运动对ApoE基因敲除鼠动脉粥样硬化形成的干预作用及机制

运动对ApoE基因敲除鼠动脉粥样硬化形成的干预作用及机
制
袁凌燕;陆爱云
【摘要】探讨运动对动脉粥样硬化形成的延缓作用及抗氧化作用途径、脂代谢途径,以ApoE建立动脉粥样硬化(AS)模型,观察有氧运动对ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积、血脂、血氧化低密度脂蛋白、肝MDA、肝SOD的影响.结果:ApoE-/-小鼠形成明显斑块,存在氧化水平的升高和血脂紊乱,运动可使斑块面积减少,使ApoE-/-小鼠血oxldl、肝MDA降低,肝SOD升高,但运动没有影响ApoE-/-小鼠的血脂水平,且运动均不影响正常状态,即C57小鼠的脂代谢和氧化水平.结论:运动可通过调节机体的氧化抗氧化水平,发挥抗动脉粥样硬化的作用,可能独立于降血脂途径.【期刊名称】《上海体育学院学报》
【年(卷),期】2006(030)005
【总页数】6页(P56-61)
【关键词】动脉粥样硬化;运动;ApoE基因敲除小鼠;氧化/抗氧化
【作者】袁凌燕;陆爱云
【作者单位】上海体育学院,运动科学系,上海,200438;上海体育学院,运动科学系,上海,200438
【正文语种】中文
【中图分类】G804.2
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种复杂的多因素疾病，确切的发病机
制至今尚未完全明确。

运动防治AS在运动医学领域虽早已开展，仍有许多争议之处，且运动阻抗AS的机制研究不足。

早期的研究多为运动对脂代谢的影响。

高脂血症被认为是动脉粥样硬化发生和发展的首要危险因素，多数研究认为，运动通过降低血脂而延缓AS。

但也有研究结果不同的报道，尤以ApoE-／-小鼠为研究对
象的研究，甚至有运动使血脂升高的报道。

［1］
随后的研究发现，氧化低密度脂蛋白（oxidizedlow density lipoprotein，oxldl）具有比低密度脂蛋白（LDL）更强的致AS效应。

oxldl实际上充当了活性氧损伤
载体的角色，诱导内皮表达多种氧化还原敏感基因，介导单核／巨噬细胞的粘附—穿越—摄取—分泌—退化的过程，参与AS形成的多个环节。

有关运动对oxldl 影响的研究多局限于健康者，总体上认为，长期有氧运动增加LDL的抗氧化性，
运动是否影响AS体内oxldl水平，还未见报道。

仅有的一篇报道了耐力运动可有效地抵抗高血脂鼠oxldl水平的升高，［2］提示长期有氧运动对oxldl的影响，
可能是运动发挥抗AS的有效途径，直接证据尚需进一步实验证实。

本研究以ApoE基因敲除小鼠（ApoE-／-小鼠）建立AS模型，通过研究运动对ApoE-／-小鼠主动脉斑块、血脂、血oxldl及肝MDA、肝SOD的影响，从氧化角度探讨运动对AS形成的影响，拟对运动防治AS的机理进行一些探讨。

1.1 动物及分组
8周龄ApoE基因缺陷鼠（22.20±1.00 g），8周龄同源对照鼠C57
（18.47±0.88 g）。

随机分为ApoE-／-安静组（AC组）、ApoE-／-运动组（AE组）、C57安静组（CC组）、C57运动组（CE组），每组15只。

ApoE-
／-饲以“西方膳食”饲料（胆固醇含量0.15%，脂肪含量为21%），C57饲以普通生长繁殖饲料。

动物、饲料均由北京医科大学实验动物部提供，饲养条件为普通条件，环境温度控制在22±0.5℃，湿度为55%左右，光照时间为12 h。

1.2 运动方案
适应性喂养3 d后，采用逐渐递增的运动强度和时间，运动组小鼠试跑3 d（10
m／min，10～30 min）后，进行跑台运动，0°坡度。

依据加拿大学者Fernando等［3］的研究，确定小鼠的有氧运动强度范围，前6周由10 m／min，30 min，逐渐增加至13 m／min，60 min。

后6周开始稳定的运动量（13 m／min，60 min）。

每周5次，共12周。

1.3 指标测定与方法
1.3.1 主动脉粥样硬化斑块面积定量分析
心脏在10%中性福尔马林中固定后解剖镜下定位，OCT包埋，10μm厚冰冻切片，油红“O”染色。

