头发中烟碱和可替宁的超高效液相色谱测定

头发中烟碱和可替宁的超高效液相色谱测定
刘正聪;陆舍铭;刘春波;招云芳;王海利;温亚东;缪明明
【摘要】采用5%NaOH水溶液超声萃取-超高效液相色谱法同时测定了36个主动吸烟者头发样品和10个被动吸烟者头发样品中的烟碱和可替宁含量.结果表明:①烟碱和可替宁的RSD分别为3.52%和2.99%;回收率均为98.5%～
101.6%;②主动吸烟者和被动吸烟者头发样品中均检测到烟碱,而可替宁只在主动吸烟者头发样品中检出;③主动吸烟者头发中的烟碱含量的高低主要是由其烟龄和日均吸烟支数决定的,而与其生理年龄关系较小;④主动吸烟者头发中的可替宁含量高低主要是由其烟龄决定的,而与其日均吸烟支数和生理年龄关系较小.该法操作简便,准确性高,重复性好,可用于批量头发样品中烟碱和可替宁含量的快速分析.
【期刊名称】《烟草科技》
【年(卷),期】2010(000)003
【总页数】4页(P38-41)
【关键词】超高效液相色谱;烟碱;可替宁;头发
【作者】刘正聪;陆舍铭;刘春波;招云芳;王海利;温亚东;缪明明
【作者单位】红塔烟草集团有限责任公司技术中心,云南省玉溪市红塔大道118号,653100;云南大学化学科学与工程学院,昆明市翠湖北路2号,650091;红塔烟草集团有限责任公司技术中心,云南省玉溪市红塔大道118号,653100;红塔烟草集团有限责任公司技术中心,云南省玉溪市红塔大道118号,653100;云南民族大学化学与生物技术学院,昆明市一二一大街134号,650031;红塔烟草集团有限责任公司技术中心,云南省玉溪市红塔大道118号,653100;云南大学化学科学与工程学院,昆明
市翠湖北路2号,650091;红塔烟草集团有限责任公司技术中心,云南省玉溪市红塔大道118号,653100;云南民族大学化学与生物技术学院,昆明市一二一大街134号,650031;红塔烟草集团有限责任公司技术中心,云南省玉溪市红塔大道118号,653100;红塔烟草集团有限责任公司技术中心,云南省玉溪市红塔大道118号,653100
【正文语种】中文
【中图分类】TS416
烟碱（nicotine)是烟草中的主要生物碱,是导致吸烟成瘾的物质动因,也是评价人体摄入烟草烟雾的常用指标。

可替宁是烟碱在体内的主要代谢产物,是评价烟草烟雾摄入量的生物标志物[1-2]。

烟碱和可替宁在头发中的半衰期比在血液、唾液中的半衰期长,测定发样中烟碱和可替宁的含量水平可以反映人群较长期对烟草烟雾的暴露情况,可以为流行病学调查提供定量依据[3],用于评价烟草烟雾对人体健康的影响。

目前,检测生物材料中烟碱及其代谢产物的方法主要有气相色谱/质谱联用法（如GC/MS)、放射免疫分析法（R IA)[4]和高效液相色谱（HPLC)法或高效液相色谱/质谱（HPLC-MS)法[5-9]等。

超高效液相色谱（UPLC)法是Waters公司2004年推出的,其原理虽然与HPLC相同,但UPLC提高了分析的速度、灵敏度及分离度,扩大了色谱柱的pH值范围,并已被应用于烟草中烟碱的分析[10-11],但应用UPLC法分析头发中的烟碱和可替宁少见报道。

因此,进行了UPLC法测定主动吸烟人群和被动吸烟人群头发中的烟碱和可替宁试验,旨在为头发中烟碱和可替宁的快速分析提供参考。

1 材料和方法
1.1 材料和仪器
乙腈（色谱纯,D IMA公司);可替宁（纯度98%)、烟碱（纯度99%)（Sigma公司);乙酸（AR,汕头市达濠精细化学品公司);氢氧化钠（GR,上海山海工学团实验二厂);乙醇（AR,汕头市达濠精细化学品公司);二氯甲烷（AR,国药集团化学试剂有限公司);二次蒸馏水（使用前经0.22μm水系滤膜过滤)。

WatersACQU ITYUPLCT M超高效色谱仪（Waters公司),配备真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、恒温柱箱、TUV检测器和色谱工作站;氮吹仪（Cliper公司);SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海仪先仪器有限公司);AE240电子分析天平（感量0.0001 g,Mettler公司);Branson3510超声波发生仪（Branson公司)。

1.2 样品的处理[6]与分析[7]
准确称取0.5 g头发样品,置于50 mL平底烧瓶中,依次用双重蒸馏水、二氯甲烷洗涤,然后加入10 mL 5%NaOH水溶液,50℃下超声萃取45 min。

冷却至室温,用3 mL×2二氯甲烷萃取,合并萃取液,35℃下用氮气吹扫至近干,用0.5%NaOH溶液和乙醇混合液（体积比1∶10)溶解并定容至1.00 mL,溶液用0.22μm微孔滤膜过滤,滤液进行UPLC测定。

采用与标样对比保留时间定性,外标法定量。

分析条件为: 色谱柱:BEH-C18（2.1 mm×50 mm,1.7μm)柱;流动相A:乙腈;流动相B:0.5%醋酸钠水溶液;流速:0.6 mL/min;梯度洗脱:10%A+90%B（0～3 min)、
12.5%A+87.5%B（4～5 min)、10%A+90%B（≥6 min);柱温:35℃;进样量:1μL;检测波长:260 nm。

2 结果与讨论
2.1 工作曲线与检测限
准确称取可替宁、烟碱各0.0200 g,用5%NaOH水溶液和无水乙醇的混合液（体积比1∶10)溶解并定容至100 mL,摇匀,得浓度为200μg/mL标准贮备溶液。

