暹罗鳄多肽粉的生物效应研究

暹罗鳄多肽粉的生物效应研究
李华亮;张剑;林齐帆;陈丽平;熊佑熊;陈清西
【摘要】In the previous study.we had reported that peptide powder from Crocodylus siamensis was prepared using the enzymatic catalysis of trypsin. In this paper,the effects of this peptide powder on the scavenging ?
OH,O2- ? .and DPPH.and its total reducing power were further investigated to reveal the antioxidation. Inhibitory effect on mushroom tyrosinase of the peptide powder was also studied. The results showed that the peptide powder had a strong antioxidant activity,with its half scavenging concentration to ? OH, O2- ? .and DPPH being 1. 2,2. Land 6. 5
mg/mL,respectively,and there was a positive correlation between the reducing power andits concentration. The peptide powder could strongly inhibit the biphenolase activity of mushroom tyrosinase, and the value of Icso was determined to be 6. 60 mg/mL. Our results indicate that peptide powder from C. Siamensis is a natural health product, and has some potential properties in anti-fatigue and anti-aging.%在获得暹罗鳄(Crocod ylus siamensis)多肽粉的基础上,进一步研究了暹罗鳄多肽粉对羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O2-·)和1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH)的清除作用以及总还原力,以揭示其抗氧化能力.同时研究了暹罗鳄多肽粉对酪氨酸酶活性抑制作用.结果显示,暹罗鳄多肽粉具有较强的抗氧化、清除自由基作用,其总还原力与暹罗鳄多肽粉含量呈正相关,对·OH、O2-·和DPPH的半清除浓度HSC50分别为1.2,2.1和6.5 mg/mL.暹罗鳄多肽粉对酪氨酸酶活力有明显的抑制作用,其IC50为6.60
mg/mL.结果表明,暹罗鳄多肽粉具有一定的生物学功效,是一种天然的保健品.
【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2011(050)006
【总页数】4页(P1076-1079)
【关键词】暹罗鳄;多肽粉;抗氧化
【作者】李华亮;张剑;林齐帆;陈丽平;熊佑熊;陈清西
【作者单位】厦门大学生命科学学院,福建厦门361005;厦门大学生命科学学院,福
建厦门361005;厦门大学生命科学学院,福建厦门361005;厦门大学生命科学学院,
福建厦门361005;泰国是拉差龙虎园有限公司,泰国是拉差;厦门大学生命科学学院,福建厦门361005
【正文语种】中文
【中图分类】Q514.3
鳄为水陆两栖动物，在世界各地分布很广.作为药用动物，鳄肉具有极高的药用价
值［1］.清代《医林纂要》称鼍肉“用熬膏，溃坚拔毒，去瘀生肌”，则提到鳄肉熬膏为药的用法［2］.现代研究表明，鳄肉含有丰富的优质蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素及多种微量元素，还富含人体必需的9种氨基酸，含量高于猪、鸡、鸭等
肉类［3］.鳄肉含有大量的有机物质，配以中药使用，对呼吸道肿瘤有较强的抑制作用，既能促进抗体生成，又可增强网状内皮系统的吞噬功能，提高免疫能力，阻断致癌性病毒的入侵和复制［4］.
酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶，催化酪氨酸羟化形成L-多巴（单酚酶活性，L-DOPA），并将多巴氧化成多巴醌（二酚酶活性），多巴醌经一系列的反应生成黑色素（melanin）.若酪氨酸酶受到抑制，则多巴将被脱羧酶转化为神经递质——
多巴胺［5］.由此可见酪氨酸酶不仅与皮肤病（如老年斑及光照损伤等）密切相关，还与人脑中的神经黑色素形成及神经退行性病变相关的帕金森病有关.因此设计出
筛选酪氨酸酶抑制剂，并用于与黑色素失调相关疾病的治疗，已成为研究的热点. 前文我们报道了暹罗鳄（Crocodylussiamensis）多肽粉的制备方法，暹罗鳄多肽粉的组成成分及毒理实验，阐明暹罗鳄多肽粉是一种无毒、高蛋白、低糖、低脂的保健品，氨基酸种类齐全，8种人体必需氨基酸含量丰富［6］.为了进一步探讨暹罗鳄多肽粉的生物学功效，我们深入探讨暹罗鳄多肽粉的体外抗氧化、清除自由基能力，以及对酪氨酸酶活力的抑制作用，以期为暹罗鳄保健品的开发及应用提供理论基础.
