。

在Ｆ１代没有出现分型，推测转基因只插入到了一条染色体．经鉴定，现有转基因小鼠如图２４所示，得到Ｆｌ代阳性鼠１２只，Ｆ２代阳性鼠１６只。

硕士学位论文结果Ｆ１一
Ｆ２—６
４
＋６
９
＋辛
７
一旱
‘圉２４转基因小鼠家系简图
３．３ＦＩＳＨ结果
我们取阳性转基因小鼠的脾脏，收集脾细胞悬液进行培养后，进行制片，经过Ｇ带染色后，再进行ＦＩＳＨ杂交，使得我们能够很好的分析阳性条带所在的染色体位置。

此后我们对于结果进行分析嘲，初步得出转基因片段整合入１６号染色体。

结果见图２５至图２７
图２５染色体Ｇ带染色结果‘箭头所指为１６号染色体’
目２６．ＦＩＳＨ杂交结果（箭头所指为阳性信号）
２９
硕士学位论文结果
图２７．小鼠Ｇ带核型图
３．４ＲＥＡＬ－ＴＩＭＥＰＣＲ测定肺组织中ｎｅｌｌ基因的表达；
ＲＮＡ水平的检测是转基因小鼠成功的关键步骤，因此，我们取１５月龄的１弘３号阳性小鼠，近４月龄的Ｆ１代阳性小鼠和１５月龄的阴性同种对照小鼠肺部组织ｍＲＮＡ．，检测ｎｅｌｌ基因的表达差异。

图２８显示ＲＥＡＬ－ＴＩＭＥＰＣＲ荧光收集结果图，图２９显示产物的特异性。

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图勰．ＲＥＡＬ－ＴＩＭＥＰＣＲ荧光收集结果
表３
ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｃｔ值结果ｃｕｒｖｅＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒＣｔＳｅｔｐｏｉｎｔ
１１矾３阳性小鼠肺ｆｌｅｕ基因检测３２．７
２Ｆ１代阳性小鼠肺ｎｅｕ基因检测３４．１
３Ｔ２Ａ３同窝阴性小鼠肺ｎｅｕ基因检测３７．７
４１弘３阳性小鼠肺ｂ－ａｃｔｉｎ基因检测２８．３
５Ｆ１代阳性小鼠肺ｂ－ａｃＩｉｎ基因检测２８．２
６ＴｚＡ３同窝阴性小鼠肺ｂ－ａｃｔｉｎ基因检测
２６．７
堡主兰堡堡茎丝墨
田３０ｏＪ、鼠肺部Ｈ／Ｅ袭色结果
Ａ：ＴｚＡ３Ｆｏｕｎｄｅｒ（１５月龄）（２００倍），箭头示淋己细胞浸润；Ｂ：ＴｚＡ３Ｆｏｕｎｄｅｒ（ＩＳ月龄’（４００倍），箭头示闻质组织细胞增生反淋巴细胞漫润；ｃ：ＦＩ代（６月龄’（２００倍），蕾央示毛细血管黔血反淋巴细胞浸润；Ｄ：Ｆ１代（６月龄）（４００倍）莆夹示支气管上皮结构紊乱；Ｅ：Ｆ２代ｐ月龄’（２００倍）正常；Ｆ：正常小鼠对照（６月龄）（４００倍），箭头示正常上皮
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３．６免疫组化结果
免疫组织化学分析ｌｉｅＵ的表达，结果显示转基因鼠肺泡上皮细胞胞浆中度染色，肺泡炎症性同质背景中可见体积较大的组织样细胞胞浆中度染色，背景淋巴细胞无染色，支气管上皮细胞胞浆染色，正常鼠肺泡及支气管上皮细胞胞浆轻度或无染色。

如图３ｌ所示。

图３１ｍｕ肺部免疫组化结果
Ａ：ＴｚＡ３Ｆｏｕｎｄｅｒ（１５，ｑ龄）‘４００倍），箭头示肺泡上皮细胞胞浆中度染色；Ｂ：Ｆｌ（６，ｑ龄＇代（４００倍），箭夹示支气管土皮细胞胞策襄色ｃ：Ｆ２代（３月龄’（４００倍），箭头示肺泡上皮细胞胞蒙４＇／ｔ豢色；Ｄ：正常４ｔ鼠（６月龄）对照支气管上皮细胞胞策轻度或无染色。