酶的稳定性
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
使酶构象坚固化
酶通过多点固定于载体上防止链的 伸展, 增加稳定性；立体障碍防止蛋 白水解酶的降解作用
在无水条件下, 不可逆灭活中的许 多过程受到抑制,增加稳定性 定点突变取代不稳定的氨基酸残基， 引入稳定酶的因素
添加剂
许多化合物可增加溶液酶或冻干过程中酶的稳定性。这类物 质分为三类：
专一性的底物和配体； 非专一性的中性盐和多羟基化合物； 与酶失活剂竞争的物质或除掉破坏化学反应催化剂的物质。
反相胶团
用适当的口袋包埋酶或使酶微囊化，可使酶在不利环境下 有效地起作用。反相胶团最易提供这种微囊化。反相胶 团是由两性化合物在与水不混溶的溶剂中得到微乳化的 胶团。
蛋白质间非共价相连
蛋白质间相互作用时，由于从蛋白质表面相互作用区域排除 水，因而降低自由能，增加蛋白质的稳定性。
抗体稳定酶。有些抗体可以在蛋白质开始伸展的部位或发生 蛋白质水解的部位起作用，因此可以稳定蛋白质。
螯合剂
EGTA (ethylene glycol-bis-(beta-amino-ethyl EDTA( ethylene diamine tetraacetic acid) ether) N,N,N‘,N’-tetraacetic acid)
有机溶剂
重金属和巯基试剂
热
受热脱水反应α-氨基酸加热时可发生分子间脱水，生成交酰胺。
氢键
3-异丙基苹果酸脱氢酶 (3-Isopropylmalate Dehydrogenase)
St: Salmonella typhimurium; Ec: Escherichia coli; Tt: Thermus thermophilus
盐桥
3-异丙基苹果酸脱氢酶 (3-Isopropylmalate Dehydrogenase)
n=4
固定化
A：用双功能试剂交联 B：共价或非共价 连于载体上
C：包埋到载体 的紧密孔中
（1） 肌酸激酶是重要的临床诊断用酶，但天然酶在溶液中 很不稳定。用CNBr将酶单点固定在琼脂糖上，则酶失活 曲线类似于可溶性酶，但多点固定在琼脂糖上时，其活 力可保存18 h以上，35 h后仍保持原活力的50%。
疏水相互作用
3-异丙基苹果酸脱氢酶 (3-Isopropylmalate Dehydrogenase)
St: Salmonella typhimurium; Ec: Escherichia coli; Tt: Thermus thermophilus
3-异丙基苹果酸脱氢酶 (3-Isopropylmalate Dehydrogenase)
“不可逆”构象改变 2. 共价结构变化的失活 (1) 酸、碱催化的肽键水解 (2) 脱酰胺 (3) 功能基氧化
(4) 二硫键交换 (5) 氨基酸的外消旋化 (6) β-消除形成一个新的分子内交联键
环境因素
加热，变性剂脲，盐酸胍，SDS，振动 螯合剂、透析、加热，金属离子 化学修饰，极端 pH，脲，表面活性剂，高 温或低温 加热，极端 pH，有机溶剂，盐酸胍
丙氨酸）。
酸碱破坏盐桥
氧化作用
表面活性剂和去污剂
变性剂
（1） 8-10 mol/L脲或6 mol/L盐酸胍 （破坏氢键）
urea
Guanidine Hydrochloride
高浓度盐
高浓度盐对蛋白质既可有稳定作用，也可有变性作用。与 Hofmeister离子促变序列有关：
例如，（NH4）2SO4是众所周知的酶稳定剂，贮存酶时常用 它。相反，NaSCN是已知的紊乱剂，使蛋白质不稳定。
St: Salmonella typhimurium; Ec: Escherichia coli; Tt: Thermus thermophilus
提高酶稳定性的方法
方法 添加稳定剂 化学修饰
共价交联 固定化
反应介质 蛋白质工程
说明 如酶的底物、底物类似物、辅酶、盐 类、糖、多元醇
用疏水性试剂修饰蛋白表面亲水基 团可降低其稳定性,而用亲水性试剂 修饰疏水基团可增加其稳定性
