实验-肠道致病菌的分离鉴定

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肠道杆菌的分离鉴定

300
≤13
14~16
≥17
≤28
－
≥29
≤12
13~14
≥15Байду номын сангаас
≤12
13~14
≥15
≤11
12~14
≥15
≤13
14~22
≥23
≤15
16~20
≥21
≤12
13~16
≥17
七、肠道杆菌血清学鉴定
原理：细菌作为颗粒性抗原在相应抗体作用下可形成肉眼可见的凝集颗粒。
可疑菌落 -阴性
可疑菌落 +阳性
标本
SS培养基
②
①
P
N ③
Name time 小辫法
④ 分区划线法
注意：每划完一个区进行下一区之前取菌环要灭菌
粪便标本接种：标本：1）病人粪便（阳性标本）； 2）正常人粪便（阴性）培养基：SS平板操作：将SS平板上分两个区，分别接种病人和正常人标本。要求：使用正确的画线方法，必须培养出单个菌落以备后续实
氨苄西林
AM
ATCC25922 金黄色葡萄球菌
10
ATCC25923
大肠埃希氏菌
庆大霉素
GM
ATCC25922 金黄色葡萄球菌
10
ATCC25923
链霉素
S
大肠埃希氏菌 ATCC25922
10
金黄色葡萄球菌
红霉素
E
ATCC25923 肺炎链球菌
15
ATCC49619
磺胺甲基异噁唑
SMX
金黄色葡萄球菌 ATCC25923
葡磷胨水（绿色盖） E.a
葡磷胨水（绿色盖） E.coli

标本中未知细菌的分离和鉴定

血平板生长现象形态学特征触酶试验甘露醇试验
结论：现象与论点、结论：现象与论点、论据
浓汁标本可疑菌药敏实验结果
药品名称
抑菌圈直径
结论：结论：
咽拭子
分离培养血平板）（血平板）
革兰染色
革兰染色
胆汁溶菌试验奥普托辛试验
荚膜染色石炭酸复红单染）（石炭酸复红单染）
？
粪便标本
SS平板 SS平板
结果观察
1、菌落观察 2、形态学观察
（二）生化反应触酶试验：触酶试验： H2o2
氧化氢酶
H2o + o2
(-) (+)
菌种：可疑菌落菌种：试剂：3%过氧化氢试剂：3%过氧化氢方法：方法：见右图结果：结果：见右图
甘露醇实验
甘露醇生化反应管
药敏实验
浓汁标本可疑菌生长现象及生化反应结果观察
玻片凝集试验
粪便标本可疑菌生长现象及生化、粪便标本可疑菌生长现象及生化、血清反应结果观察
SS平板 SS平板生长现象形态学特征单糖发酵试验血清学试验
葡萄糖乳糖
结论：现象与论点、结论：现象与论点、论据
粪便标本可疑菌药敏实验结果
药品名称
抑菌圈直径
结论：结论：
二、标本中未知肠道感染细菌的分离鉴定程序
脓血便、脓血便、肛拭子
标本 SS平板,EMB平板 SS平板,EMB平板平板选择/ 选择/鉴别培基
克氏双糖铁培养基, 克氏双糖铁培养基, 动力-靛基质动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基
血清学鉴定生化反应
玻片凝集试验
设计性实验
临床标本中病原菌的分离与鉴定
3.尿 3.尿标本：标本：尿液培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、动力-靛基质动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等其他：革兰染液、靛基质试剂、 4.粪便 4.粪便标本：肛门拭子标本：培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、动力-靛基质动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、志贺菌多价血清、玻片等菌多价血清、

