人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达
贾向志;袁汉英;马文煜;李元;李育阳
【期刊名称】《第四军医大学学报》
【年(卷),期】2001(022)022
【摘要】目的利用巴斯德毕赤(Pichia pastoris)酵母真核表达系统,构建真核表达载体pPIC9K与人溶菌酶基因(human lysozyme, hLY)的重组质粒pPIC9K-hLY,表达出具有活性的人溶菌酶. 方法此项研究在本实验室构建的人溶菌酶(hLY)基因与pUC19的重组质粒pUC19-hLY的基础上,通过设计一对引物,用多聚酶链式反应(PCR)扩增出人溶菌酶全基因片段后,将其克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-hLY,经Bg1Ⅱ酶切线性化后,用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内. 通过G418筛选,选到的高拷贝转化子经PCR检测人溶菌基因与毕赤酵母染色体是否稳定整合,阳性克隆经甲醇诱导进行表达. 结果序列测定,经PCR扩增后的人溶菌酶基因与文献发表的序列相比,缺失4个碱基. 我们决定采用重组PCR法予以纠正,经序列测定结果正确. 用PCR检测,人溶菌酶基因与毕赤酵母染色体稳定整合. 用甲醇诱导表达并以SDS-PAGE分析,在Mr为15 000左右出现一条蛋白带,表达量约占上清总蛋白的0.47. Western Blot证实表达产物具有天然人溶菌酶的抗原性. 用黄色小球菌平板溶圈法鉴定表达产物具有人溶菌酶的活性. 结论成功的构建了重组质粒pPIC9K-hLY并在毕赤酵母中表达了人溶酶基因.【总页数】5页(P2068-2072)
【作者】贾向志;袁汉英;马文煜;李元;李育阳
【作者单位】第四军医大学微生物学教研室;复旦大学生命科学院遗传所上;第四军医大学微生物学教研室;第四军医大学微生物学教研室;复旦大学生命科学院遗传所上
【正文语种】中文
【中图分类】R392.11
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