压力 压力诱导的失活通常认为是蛋白质变性后聚合的结果。
冷冻和脱水
很多变构酶在温度降低时会产生构象变化。低温减弱了疏水 相互作用，引起蛋白质解离或变性。
在冷冻过程中，溶质（酶和盐）随着水分子的结晶而被浓缩， 引起酶微环境中的pH和离子强度的剧烈改变。如磷酸盐 缓冲液的pH在冷冻后可由7变到3.5，这个pH很容易引起 蛋白质的酸变性。此外，盐的浓缩可提高离子强度，引 起寡聚蛋白质的解离。
1931年，我国生化界先驱吴宪教授提出著名的蛋白质变性学 说，即“天然蛋白质之分子，因环境种种之关系，从有 秩序而坚密之构造，变为无秩序散漫之构造，是为变性 作用。若数分子相撞而缠结，则为凝固作用。蛋白质变 性之种种事实，均可以此说解释之。”
吴 宪： 著名生物化学家，中央研究院院士 1893年，出生于福建
St: Salmonella typhimurium; Ec: Escherichia coli; Tt: Thermus thermophilus
二硫键
30-100 kcal mol-1
金属离子、底物、辅因子和其它低分子量配体 的结合作用
three histidines of carboxypeptidase A coordinating to the zinc
蛋白质的疏水表面与水的接触在热力学上是不利的，使酶不 稳定，因此，用化学修饰法降低蛋白质表面的疏水性，即实 现蛋白质表面的亲水化是稳定蛋白质的有效方法。用苯四酸 酐酰化α-胰凝乳蛋白酶就是通过亲水化达到稳定化的很成 功的例子。此试剂主要修饰蛋白质的氨基，每修饰1个氨基， 可引入3个新的羧基，在60℃时，稳定化效应提高103倍。
PLS
Expression
少量蛋白可溶，采取什么 措施增加可溶性蛋白的量？
topT7
lacI
pHL001 pls
aac(3)IV 11331 bps
oriT/RK2 int
BamHI
1. 表达速度过快-降低表达温度 2. 减少IPTG的量 3. 用LBBS（含有山梨醇和甜菜碱）代
替LB，生长慢，有利于正确折叠 4. 加入必要的辅因子 5. 与某些辅酶共表达
Human lactalbumin with the bound calcium ion in cyan and three asp
ligands in red.
蛋白质-蛋白质的相互作用
对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低
氨基酸残基的坚实装配
St: Salmonella typhimurium; Ec: Escherichia coli; Tt: Thermus thermophilus
α- 胰 凝 乳 蛋 白 酶 包 埋 在 聚 丙 烯 酸 和 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 。 60℃时固定化酶要比天然酶稳定1000倍。
(2) 酶与载体多点非共价相连也能稳定酶
例如，把胰凝乳蛋白酶酶包埋在带电的聚甲基丙烯酸凝胶 [浓度大于30%（w/w）]中，则此酶的热稳定性急剧增加 几个数量级。这是因为凝胶上的电荷增加，酶和凝胶载 体间的非共价接触（静电力和氢键）也增加，导致酶构 象坚固，热稳定性增加。
酶分子内交联增加酶的热稳定性
例如，先用碳二亚胺活化酶的羧基，然后，处理过的酶 再与不同长度的二胺[H2N(CH2)nNH2,其中n=0-12]作用，结 果二胺的两个氨基与酶上的活化羧基键合，即在酶分子上 架起一座“桥”。所形成的这种桥越多，酶的构象越稳定。 对α-胰凝乳蛋白酶来说，n=4的二胺最合适，交联剂太长或 太短对酶稳定化都不利。经过n=4二胺处理过的α-胰凝乳蛋 白酶的稳定化程度要比50℃时天然酶高3倍。
极端 pH 值，加热，蛋白水解酶 加热，高 pH 氧气（特别在加热时）氧气代谢产物，辐 射 加热，高 pH，巯基化合物，二硫化物 加热，极端 pH 加热，高 pH
极端pH