实验六微生物生理生化反应观察

2.明胶水解实验：每人接种二支明胶生化管（分别接种大肠杆菌和金黄色葡萄球菌），20℃培养2天，从20℃取出即观察和记录各管的明胶水解情况，得出结论。
3.尿素水解实验：每人接种两支尿素生化管（分别接种变形杆菌和金黄色葡萄球菌），37℃培养2天，观察和记录每管培养前后颜色变化，得出结论。
结果观察
克氏双糖铁
乳糖葡萄糖硫化氢
大肠杆菌 +黄色
黄色
-
+ 伤寒杆菌红黑黄色色色
痢疾杆菌
红色
黄色
-
变形杆菌
红色
黑色
+
生化反应管
尿素 H2S 葡萄糖乳糖
- - ++ +
动力
+
-+ +- +
-- +- + ++ -+
智仙也。名之者/谁？太守/自谓也。太守与客来饮/于此，饮少/辄醉，而/年又最高，故/自号曰/醉翁也。醉翁之意/不在酒，在乎/山水之间也。山水之乐，得之心/而寓之酒也。节奏划分思考“山行/六七里”
生化反应管原理（2）
糖发酵试验，细菌具有多种酶系统能分解糖类，产酸产气。不同的细菌对各种糖类的分解不同，因而可以利用糖发酵进行各种细菌(特别是肠道细菌)的鉴别。
大肠杆菌能发酵乳糖、葡萄糖产酸产气。志贺痢疾杆菌、沙门氏菌、变形杆菌不分解乳糖，
但能分解葡萄糖产酸。宋内氏痢疾杆菌迟缓发酵乳糖产酸，能分解葡萄糖
译文的美感，培养学生的翻译兴趣，但可能会降低译文的准确性。因此，需两种翻译方式都做必要引导。全文直译内容见《我的积累本》。目标导学四：解读文段，把握文本内容1．赏析第一段，说说本文

微生物实验肠道病原菌的分离与鉴定

实验十粪便中病原菌的分离鉴定-2
【目的要求】
1.熟悉粪便中肠道杆菌的分离与鉴定程序。 2.了解肠道杆菌生化反应、免疫学检测原理、结果和意义。 3.掌握肠道杆菌的生物学性状。
粪便标本中致病性肠道杆菌的分离与鉴定程序
粪便标本
涂片，染色，镜检（意义不大）
双糖铁培养基
SS培养基
生化反应： IMViC
药敏试验
伤寒沙门菌
三、肠道杆菌的生物学性状--志贺菌
志贺菌
【实验报告】
记录粪便标本病原菌的分离与鉴定的步骤及结果。
大肠埃希菌
Rod-Shaped Bacterium, E. coli (division) (SEM x22,245) E. coli (0157:H7) a rod prokaryote. Hemorrhagic type
E. coli with fimbriae
三、肠道杆菌的生物学性状--伤寒沙门菌
血清学试验
PCR试验
一、上节课实验结果
1.SS琼脂平板结果及初步推断
结果：平板上有几种菌？
ห้องสมุดไป่ตู้
二、本节课实验内容
1.双糖铁培养基结果观察细菌动力，对葡萄糖和乳糖发酵的情况，是否产生硫化氢？
原始管
反应管
双糖铁培养基结果
菌名大肠埃希菌
葡萄糖（底层）
⊕
痢疾杆菌
+
伤寒沙门菌
+
肖氏沙门菌
⊕
乳糖（斜面）
氨苄西林
氨苄西林
敏感中介耐药 10ug >=17 13--16 <=14
复方新诺明
>=16 9--15 <=10
复方新诺明

实验二肠杆菌科细菌的分离鉴定ⅰ(培养基制备)

熟悉培养基的制备流程
01
掌握培养基的基本成分和作用。
02
熟悉培养基的制备流程，包括称量、溶解、调pH值、灭菌等
步骤。
了解不同培养基的特性和用途，以便选择合适的培养基进行分
03
离鉴定。
了解肠杆菌科细菌的生物学特性
熟悉肠杆菌科细菌的形态、染色、生长特性等基本生物学特性。
了解肠杆菌科细菌的抗原构造和抵抗力。
进行分离和纯化。
肠杆菌科细菌鉴定
总结词
鉴定是确定分离得到的肠杆菌科细菌的种类和属性的过程。
详细描述
在鉴定阶段，可以采用多种方法对细菌进行鉴定。形态学鉴定可根据细菌的形态、染色反应等特征进行初步分类。生理生化鉴定则通过检测细菌对不同底物的代谢反应、酶活性等指标，进一步确定其属、种分类。此外，分子生物学方法如16S rRNA基因测序也为细菌鉴定提供了高分辨率和高准确性的手段。通过综合运用这些方法，可以准确地对肠杆菌科细菌进行鉴定，为后续研究提供基础数据。
04
实验结果与分析
菌落观察与记录
菌落形态
观察并记录不同菌落的形状、大小、颜色、光泽度等特征，以便后续的鉴别和分类。
生长速度
记录不同菌落在培养基上的生长速度，了解其生长特性。
菌落特征
通过显微观察和染色等方法，进一步了解菌落的细胞形态、排列方式等特征。
生化试验结果分析
糖发酵试验
分析不同菌种对糖的发酵能力，了解其代谢特性。
05
注意事项与安全防范措施
实验过程中的注意事项
实验前准备
确保实验室内环境清洁，穿戴实验服和口罩，检查实验器材是否齐全。
培养基制备
按照标准配方准确称量试剂，严格控制培养基的pH值和灭菌时间，确保培养基的质量。

