大豆异黄酮分离与精制工艺研究_袁建

120 2002,Vol.23,No.8
食ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ科学
※工 艺 技 术
异黄酮流出量（％）
表 ２ 不 同 有 机 试 剂 对 大 豆 异 黄 酮 的 提 取 率（ ％）
有机相比例 水相比例
二次萃取率 三次萃取率
乙酸乙酯 ４５．８ ５４．２ ７１．２ ８５．４
乙醚 １５．３ ８５．７
正丁醇 ５５．９ ４４．１ ８１．７ ９２．５
２ 结 果 与 讨 论
※工艺技术
食品科学
2002,Vol.23,No.8 119
２．１ 脱脂处理条件与结果分析 本研究结合生产试验的可行性对溶剂法和离心法进行对比
试验，以确定最佳的脱脂工艺条件。 ２．１．１ 溶剂法（石油醚萃取法）
乙醇提取液经浓缩至溶液无乙醇味后，加入等体积的石油 醚，振摇２ｍｉｎ，静置分层，分取下层水相加入等体积的石油醚， 振摇２ｍｉｎ，静置分层后分出水相进行下一步处理。 ２．１．２ 离心法
氯仿 ８．７ ９１．３
苯 ５．３ ９４．７
由表 ２ 显示，以氯仿、苯、乙醚作为萃取剂时萃取效率较 低，且氯仿、苯具有一定的毒性，对生产及产品质量控制有一 定的影响，采用乙酸乙酯、正丁醇提取时，提取效率较高，特 别是正丁醇一次提取效率可达 ５５．９％，二次提取效率达 ８０％以 上，三次萃取效率可达９２．５％，但由于正丁醇沸点较高（１１７℃）， 萃取液不易浓缩，另外蛋白质在正丁醇中溶解度较高，影响着 产品最终的纯度。而乙酸乙酯三次萃取效率也可达 ８５．４％，且 乙酸乙酯的沸点较低，浓缩速度快。因此采用溶剂法时宜采用 乙酸乙酯作为萃取剂。 ２．３．２ 柱层析精制条件试验结果分析
量取一定体积（相当于５００ｇ大豆粕的提取液）的经过脱脂、 脱蛋白质的提取液的稀释溶液，分别注入预先制备好的聚酰胺 柱、大孔树脂柱中进行吸附，以水、不同浓度梯度的乙醇水溶 液洗脱，收集洗脱液分析其中大豆异黄酮含量，绘制洗脱曲线 见图 ３ 和图 ４。
异黄酮流出量（％）
４０ ３５ ３０ ２５ ２０ １１５０ ５ ０
柱层析法对于从植物的粗提物中分离大量的黄酮类化 合物是一种最有效的技术，通常用于黄酮类化合物分离的吸附 剂有：硅胶、硅藻土、氧化镁、氧化铝、纤维素、聚酰胺、分 子筛和离子交换树脂等，目前在黄酮类物质生产过程中广泛应 用的主要有聚酰胺、树脂等吸附剂。
本课题选用聚酰胺、大孔树脂等作为吸附剂进行选择吸附 大豆异黄酮的试验，研究合适的吸附条件和洗脱工艺参数。蛋 白质、可溶性糖（主要为低聚糖如蔗糖、棉籽糖、水苏糖等， 该类低聚糖同时具有较好的生理活性，回收后可生产大豆低聚 糖产品）等物质在上述吸附剂上吸附能力较小，而大豆异黄酮 在上述吸附剂中有较强的保留，经水、醇等洗脱剂的分别洗脱， 可除去干扰物质（蛋白、糖等），再经浓缩处理，可得到纯度较 高的大豆异黄酮产品，大孔树脂和聚酰胺在洗脱过程中通过高 浓度的乙醇进行洗脱，吸附剂可得到再生，恢复其吸附能力。
１ 实 验 材 料 与 方 法
１．１ 仪器 Ｗａｔｅｒｓ５１５ 高效液相色谱仪（附 Ｗａｔｅｒｓ２４８７ 紫外检测器，
Ｎｏｖａ－Ｐａｋ Ｃ ３．９× １５０ｍｍ ４μ ｍ色谱柱） １８ Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－２４０１ＰＣ紫外分光光度计；