暹罗鳄肉由泰国是拉差龙虎园有限公司提供；蘑菇酪氨酸酶（Tyrosinase）购自Sigma化学公司；LDOPA购自Aldrich公司；邻非罗啉、邻苯三酚以及1，1－
二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH）购自Sigma化学公司；其余试剂均为国产分析纯；所用的蒸馏水为无离子双蒸馏水；暹罗鳄多肽粉按文献［6］方法酶解制备. ·OH能杀死红细胞，降解DNA、细胞膜和多糖化合物.参考文献［7］，应用Fenton反应产生·OH的模型检测暹罗鳄多肽粉对·OH的清除作用.取7.5 mmol／L邻非罗啉0.75 m L加入p H 7.4的磷酸盐缓冲液2.5 m L，充分混匀后，加7.5 mmol／L的硫酸亚铁0.75 m L，每加一管立即混匀；加体积分数为0.1%H 2 O2最后以水补充至相同体积，反应液37℃保温1 h，测536 nm处的吸光度，为A
损伤，实验组先加样品后加H 2 O2，测A加样，不加H 2 O2和样品液的吸光度，为A空白.暹罗鳄多肽粉对·OH的清除能力按下式计算：实验重复3次，取平均值并作图.
氧分子受单一电子还原的产物称为超氧阴离子（O2＋e→·）.·既是阴离子，又是自由基，性质活泼，具有很强的氧化性和还原性，过量的与羟基结合后的产物会导致细胞DNA损坏，可致组织损伤破坏人类机体功能.在体内主要通过超氧歧化酶清
除.参考文献［8］，应用邻苯三酚自氧化反应体系测定暹罗鳄多肽粉清除的能力.取4.5 m L p H 8.34的磷酸盐缓冲液（终浓度50 mmol／L），1.2 m L蒸馏水，混匀后在25℃的水浴中保温20 min，取出后立即加入在25℃预热的邻苯三酚0.3 m L（终浓度0.2 mmol／L），总体积为6.0 m L，在325 nm下测反应启动后4 min内邻苯三酚自氧化速率为V自.样品测定时，只是在加入邻苯三酚前分别加入一定量的样品体积，蒸馏水减少相应体积，测反应启动后4 min内样品抑制邻苯三酚自氧化的氧化速率为V样品.暹罗鳄多肽粉对·的清除能力按下式计算：实验重复3次，取平均值并作图.
DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基，在517 nm处有一强吸收峰，其醇溶液呈紫色的特性.当有自由基清除剂存在时，由于与其电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析.被广泛用于测定生物试样、食品的抗氧化能力.参考文献［9］，1.9 m L无水乙醇中加入1 m L不同浓度的效应物（暹罗鳄多肽粉），加入0.1 m L 3 mmol／L DPPH，立即混匀，室温反应30 min，测定在517 nm处的吸光值A.暹罗鳄多肽粉对DPPH的清除能力按下式计算：
实验重复3次，取平均值并作图.
实验重复3次，取平均值并作图.
参考文献［11］，在0.05 mol／L磷酸盐缓冲液（p H 6.8）的测活体系中，以0.5 mmol／L的L-DOPA为底物，分别加入不同浓度的样品和酶液，最终反应体系为3.0 m L，效应物的终浓度为0～15.0 mg／m L，酶浓度为3.33μg／m L，以双蒸水作为实验对照.30℃恒温条件下测定波长为475 nm的吸光值A.实验重复3次，取平均值，以酶的相对剩余活力对样品浓度作图，求得效应物的IC50值. 暹罗鳄多肽粉对由Fenton体系产生的·OH有一定的清除作用，在较低浓度下就有清除效果，且随着浓度的增加，对·OH的清除能力也增强，结果见图1，研究表明
其清除率与暹罗鳄多肽粉的浓度呈明显的正比关系，当暹罗鳄多肽粉质量浓度为3.43 mg／m L时，清除率高达95.5%，其对·OH的半清除浓度HSC50为1.2
mg／m L.
