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权利要求书

1.一株γ-聚谷氨酸产生菌，其特征在于：所述γ-聚谷氨酸产生菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），保藏号为CGMCC NO.9169。

2..如权利要求1所述的一株γ-聚谷氨酸产生菌的发酵产物在土壤保水中的应用。

说明书

一株γ-聚谷氨酸产生菌及其发酵产物的应用

技术领域

本发明属于微生物和发酵技术领域，具体涉及一种γ-聚谷氨酸产生菌及其发酵产物在土壤保水中的应用。

背景技术

农业生产中常存在土壤因保水性差而引起作物缺水，造成减产甚至绝收，因此农业保水对农业生产尤其重要。目前有一些聚丙烯酸系列吸水树脂材料应用于农业保水，但存在成本高、降解慢、对环境不友好等问题。因此具有无残留、不污染环境、绿色环保性能的新型保水剂成为当前研究的热点。由于γ-聚谷氨酸具有水溶性好、保湿性佳、可生物降解等特性，因此在农业上极具应用潜力。

γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，简称γ-PGA)是一种可由多种微生物发酵产生的氨基酸聚合物。目前研究较多的γ-PGA产生菌有Bacillus Subtilis IFO3335、

Bacillus Subtilis TAM-4、Bacillus Licheniformis WBL-3及Bacillus SP.B53等。在发酵产物保水性方面有研究表明γ-PGA的最大自然吸水倍数可达到1108.4倍，高于聚丙烯酸盐类吸水树脂1倍以上，张新民等制备γ-PGA高吸水树脂最高吸水率可达1600 g/g。前人研究多侧重于γ-PGA产生菌的选育鉴定、培养条件或发酵产物的鉴定及其保水性中的单一方面，而围绕一株γ-PGA产生菌的选育鉴定并开展培养条件及其发酵产物在土壤保水性等方面的综合性研究报道甚少。

发明内容

本发明的目的是提供一株γ-PGA产生菌及其发酵产物在土壤保水中的应用，具有较好的保水效果。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种γ-聚谷氨酸产生菌Dou-6，分类命名：地衣芽孢杆菌，拉丁文学名：Bacillus licheniformis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号，保藏日期：2014年05月16日，保藏号为CGMCC NO.9169。

所述的γ-聚谷氨酸产生菌的发酵产物在土壤保水中的应用。

本发明的有益效果：本发明的γ-聚谷氨酸产生菌的出发菌株

Bacillus licheniformis Dou-6所用发酵底物中谷氨酸钠添加量仅为30g/L，在没有进一步发酵培养基及发酵条件优化的条件下，底物中谷氨酸转化率达到60%以上，本发明获得的γ-PGA合成菌株合成效率较高，且该菌株的产量随着传代产量递增加了98.7%，还有进一步增加的可能，有研究通过射线诱变合成菌株后经一定程度的培养基优化，其产能提升了70%以上，因此通过菌株改造或发酵条件优化预期将获得更高的产量；菌株发酵液直接用做土壤保水剂，且表现较好的保水效果，通过直接稀释菌株

Bacillus licheniformis Dou-6的发酵液对土壤的保水效果，表明2倍和5倍稀释液均显

著起到保水效果，二者达到差异显著水平, 在播种、拌种、移苗时经过γ-PGA保水剂拌种、蘸根处理，就能大大提升其成活率，有广阔的应用前景。

附图说明

图1为菌株D3、D4和D6发酵水解物10倍稀释液纸层析（2、4、6、8、10、20分别指2、4、6、8、10、20mg/L谷氨酸标准品）。

图2为标准谷氨酸色谱图。

图3为Dou-6发酵产物液相色谱图。

图4为Dou-6菌株形态图。

图5为Dou-6菌株染色镜检图。

图6为不同培养基中菌株Dou-6的生长曲线。

图7为传代培养对Dou-6菌株聚谷氨酸合成产量的影响。

图8为Dou-6菌株基于16S rDNA序列的系统发育树。

图9为Dou-6菌株的发酵产物不同处理的土壤保水效果。

具体实施方式

一种γ-聚谷氨酸产生菌Dou-6，分类命名：地衣芽孢杆菌，拉丁文学名：

Bacillus licheniformis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号，保藏日期：2014年05月16日，保藏号为CGMCC NO.9169。

γ-聚谷氨酸产生菌的选育方法，步骤如下：

（1）将2g取自河南省通许县玉皇庙乡申店村的豆酱样品研碎悬浮在无菌蒸馏水中震荡均匀，煮沸15 min，冷却后梯度稀释，并涂布于筛选培养基中，37℃下培养24 h，得到菌落，筛选培养基为LB固体培养基（g/L）的组成为: 葡萄糖10，蛋白胨10，NaCl 5.0，琼脂20，pH=7.0；

（2）挑选形态各异、生长旺盛、表面光滑且粘稠的菌落8株，相同的培养条件下，将这几株菌进行反复划线培养三次以上，以获得纯菌株；

（3）将纯化后的菌株接种到含50ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中，在恒温摇床上培养60 h，恒温摇床的温度为37℃，转速200 r/min，发酵培养基（g/L）的组成为：柠檬酸12，甘油 80，NH4Cl 7.0，谷氨酸钠 30，K2HPO4。3H2O 0.5，FeCl3.6H2O 0.05，CaCl2.2H2O 0.15，MgSO4.7H2O 0.5，MnSO4.H2O 0.1，pH=7.0；

（4）选择粘稠度较高的第2、第6和第7号菌的发酵液于8000 r/min离心10 min，上清液用4倍乙醇沉淀过夜，再于8000 r/min离心l0 min 将沉淀物溶于去离子水中，并透析过夜，将透析液冻干称重，得到γ-PGA的含量，量取纯化好的γ-PGA溶液10 mL，放入水解管，加入10 mL 6 mol/L的HCl，抽真空封口，120℃水解24 h，获得γ-PGA水解产物；

（5）用谷氨酸标准品做对照，通过纸层析法检测水解产物中的氨基酸迁移特征，根据各菌株发酵液粘稠度及纸层析结果如图1所示，从图谱上可以看出谷氨酸标准品2、4、8、10、20mg/L与其它三种菌株发酵产物的稀释液基本上处于同一位置，且均只有一个斑点，初步认为3株菌株发酵水解产物是谷氨酸，其中，以菌株Dou-6斑点最亮，结合其发酵液粘稠度，初步判断其γ-PGA合成能力最强，选择第6号菌作为出发菌株，命名为Dou-6。将Dou-6发酵水解进行液相色谱分析测定，从图2和图3得知，发酵产物的峰和谷氨酸标准品的峰图保留时间一致，判定其产物为聚谷氨酸。