-H2O +
R1:Asp R1:Asp; R2:Pro
天冬酰胺和谷氨酰胺的 脱胺作用
碱催化的β-消除反 应可破坏二硫键，同 时形成脱氢丙氨酸和 硫代半胱氨酸残基。 脱氢丙氨酸与赖氨酸 的ε-氨基发生加成 反应，形成一个新的 分子内交联键（赖氨
化学修饰
可溶性大分子如聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、肝素等多糖 以及白蛋白、多聚氨基酸等和小分子修饰酶。
稳定化的原因： A) 修饰有时会获得不同于天然蛋白质构象的更稳定构象; B) 由于修饰“关键功能基团”也会达到稳定化; C) 由化学修饰引入到蛋白质中的新功能基可以形成附加氢
键或盐键; D) 用非极性试剂修饰可加强蛋白质中的疏水相互作用; E) 蛋白质表面基团的亲水化。
机械力
机械力，如压力、剪切力、振动和超声能使蛋白质变性。
振动 振动增加气-液界面的面积。使疏水残基最大限度地 暴露于空气而聚合。
剪切 当酶溶液快速通过管道或膜时，在管壁处产生剪切力 梯度。这个梯度能引起蛋白质构象变化，导致原先埋藏 的疏水区域暴露，然后聚合。
超声波 超声波使溶解的气体产生小气泡，小气泡迅速膨胀 至一定程度时突然破碎，产生空化作用，它既产生机械 力，又产生化学变性剂（如在小气泡中热反应所产生的 自由基），结果使蛋白质失活。
thermusthermophilus提高酶稳定性的方法方法说明添加稳定剂如酶的底物底物类似物辅酶盐类糖多元醇化学修饰用疏水性试剂修饰蛋白表面亲水基团可降低其稳定性而用亲水性试剂修饰疏水基团可增加其稳定性共价交联使酶构象坚固化固定化酶通过多点固定于载体上防止链的伸展增加稳定性
6. 酶的稳定性
第一个蛋白质变性理论
蛋白质工程
1． 工程二硫键 2． 增加蛋白质内部疏水性 3． 酶表面亲水化 4． 突变易氧化的氨基酸残基（Met，Asn）
思考题
lacI tfd int
attP
oriT-right p10H80L4Yb1p5sT7 RNApol
Express T7 RNApol
hyg t0
T7 RNAP
Transcription
60 年 代 C.B.Anfinsen 通 过研究牛胰核糖核酸酶的折 叠过程，蛋白质在加热或一 些化学环境下变性，即三维 结构解体，当环境恢复后， 蛋白又恢复到原来的结构。 因此，提出了“一级结构决 定高级结构”的著名论断。 开辟了近代蛋白质折叠的研 究 ， 为 此 Anfinsen 获 得 了 1972年的诺贝尔化学奖。
1911年，1916年，获学士学位
1917年，入哈佛大学攻读生物化学博士学位，建立了 血液中糖的检测方法，为胰岛素的发现做出重要贡献。
1920年，回国加入北京协和医学院。为我国生物化学 学科培养了大批人才。
蛋白质变性的定义：
蛋白质变性（protein denaturation）：蛋白质 在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被破 坏，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失， 这种现象称为蛋白质变性。
H3C
O
C OH H NH
CH
HC CH3
NH H HO C
O
-2H2O
O C
H3C HC
NH CH CH3
NH C
O
Pro是一种亚氨基酸,有一个刚性的五元环。位于Pro的肽键 易发生顺-反异构化。这种转变在0℃的半转变时间为20 min,但以每10℃增加3.3倍速率加速。因此,当升温时Pro 异构化将会破坏多肽链的构象并阻止正确的折叠。
酶的失活模型
Lumry-Eyring模型
F (folded)
U (unfolded)
I (folded)
对于球状蛋白质，它的折叠和伸展两个状态的自由能之差, 在5～15 kcal mol-1范围内。 共价键键能: 30-100 kcal mol-1。
酶蛋白不稳定的原因
失活机理