暹罗鳄多肽粉对邻苯三酚自氧化体系产生的也有较强的清除作用，在较低浓度下就有清除效果，且随着浓度的增加，对的清除能力也增强，结果见图2.研究表明清
除率与暹罗鳄多肽粉的浓度呈明显的正比关系.当暹罗鳄多肽粉质量浓度为
3.5 mg／m L时，清除率可达56.96%，其对O2－·的半清除浓度 HSC50为2.1 mg／m L.
暹罗鳄多肽粉对DPPH具有一定的清除作用，在较低的质量浓度下有较高的清除
效果，且随其质量浓度的增加而不断增强，当暹罗鳄多肽粉质量浓度为6.0 mg／
m L时，其对DPPH的清除率可达44.2%，测定暹罗鳄多肽粉对DPPH的半清除浓度HSC50为6.5 mg／m L，结果见图3.
应用三氯化铁氧化模型测定暹罗鳄多肽粉总还原力，以不加暹罗鳄多肽粉组为对照，加不同浓度的暹罗鳄多肽粉为实验组，然后计算出实验组相对于对照组相对还原力的倍数关系，结果见图4.结果表明暹罗鳄多肽粉有较强的还原力，且随着浓度的
增加，相对还原力的倍数也相应的增加，呈现明显的正比关系.
以暹罗鳄多肽粉为效应物，研究其对酪氨酸酶活力的影响.在以L-DOPA为底物的测活体系中，加入不同浓度的暹罗鳄多肽粉，检测酶的活力.以不加效应物为对照，测定酶相对的剩余活力.实验结果显示：暹罗鳄多肽粉对酶活力有较强的抑制作用，且抑制率与其浓度成正相关.导致酶活力下降50%所需的暹罗鳄多肽粉的浓度
（IC50）为6.60 mg／m L，结果见图5.提示该多肽粉具有作为治疗帕金森病的
辅助性保健食品的应用前景.
自由基在生物体内具有重要的生理功能，如调节细胞增殖与分化，参与机体免疫，以及生殖和胚胎发育等.另一方面，自由基在机体内损伤蛋白质、核酸和细胞膜，
导致细胞凋亡等.在正常的生命过程中，自由基为维持生命所必需.体内自由基不断
产生，也不断地被清除，两者处于动态平衡之中，使之维持在一个正常的生理水平上［12］.目前的研究表明，多种疾病的产生、发展均与自由基密切相关，如衰老、动脉粥样硬化、神经变性病、癌症等.此外人体身体疲劳也与自由基过量产生密切
相关［13］.本研究以暹罗鳄肉为材料，制备了具有较强抗氧化、清除自由基的暹
罗鳄多肽粉，对·OH、以及DPPH的清除率与暹罗鳄多肽粉含量成正比，其半清
除浓度 HSC50分别为1.2，2.1和6.5 mg／m L，这可能与暹罗鳄多肽粉中含有
丰富的半胱氨酸、还原型谷胱甘肽等还原性物质有关，它们可以与自由基结合，减少自由基对人体组织细胞的破坏.另外，暹罗鳄多肽粉对酪氨酸酶活力具有较强的
抑制作用，且抑制率随浓度的增大而增大，其IC50为6.60 mg／m L，这些结果揭示暹罗鳄多肽粉可作为缓解因为内源性L-DOPA不足引起帕金森病的辅助保健
食品.
总之，暹罗鳄多肽粉含有丰富的营养成分，又具有较好的抗氧化、清除自由基、抑制酪氨酸酶活性的生物学功效，具有开发成为抗疲劳、抗衰老、提高免疫力的保健品的应用潜力.
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