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦ超滤系统（附ＰＬＣＫ、ＰＬＨＫ等膜堆）； ＴＤＬ－５－Ａ 型离心机； ＢＳＺ－１６０ 型分部收集器； 层析柱（７．５ｃｍ × ５０ｃｍ），湿法装柱，径高比 １：１０。 １．２ 试剂 聚酰胺、大孔树脂、乙醇 １．３ 方法 脂肪含量测定按ＧＢ５５０９．６［ ３ ］ 蛋白质含量测定按ＧＢ５５０９．５［３ ］ 大豆异黄酮含量测定按参考文献［ ４ 、５ ］ 进行 大豆异黄酮的提取按参考文献［７］进行
浸提浓缩液先以 ６ｍｏｌ／ＬＨＣｌ 溶液调至等电点后离心处理， 上清液稀释至原体积的 １ ０ 倍后超滤处理，超滤膜堆型号为 ＰＬＨＫ 型（截留分子量 １０００００）。试验结果见表 １
表 １ 等 电 点 法 －超 滤 法 联 用 脱 蛋 白 效 果 试 验 分 析 结 果
预处 理前 预处 理后
异黄酮含量 （ｍｇ／ｍｌ） ５．８２
将浓缩液置于离心管中，放入离心机在２０００ｒ／ｍｉｎ下离心 ５ｍｉｎ，吸出上层油相及并去除沉淀物（主要为蛋白质及其它微 小颗粒），分取中间水相进行下一步处理。
研究结果表明：溶剂法脱脂时，一次脱脂及二次脱脂所得 的上层（石油醚层）部分浓缩后有较多残渣和残液，经紫外扫 描，大豆异黄酮的特征吸收峰（２６２ｎｍ 左右）较小，对于采用 溶剂萃取法分离精制大豆异黄酮较为有利；浓缩液在２０００ｒ／ｍｉｎ 下离心法脱脂时，上层漂浮层经紫外扫描，大豆异黄酮的特征 吸收峰极低，吸收峰峰形主要表现为大豆油的紫外特征吸收， 同时通过离心处理可去除过滤操作未能去除的微小颗粒及部分 蛋白质，对于减轻分离精制难度、提高大豆异黄酮纯度是非常 有利的。 ２．２ 蛋白质的分离脱除研究
３ 结 论
无花果脯制作过程中，宜采用 ０．５％ ＮａＨＳＯ 和 ０．６％ ＣａＣｌ
３
２
混合溶液护色。硬化处理 ４ｈ，再采用多次煮制的糖煮方法，以
保证产品组织饱满，透明度高，糖液中宜添加０．５％的柠檬酸，
以保证一定量的转化糖存在以防止产品出现返砂现象并且可以 提高产品的风味。
参考文献
１ 杨巨斌．果脯蜜饯加工技术手册．科学出版社，１９８５． ２ 廖小军等．果品加工技术．化学工业出版社，１９９９． ３ 刘宝家等．食品加工技术．工艺和配方大全实集Ｉ．科学技术 文献出版社，１９９３． ４ 无锡轻工业学院．天津轻工业学院合编．食品工艺学（中）． 轻工业出版社，１９８９．
由于大豆中蛋白质含量较高，其中水溶性蛋白占 ８０％ 左 右，在以７０％ 乙醇作为提取剂时，虽然蛋白质发生变性引起其 溶解度显著降低，但在提取液中仍存在大量的蛋白质，含量占 干基重量的 １５％ 左右。提取液中存在的大量蛋白质对浓缩、分 离操作影响较大：浓缩时大量的蛋白质易起泡溢出；直接进行 柱分离精制时，蛋白质的絮凝引起上柱速度慢，并容易引起柱 的吸附性能降低和柱阻塞现象，因此必须对提取液进行脱蛋白 质处理。
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食品科学
※工 艺 技 术
成品形状完整，而且还可以使果实中蛋白质细胞原生质受热凝 固，具有更好的渗透性，更可以破坏果实中的各种酶，有利于 防止褐变，使果脯色泽美观。
同时在糖煮过程中添加不同比例的柠檬酸对无花果脯的风 味和品质影响也较明显，经实验证明，添加 ０．５％的柠檬酸不 但能有效地防止果脯出现返砂现象，还能使成品风味酸甜适 口，受人喜爱。结果见表 ２。
随着大豆异黄酮的功效逐步为人们所认识，大豆异黄酮制 品的开发生产也受到研究者的广泛关注。由于大豆的组分复 杂，而其中大豆异黄酮的含量较低，通过溶剂法等方法所得到 的提取液中存在大量的蛋白质、可溶性碳水化合物，即使采用 脱脂大豆粕作为原料，仍含有一定的油脂。为了获得大豆异黄 酮含量较高的大豆提取物，研究合适的分离精制工艺，分离去 除杂质（包括脂肪、蛋白、糖、盐等）显得尤为必要。