1. 构象改变造成失活 聚合（有时伴随形成分子间二硫键） 辅酶分子从活性部位上解离 寡聚蛋白解离成亚基
酶通过多点固定于载体上防止链的 伸展, 增加稳定性；立体障碍防止蛋 白水解酶的降解作用
在无水条件下, 不可逆灭活中的许 多过程受到抑制,增加稳定性 定点突变取代不稳定的氨基酸残基， 引入稳定酶的因素
添加剂
许多化合物可增加溶液酶或冻干过程中酶的稳定性。这类物 质分为三类：
专一性的底物和配体； 非专一性的中性盐和多羟基化合物； 与酶失活剂竞争的物质或除掉破坏化学反应催化剂的物质。
反相胶团
用适当的口袋包埋酶或使酶微囊化，可使酶在不利环境下 有效地起作用。反相胶团最易提供这种微囊化。反相胶 团是由两性化合物在与水不混溶的溶剂中得到微乳化的 胶团。
蛋白质间非共价相连
蛋白质间相互作用时，由于从蛋白质表面相互作用区域排除 水，因而降低自由能，增加蛋白质的稳定性。
抗体稳定酶。有些抗体可以在蛋白质开始伸展的部位或发生 蛋白质水解的部位起作用，因此可以稳定蛋白质。
螯合剂
EGTA (ethylene glycol-bis-(beta-amino-ethyl EDTA( ethylene diamine tetraacetic acid) ether) N,N,N‘,N’-tetraacetic acid)
有机溶剂
重金属和巯基试剂
热
受热脱水反应α-氨基酸加热时可发生分子间脱水，生成交酰胺。
氢键
3-异丙基苹果酸脱氢酶 (3-Isopropylmalate Dehydrogenase)
St: Salmonella typhimurium; Ec: Escherichia coli; Tt: Thermus thermophilus
盐桥
3-异丙基苹果酸脱氢酶 (3-Isopropylmalate Dehydrogenase)
n=4
固定化
A：用双功能试剂交联 B：共价或非共价 连于载体上
C：包埋到载体 的紧密孔中
（1） 肌酸激酶是重要的临床诊断用酶，但天然酶在溶液中 很不稳定。用CNBr将酶单点固定在琼脂糖上，则酶失活 曲线类似于可溶性酶，但多点固定在琼脂糖上时，其活 力可保存18 h以上，35 h后仍保持原活力的50%。
疏水相互作用
3-异丙基苹果酸脱氢酶 (3-Isopropylmalate Dehydrogenase)
St: Salmonella typhimurium; Ec: Escherichia coli; Tt: Thermus thermophilus
3-异丙基苹果酸脱氢酶 (3-Isopropylmalate Dehydrogenase)
“不可逆”构象改变 2. 共价结构变化的失活 (1) 酸、碱催化的肽键水解 (2) 脱酰胺 (3) 功能基氧化
(4) 二硫键交换 (5) 氨基酸的外消旋化 (6) β-消除形成一个新的分子内交联键
环境因素
加热，变性剂脲，盐酸胍，SDS，振动 螯合剂、透析、加热，金属离子 化学修饰，极端 pH，脲，表面活性剂，高 温或低温 加热，极端 pH，有机溶剂，盐酸胍
丙氨酸）。
酸碱破坏盐桥
氧化作用
表面活性剂和去污剂
变性剂
（1） 8-10 mol/L脲或6 mol/L盐酸胍 （破坏氢键）
urea
Guanidine Hydrochloride
高浓度盐
高浓度盐对蛋白质既可有稳定作用，也可有变性作用。与 Hofmeister离子促变序列有关：
例如，（NH4）2SO4是众所周知的酶稳定剂，贮存酶时常用 它。相反，NaSCN是已知的紊乱剂，使蛋白质不稳定。
St: Salmonella typhimurium; Ec: Escherichia coli; Tt: Thermus thermophilus
提高酶稳定性的方法
方法 添加稳定剂 化学修饰
共价交联 固定化
反应介质 蛋白质工程
说明 如酶的底物、底物类似物、辅酶、盐 类、糖、多元醇
用疏水性试剂修饰蛋白表面亲水基 团可降低其稳定性,而用亲水性试剂 修饰疏水基团可增加其稳定性
压力 压力诱导的失活通常认为是蛋白质变性后聚合的结果。