参照Suzuki等［4］的方法，从主动脉瓣尖出现起，隔80μm
取一张，共5张参与斑块面积的评估，利用计算机图像
分析Leica Qwin V3系统对油红“O”染色部位面积和管腔总面积进行估算。

1.3.2 血脂测定
总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）采用酶法；低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、
高密度脂蛋白胆固醇（HDL -C）采用沉淀法。

1.3.3 肝MDA、SOD的测定
肝SOD的测定采用黄嘌呤氧化酶法，肝MDA的测定采用硫代巴比妥酸法。

操作按试剂盒要求进行。

1.3.4 血氧化低密度脂蛋白
采用双抗夹心ELISA法（美国进口分装，Rapid bio lab）。

加入100μl标准品、100μl标本于相应反应板孔中，轻轻混匀30 s，封住板孔，37℃温育60 min；甩尽板内液体，反复洗涤5次；每孔加入100μl 1× Biotin，轻轻混匀30 s，封住板孔，37℃温育60 min；洗板5次，每孔加入100μl 1×HRP，轻轻混匀30 s，封住板孔，37℃温育30 min；洗板5次，每孔加入100μl TMB显色液，轻轻混匀
10 s，封住板孔，37℃温育20 min，每孔加入100μl终止液（stop solution），轻轻混匀30 s，30 min内在450 nm处读OD值。

以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。

根据样品的OD值
可在标准曲线上查出其浓度。

1.4 数据处理及统计分析
采用SPSS11.5建立数据库并分析，结果以x± sd表示，采用独立t检验，P＜
0.05为有显著性差异。

2.1 主动脉斑块面积
正常安静组（CC组）和正常运动组（CE组）无斑块形成（图1A、图1B），ApoE-／-小鼠安静组（AC组）、ApoE-／-小鼠运动组（AE组）在主动脉窦、主动脉区均出现红染斑块，但AE组红染区域比AC组小（图1C／D、图1E／F）。

经图像分析：AE组（16.03%）与AC组（25.96%）比较，明显减小，下降幅度
达34.4%（P＜0.01），说明运动能对抗AS斑块的形成（表1）。

2.2 血脂
和正常安静组（CC组）相比，ApoE-／-小鼠安静组（AC组）TC、LDL-C明显升高（P＜0.01），HDL-C明显降低（P＜0.01），TG升高不明显（P＜0.05）；CC组和CE组血脂4项均无统计学差异；AC和AE组血脂4项均无统计学差异（表2）。

2.3 血oxldl
和正常安静组（CC组）相比，ApoE-／-小鼠安静组（AC组）oxldl升高（P＜0.05）；和AC组相比，ApoE-／-小鼠运动组（AE组）oxldl降低（P＜0.05）；CC组和CE组血oxldl无统计学差异（表3）。

2.4 肝MDA、SOD
和正常安静组（CC组）相比，ApoE-／-小鼠安静组（AC组）肝MDA升高（P
＜0.05），SOD无统计学差异（P＞0.05）；和AC组相比，ApoE-／-小鼠运动
组（AE组）MDA降低（P＜0.05），SOD增加（P＜0.05）；CC组和CE组MDA、SOD均无统计学差异（P＞0.05）（表3）。

3.1 运动对ApoE-／-小鼠斑块的影响
由于主动脉细小，而主动脉窦也是AS斑块的好发部位，因此本实验参照Suzuki
的方法，选用5个平面参与AS斑块面积的评估。

