免疫荧光检测Reg-与PML的定位

免疫荧光
检测Reg-γ与PML的定位为例
1. 实验目的：通过免疫荧光检测Reg-γ与PML是否存在共定位
2. 实验原理：细胞内的蛋白可通过特异性的抗体识别，带有荧光基团的二抗识
别一抗从而放大信号，用特定的激发波长激发荧光基团可观察被检蛋白在细胞内的定位或者表达情况。

不同种属来源的不同抗体可识别两个（理论上可多个）抗体，再用相应的带有不同荧光基团的二抗去识别各自的一抗，可观察到两个蛋白之间的定位情况。

3. 实验过程：
（1）各实验组取20000～30000个细胞，用1640补齐各组的体积于100-200μl，1000rpm，5min甩片，用铅笔标记各处理组。

（2）稍晾干细胞，用阻水笔画圈，圈中滴满预冷的4％的多聚甲醛，室温固定10min。

（3）预冷的PBS洗去多聚甲醛，将载玻片浸没于甲醇中，室温透化10min。

（4）预冷的PBS洗去甲醇，将载玻片放入湿盒中，2％的BSA室温封闭2h。

（5）吸去BSA，加入配制于2％的BSA中的一抗，50μl/片，放入湿盒，冷库过夜或者室温2h。

（6）吸去一抗，PBS洗3次，每次5min
（7）加入配制于2％的BSA中的二抗，50μl/片，放入湿盒，避光。

室温孵育2h。

（8）吸去一抗，PBS洗3次，每次5min，注意避光。

（9）吸去PBS，DAPI室温染色3～5min。

（10）PBS吸去游离的DAPI，加入抗淬灭剂，10μl/片，指甲油封片。

（11）湿盒避光冷藏或者镜检。

4. 实验实例及注意事项：
（1）整个过程中注意保持载玻片在一个潮湿的环境中，不能让细胞区域太干燥。

（2）从加入荧光基团开始应注意避光，一抗如带有荧光基团应从加入一抗后避光。

检测活细胞状态下标记的荧光物质应从一开始进行避光。

（3）注意二抗的种属来源，二抗之间不可有反应，否则无法判断二者之间的共定位。

（4）不宜过长时间冷场片子，做完后尽早镜检。

（5）镜检时不宜长时间对一块区域长时间激发。

（6）共聚焦显微镜观察时不一定要用指甲油封片（指甲油掉在共聚焦的镜头上老师会不高兴），应加入抗淬灭剂后，改上盖玻片后及时去拍片。

（7）Reg- 与PML的共定位
5. 实验相关试剂的配制：
（1）实验中的buffer为普通的PBS，PH7.4,实验前可在冰箱预冷。

（2）一抗配制时可根据看体的效价调整，一般是1：50～1：200，实验中的PML（Santa Cruz）、Reg- （华师大李晓涛）均为1：100。

二抗（国产，康陈生物，mouse-Rho, rabbit-Fitc），抗淬灭剂（Vector, Laboratories, Inc, CA），DAPI（Sigma）, 多聚甲醛（鼎国），甲醇（国药）。

6. 附录：
（1）用贴壁细胞实验时，可在接种时放入灭菌的盖玻片进行爬片，处理结束后取出盖玻片，在盖玻片的周边用阻水笔画圈，后续实验条件和方法一致。

（2）具体情况具体分析，可根据自己的实验需要和经验进行调整。