冷冻和脱水
很多变构酶在温度降低时会产生构象变化。低温减弱了疏水 相互作用，引起蛋白质解离或变性。
在冷冻过程中，溶质（酶和盐）随着水分子的结晶而被浓缩， 引起酶微环境中的pH和离子强度的剧烈改变。如磷酸盐 缓冲液的pH在冷冻后可由7变到3.5，这个pH很容易引起 蛋白质的酸变性。此外，盐的浓缩可提高离子强度，引 起寡聚蛋白质的解离。
1931年，我国生化界先驱吴宪教授提出著名的蛋白质变性学 说，即“天然蛋白质之分子，因环境种种之关系，从有 秩序而坚密之构造，变为无秩序散漫之构造，是为变性 作用。若数分子相撞而缠结，则为凝固作用。蛋白质变 性之种种事实，均可以此说解释之。”
吴 宪： 著名生物化学家，中央研究院院士 1893年，出生于福建
St: Salmonella typhimurium; Ec: Escherichia coli; Tt: Thermus thermophilus
二硫键
30-100 kcal mol-1
金属离子、底物、辅因子和其它低分子量配体 的结合作用
three histidines of carboxypeptidase A coordinating to the zinc
蛋白质的疏水表面与水的接触在热力学上是不利的，使酶不 稳定，因此，用化学修饰法降低蛋白质表面的疏水性，即实 现蛋白质表面的亲水化是稳定蛋白质的有效方法。用苯四酸 酐酰化α-胰凝乳蛋白酶就是通过亲水化达到稳定化的很成 功的例子。此试剂主要修饰蛋白质的氨基，每修饰1个氨基， 可引入3个新的羧基，在60℃时，稳定化效应提高103倍。
PLS
Expression
少量蛋白可溶，采取什么 措施增加可溶性蛋白的量？
topT7
lacI
pHL001 pls
aac(3)IV 11331 bps
oriT/RK2 int
BamHI
1. 表达速度过快-降低表达温度 2. 减少IPTG的量 3. 用LBBS（含有山梨醇和甜菜碱）代
替LB，生长慢，有利于正确折叠 4. 加入必要的辅因子 5. 与某些辅酶共表达
Human lactalbumin with the bound calcium ion in cyan and three asp
ligands in red.
蛋白质-蛋白质的相互作用
对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低
氨基酸残基的坚实装配
St: Salmonella typhimurium; Ec: Escherichia coli; Tt: Thermus thermophilus
α- 胰 凝 乳 蛋 白 酶 包 埋 在 聚 丙 烯 酸 和 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 。 60℃时固定化酶要比天然酶稳定1000倍。
(2) 酶与载体多点非共价相连也能稳定酶
例如，把胰凝乳蛋白酶酶包埋在带电的聚甲基丙烯酸凝胶 [浓度大于30%（w/w）]中，则此酶的热稳定性急剧增加 几个数量级。这是因为凝胶上的电荷增加，酶和凝胶载 体间的非共价接触（静电力和氢键）也增加，导致酶构 象坚固，热稳定性增加。
酶分子内交联增加酶的热稳定性
例如，先用碳二亚胺活化酶的羧基，然后，处理过的酶 再与不同长度的二胺[H2N(CH2)nNH2,其中n=0-12]作用，结 果二胺的两个氨基与酶上的活化羧基键合，即在酶分子上 架起一座“桥”。所形成的这种桥越多，酶的构象越稳定。 对α-胰凝乳蛋白酶来说，n=4的二胺最合适，交联剂太长或 太短对酶稳定化都不利。经过n=4二胺处理过的α-胰凝乳蛋 白酶的稳定化程度要比50℃时天然酶高3倍。
极端 pH 值，加热，蛋白水解酶 加热，高 pH 氧气（特别在加热时）氧气代谢产物，辐 射 加热，高 pH，巯基化合物，二硫化物 加热，极端 pH 加热，高 pH
极端pH
-H2O +
R1:Asp R1:Asp; R2:Pro