［4］本实验发现，安静组ApoE-／-小鼠的主动脉窦，存在大量的被染成鲜红色脂肪团块，在某些切片中甚
至占据整个血管腔的30%左右。

12周的运动能明显抑制主动脉斑块的形成，红色区域显著缩小。

经图像分析粥样斑块面积表明，运动组面积显著小于安静组，下降了34.4%，表明本实验中，运动延缓了动脉粥样硬化的形成，提供了运动抑制动
脉粥样硬化斑块的直接证据。

有多种研究探讨了运动与动脉粥样硬化的关系。

动物模型研究结果存在较多争议，近年应用广泛的基因敲除鼠（ApoE-／-小鼠）也被应用于运动与AS研究中，运
动对ApoE-／-小鼠AS斑块的影响，研究结果不一致。

［5～7］采用的动物模型和运动方式不同是导致差异的主要原因。

本研究采用的靶强度13 m／min，0°坡度，相当于75%˙VO2max，属于中等强
度的运动，采用这一运动方案，12周时间的运动使8周龄ApoE-／-小鼠AS斑块减少。

资料中得出阴性结果的原因，Niebauer［8］推测原因一为可能研究的是年轻鼠（9周龄），斑块形成少；原因二为12周时间不够长或运动强度不够大到足
以诱导血管内皮保护物质释放（能对抗严重高脂血症800 mg／dl的AS恶化）。

但笔者推测可能和运动强度不合适有关，得出阴性结果的研究采用了大强度运动（22 m／min，8°坡度，相当于85%˙VO2max）。

3.2 运动对ApoE-／-小鼠血脂的影响
本研究结果显示，ApoE-／-小鼠存在血脂代谢紊乱，有着明显升高的TC和LDL，
HDL显著下降，而TG水平无明显改变，这与文献报道的ApoE鼠脂代谢特点完
全一致。

［9］ApoE是血浆脂蛋白的重要组成部分，最主要功能就是作为VLDL
和CM残粒受体的高亲和力配体，从而引起两者被肝脏的摄取、清除。

ApoE的缺失打乱了VLDL-IDL-LDL的正常代谢过程，ApoE功能缺失动物的胆固醇清除包括被动转运途径、ApoAI-SRBI的高密度脂蛋白转运途径和ApoB100-LDLR的低密度脂蛋白转运途径的作用都受到了限制，势必导致富含胆固醇的残粒在血浆中的堆积引起血脂代谢紊乱，而自发形成AS。

运动对血浆脂质、脂蛋白代谢的影响已历经多年的研究。

运动降血脂研究多为正常人群，是运动抗动脉粥样硬化的潜在机制。

对以ApoE-／-小鼠建立的AS模型动物，运动是否也通过同样的途径延缓动脉硬化的发展？本实验发现，ApoE-／-小
鼠运动组和安静组血脂无统计学差异，即运动并不能降低ApoE-／-小鼠血脂，其抗AS作用与血脂水平的变化无关。

其他研究也有过类似的报道，［7～8］偶见运动升高血脂的报道。

［1］
本研究中运动对血脂没产生预计的降脂效果，可能与运动的强度、未控制饮食等因素有关。

对于正常鼠，本研究显示：12周的中等强度运动，对血脂也没产生影响。

有可能本研究采用的运动强度在12周时间不足以使血脂产生变化，如果延长运动时间，有可能增强运动降血脂的效果。

但Niebauer［10］曾报道较大强度（22
m／min×60 min，2次／d，8°坡度），相对短时间（4周）的运动方案，研究
发现运动对血脂无影响，他延长时间至12周，运动仍对血脂无影响。

［8］C57
小鼠和ApoE-／-小鼠两者在遗传结构上已存在差异，因此运动对两者的血脂所起的作用和作用机制可能是不完全相同的。

根据ApoE-／-小鼠的血脂代谢特点和运动过程中脂肪代谢的特点，本研究中运动对ApoE-／-小鼠血脂无影响，还有一种可能原因为：运动时，组织加速脂质动员入血，而ApoE基因缺陷引起血浆脂质残余物清除不利、出路受阻，抵消了运动
降血脂的良性效应。