大豆异黄酮分离与精制工艺研究
袁 建 鞠兴荣 南京经济学院食品科学与工程系 南京 ２１０００３
摘 要 本文通过对比试验研究大豆异黄酮制品的分离与精制条件，提出了其工艺路线，即提取液经等电点沉淀、 离心与超滤处理，初步去杂，大孔树脂吸附，水洗，５０％～７０％ 乙醇洗脱大豆异黄酮，减压浓缩而制得大豆异黄 酮制品，制品最终纯度大于 ６５％。采用梯度洗脱可得到更高纯度的大豆异黄酮。 关 键 词 大豆异黄酮 分离 精制 Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ． Ｆａｔ， ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｉｍｐｕｒｉｔｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃｌｅａｎｅｄ ｅｌｅｍｅｎｔａｒｉｌｙ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ， ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｔｉｏｎ ａｔ ２０００ｒｐｍ ａｎｄ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ （ＰＬＨＫ １０００００）． Ｔｈｅ ｉｍｐｕｒｉｔｙ ｓｕｃｈ ａｓ ｓｕｇａｒｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｅｌｕｔｅｄ ｂｙ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒｅｓｉｎ ｃｏｌｕｍｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｅｌｕｔｅｄ ｂｙ ５０％￣７０％ ｅｔｈａｎｏｌ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ８５％， ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｄｅｇｒｅｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｅ ｗａｓ ｏｖｅｒ ６５％． Ｋ ｅ ｙ ｗ ｏ ｒ ｄ ｓ Ｓｏｙｂｅａｎ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
上柱 ０
０ ０ ２０ ２０ ２０ ５０ ５０ ５０ ７０ ７０ ７０ ９５ 层析操作（乙醇浓度 ％）
图 ３ 大 豆 异 黄 酮 在 聚 酰 胺 柱 上 的 流 出 曲 线 图
４０ ３５ ３０ ２５ ２０ １１５０ ５ ０
上柱 ０ ０ ０ ２０ ２０ ２０ ５０ ５０ ５０ ７０ ７０ ７０ ９５ 层析操作（乙醇浓度 ％）
目前脱蛋白质的方面主要有：盐析沉淀法、等电点法、有 机溶液沉淀法、重金属沉淀法、超滤法等。 ２．２．１ 不同预处理方法对比试验
本课题分别应用乙醇沉淀法、等电点沉淀法及超滤法进行 提取液的预处理研究，测定处理后提取液中的蛋白质和大豆异 黄酮含量，其结果如图 ２ 所示。
图 ２ 结果显示，乙醇沉淀法去除蛋白效率较低，进一步分 离精制时，往往还需进行脱醇处理过程，增加了操作步骤和生 产成本；超滤法脱蛋白效率较高，大豆异黄酮的损失也较小， 等电点沉淀法去蛋白质能力中等，因此在生产过程中，采用等 电点沉淀法及超滤法脱蛋白质处理是可行的。 ２．２．２ 等电点结合超滤法脱蛋白试验