天冬酰胺和谷氨酰胺的 脱胺作用
碱催化的β-消除反 应可破坏二硫键，同 时形成脱氢丙氨酸和 硫代半胱氨酸残基。 脱氢丙氨酸与赖氨酸 的ε-氨基发生加成 反应，形成一个新的 分子内交联键（赖氨
化学修饰
可溶性大分子如聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、肝素等多糖 以及白蛋白、多聚氨基酸等和小分子修饰酶。
稳定化的原因： A) 修饰有时会获得不同于天然蛋白质构象的更稳定构象; B) 由于修饰“关键功能基团”也会达到稳定化; C) 由化学修饰引入到蛋白质中的新功能基可以形成附加氢
键或盐键; D) 用非极性试剂修饰可加强蛋白质中的疏水相互作用; E) 蛋白质表面基团的亲水化。
机械力
机械力，如压力、剪切力、振动和超声能使蛋白质变性。
振动 振动增加气-液界面的面积。使疏水残基最大限度地 暴露于空气而聚合。
剪切 当酶溶液快速通过管道或膜时，在管壁处产生剪切力 梯度。这个梯度能引起蛋白质构象变化，导致原先埋藏 的疏水区域暴露，然后聚合。
超声波 超声波使溶解的气体产生小气泡，小气泡迅速膨胀 至一定程度时突然破碎，产生空化作用，它既产生机械 力，又产生化学变性剂（如在小气泡中热反应所产生的 自由基），结果使蛋白质失活。
thermusthermophilus提高酶稳定性的方法方法说明添加稳定剂如酶的底物底物类似物辅酶盐类糖多元醇化学修饰用疏水性试剂修饰蛋白表面亲水基团可降低其稳定性而用亲水性试剂修饰疏水基团可增加其稳定性共价交联使酶构象坚固化固定化酶通过多点固定于载体上防止链的伸展增加稳定性
6. 酶的稳定性
第一个蛋白质变性理论
蛋白质工程
1． 工程二硫键 2． 增加蛋白质内部疏水性 3． 酶表面亲水化 4． 突变易氧化的氨基酸残基（Met，Asn）
思考题
lacI tfd int
attP
oriT-right p10H80L4Yb1p5sT7 RNApol
Express T7 RNApol
hyg t0
T7 RNAP
Transcription
60 年 代 C.B.Anfinsen 通 过研究牛胰核糖核酸酶的折 叠过程，蛋白质在加热或一 些化学环境下变性，即三维 结构解体，当环境恢复后， 蛋白又恢复到原来的结构。 因此，提出了“一级结构决 定高级结构”的著名论断。 开辟了近代蛋白质折叠的研 究 ， 为 此 Anfinsen 获 得 了 1972年的诺贝尔化学奖。
1911年，1916年，获学士学位
1917年，入哈佛大学攻读生物化学博士学位，建立了 血液中糖的检测方法，为胰岛素的发现做出重要贡献。
1920年，回国加入北京协和医学院。为我国生物化学 学科培养了大批人才。
蛋白质变性的定义：
蛋白质变性（protein denaturation）：蛋白质 在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被破 坏，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失， 这种现象称为蛋白质变性。
H3C
O
C OH H NH
CH
HC CH3
NH H HO C
O
-2H2O
O C
H3C HC
NH CH CH3
NH C
O
Pro是一种亚氨基酸,有一个刚性的五元环。位于Pro的肽键 易发生顺-反异构化。这种转变在0℃的半转变时间为20 min,但以每10℃增加3.3倍速率加速。因此,当升温时Pro 异构化将会破坏多肽链的构象并阻止正确的折叠。
酶的失活模型
Lumry-Eyring模型
F (folded)
U (unfolded)
I (folded)
对于球状蛋白质，它的折叠和伸展两个状态的自由能之差, 在5～15 kcal mol-1范围内。 共价键键能: 30-100 kcal mol-1。
酶蛋白不稳定的原因
失活机理
1. 构象改变造成失活 聚合（有时伴随形成分子间二硫键） 辅酶分子从活性部位上解离 寡聚蛋白解离成亚基