3.3 运动对ApoE-／-小鼠氧化水平的影响
ApoE缺陷时，运动训练并不能改善其血脂结构，然而这并不能说明运动训练对其心血管功能没有积极影响。

提示运动训练对ApoE-／-小鼠这种特殊模型AS的改
善尚存在血脂以外的其它途径。

研究发现：氧化应激与AS密切相关，氧化应激及此过程中产生的氧化产物如超氧阴离子自由基、羟自由基及脂质过氧化自由基等是AS发生的一个促进因素。

氧化产物与AS的关系及其作用机制研究最多的是oxldl 与AS的关系，是AS发生发展的关键步骤。

［11］oxldl可通过多种途径促进AS 的发生和发展，AS早期，oxldl损伤血管内皮，促进单核细胞、T淋巴细胞在内皮的黏附及向内皮下的迁移及滞留单核细胞，转变成巨噬细胞，通过巨噬细胞上的清道夫受体无反馈性吞噬，oxldl变为泡沫细胞；刺激VSMC细胞穿过内弹力膜迁移至内皮下并增殖，成为纤维斑块和粥样斑块的主要成分；抑制高密度脂蛋白（HDL）的合成并抑制HDL的逆向转运；刺激血小板聚集；影响体内NO的生成，使NO的多种抗氧化作用受到抑制。

本实验中因动物的血量少，检测指标和方法均受一定限制，而且笔者认为，在体内发挥作用的是oxldl。

因此，应用敏感的ELISA法检测血oxldl，同时检测了肝MDA、SOD水平，以此反应机体的氧化／抗氧化水平。

研究发现，与正常组相比，ApoE-／-小鼠肝MDA增加，血oxldl增加，有显著性差异，说明ApoE-／-小鼠在AS形成过程中伴随着机体氧化应激水平的增加，AS状态确实存在LDL的氧化增加。

本研究结果显示，运动可有效抵抗AS状态氧化水平的升高，提高抗氧化酶的活性。

运动对oxld的影响结果和MDA、SOD的结果相似，运动对正常状态的oxldl水
平无影响，可有效抵抗AS状态oxldl水平的升高。

以往研究中多为运动对正常机体oxldl的影响，通过测定LDL体外抗氧化作用。

总体上认为，长期有氧运动增
加LDL的抗氧化性，对体内oxldl水平影响的研究大多观察急性运动或运动后即刻的变化，很少涉及长期运动后体内的变化，争议较大。

［12～13］而对高脂状态oxldl水平的研究只有1篇报道，［2］结果显示：耐力运动可有效地抵抗高血脂鼠oxldl水平的升高。

在本研究中，运动使ApoE-／-小鼠oxldl的降低可能与运动调节机体MDA、SOD水平有关。

因有资料显示，增加的抗氧化剂节约LDL中抗氧化剂，［14］保护LDL中的多不饱和脂肪酸免受氧化，从而增加LDL的抗氧化能力。

学者们已普遍认同，长期有氧训练可使体内抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧物酶（（GSH-Px）等活性增加，降低脂质过氧化，运动所致的抗氧化水平的提高，将可能首先抵御ROS、MDA对LDL的修饰，节约LDL内的α-生育酚等抗氧化剂，［14］保护LDL中的多不饱和脂肪酸免受氧化损伤。

本实验中运动对正常状态MDA、SOD不产生影响，对oxldl也无影响，验证了这一理论。

ApoE-／-小鼠主动脉斑块明显，伴有脂代谢紊乱，脂蛋白氧化水平增加。

运动可使ApoE-／-小鼠动脉粥样硬化斑块面积减少，延缓AS的形成。

运动可调节AS异常的氧化状态，使机体氧化水平降低，抗氧化能力增加，运动对血脂没产生预计的降脂效果，提示运动抗动脉粥样硬化与其抗氧化能力有关，独立于降血脂途径。

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