准确移取0.5、1.0、2.5、5、10、20 mL标准贮备溶液,分别置于100 mL容量瓶中,用5%NaOH水溶液和无水乙醇混合液稀释、定容,得1、2、5、10、20、40μg/mL
标准溶液。

分别对烟碱和可替宁标准溶液进行UPLC分析,并对其TUV响应与其浓度进行线性回归分析,得烟碱和可替宁的工作曲线回归方程和相关系数（表1)。

2.2 回收率和重复性
在已知烟碱和可替宁含量（5次平行测定结果的平均值)的头发样品中各加入5、10、20μg标样,分别进行萃取和UPLC分析,并根据测定量、加入量和原含量计算回收率。

结果（表2)显示,2种生物碱回收率均在98.5%～101.6%之间,表明本方法比较准确。

采用本方法平行5次测定一个主动吸烟者的5个头发样品中的烟碱和可替宁,测得烟碱和可替宁的RSD分别为3.52%和2.99%,表明本方法具有很好的重复性,适合头发中这2种成分的分析。

2.3 部分主动和被动吸烟者头发样品中的烟碱和可替宁含量
分析结果（图1和表3)表明:①所测的主动和被动吸烟者头发样品中均检出烟碱。

其中,10位被动吸烟者头发样品中的烟碱含量比较接近,且约与4～5年吸烟年龄（烟龄)的主动吸烟者相当。

主动吸烟者头发样品中的烟碱含量有随其烟龄和日均吸烟支数的增大而增大的趋势;②被动吸烟者头发样品中均未检出可替宁,这与文献[13]报道一致,而所测的主动吸烟者头发样品中均检出,且含量也有随其烟龄和日均吸烟支数的增大而增大的趋势,但都比其烟碱含量低,约是烟碱含量的1/2;③为了深入地了解生理年龄、吸烟年龄和日均吸烟支数与主动吸烟者头发样品中烟碱和可替宁含量的关系,采用SPSS15.0软件中Linear Regression法对表3中主动吸烟者头发中烟碱和可替宁含量检测数据进行线性回归处理,结果见表4。

由表4可知:①主动吸烟者头发中的烟碱含量的高低主要是由其吸烟年龄和日平均吸烟支数决定的,而与其生理年龄关系较小。

其中,日平均吸烟支数对主动吸烟者头发中的烟碱含量影响最大。

因此,烟龄越长,日均吸烟支数越多,头发中的烟碱含量越高,而生理年龄能够影响吸烟者头发中的烟碱含量,可能是由于人在生活中总会暴露在卷烟烟气环境
中,从而随着生理年龄的增加,头发中的烟碱含量也会随之增加;②主动吸烟者头发中的可替宁含量高低主要是由其烟龄决定的,而与其日均吸烟支数和生理年龄关系较小。

这是由于吸烟者头发中的可替宁是由其吸收的烟碱代谢而来,故短时间日均吸烟支数和生理年龄的增加对吸烟者头发中的可替宁含量影响较小。

日均吸烟支数和生理年龄的增加之所以会对吸烟者头发中的可替宁含量产生影响,主要是由于二者的增加会导致吸烟者头发中烟碱含量的增加,因此,日均吸烟支数、生理年龄的增加会使吸烟者头发中的可替宁含量增大。

表1 头发中烟碱和可替宁的回归方程、相关系数检测限①注:①按CL=Ksbl/S[12]计算。

式中:CL——检测限;sbl——空白测量的相对偏差;S——校正曲线斜
率;K=3;3sbl——90%的置信度。

可替宁0.6621y=1740x+24500.999817.23烟碱3.2013y=1610x+8.760.999918.61
表2 头发中烟碱和可替宁的回收率（%)0 2.85—10.02—7.7799.014.7998.5 1013.02101.320.35101.6 2023.05100.930.23100.7 5
图1 主动吸烟者头发样品、被动吸烟者头发样品和标准样品UPLC
表3 部分主动吸烟者和被动吸烟者头发样品中的烟碱和可替宁含量（μg/g)女22553.2368.373男23553.2278.360女24663.58410.562男24683.71410.679 256103.92610.726 257104.25110.908女258154.86211.230
267104.36610.883男278154.84811.254 288104.65811.152
28784.37510.840 298154.87311.236女298104.65311.140女
4315256.64212.509男4517207.06112.706 4818207.46512.849男20---
6.561女21---6.710 22---6.834被动吸烟者男23---6.857 25---6.924女25---6.953男31---6.964 36---
7.375女35---7.158 40---7.542
3 结论
①采用5%NaOH水溶液超声萃取-UPLC法测定头发中的烟碱和可替宁,操作简便,
准确性高,重复性好;②主动吸烟者和被动吸烟者头发样品中均检测到烟碱;而可替宁仅在主动吸烟者头发中检出;③主动吸烟者头发中的烟碱含量的高低主要是由其烟龄和日平均吸烟支数决定的,而与其生理年龄关系较小;④主动吸烟者头发中的可替宁含量高低主要是由主动吸烟者的烟龄决定的,而与日平均吸烟支数和生理年龄关系较小。

可以通过头发中可替宁的有无区分主动吸烟者和被动吸烟者。

表4 生理年龄、吸烟年龄、日平均吸烟支数对主动吸烟者头发中烟碱和可替宁含量的影响烟碱常数3.5851.674—生理年龄0.0890.1330.245吸烟年龄
0.2210.3230.280日均吸烟支数0.1600.1040.354可替宁常数1.4870.233—生理年龄0.0080.0180.048吸烟年龄0.2590.0450.707日均吸烟支数
0.0520.0140.250
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