医学微生物学实验

（2）伤寒杆菌

生物学特性: G镜下为杆状,有菌毛，除个别外都有周鞭毛，一般无荚膜，均无芽孢。兼性厌氧，营养要求不高, 不发酵乳糖或者蔗糖，对葡萄糖，麦芽糖，甘露糖发酵，产酸不产气，其他沙门菌产酸产气，可在普通琼脂培养基上生长最适宜温度为37度,最适宜 pH为7.4
菌落特点: 圆形,凸起,无色，细小，半透明,表面光滑, 湿润,直径2-3mm.

紫外线对细菌的影响取一个平皿，用密涂法将细菌涂布于培养皿中，然后按图所示揭开平皿盖，臵于紫外线下照射30分钟，然后盖好盖子，臵37℃培养 24h后取出观察结果。
1.2.2化学消毒剂对细菌的影响
1 促进菌体蛋白质变性或凝固。
2 干扰细菌酶系统和代谢。 3 损伤细菌的细胞膜，影响细菌的化学组成，物理结构和生理活动，从而发挥防腐、消毒至灭菌作用。

方法：（每4个人一组，两支鲎试剂，一支实验一支对照） 1.取两支鲎试剂打开，分别加入0.1ml 鲎试剂溶解水，使之溶解 2.其中一支加入0.1ml内毒素，标记上实验组，另一支加入0.1ml溶解水，作为对照 3.垂直放入37℃温箱，20--30分钟观察结果结果：实验组出现凝固，对照组不出现凝固
⊕
-
痢疾杆菌
伤寒杆菌
-/+
分离培养方法
将粪便标本以分区划线法接种到SS培养基。 (每个实验室8个平板） (接种好后，做好标记，用胶布按班绑好) 放入37℃温箱中培养24小时。取出放4℃冰箱中保存备用。

三、消毒灭菌（2学时）
1. 细菌在Байду номын сангаас然界的分布及理化因素对细菌的影响
2. 高压蒸汽灭菌法

病原生物学实验课2-肠道病原菌的分离与鉴定1ppt-Po

方法
本实验四人一组，每人取6只小试管，排成一列，计四列为一完整试验。分别标明每列管号和诊断菌液如“O”、 “OH”、“PA”、“PB”。按下表先向每管加生理盐水0.5ml，再加10倍稀释病人血清0.5ml于第l管，做顺序的等倍稀释，最后加入等量的诊断菌液，充分混匀，置 37℃ 2~4h，再放室温24小时后观察结果。
E.M.B琼脂培养基的制备
成分
蛋白胨
10g
磷酸氢二钾
2g
琼脂
20g
乳糖溶液(20％)
50ml
伊红溶液(2％)
20ml
美蓝溶液(0.5％) 20ml
蒸馏水磷酸氢二钾加温溶化于蒸馏水中
②校正pH值为7.6加入琼脂
③煮沸溶化过滤后分装三角瓶中，每瓶定量分装
④15磅30min高压灭菌
用途用于分离肠道致病菌，是一种鉴别培养基。并有弱的选择作用。
肥达氏反应
肥达氏反应通常用已知的伤寒杆菌“O”、“H”菌液和甲、乙型副伤寒杆菌“H”菌液与病人血清作定量凝集试验(试管法)，以检测病人血清中有无相应抗体存在，根据抗体含量多少及增长情况用于伤寒、副伤寒病的辅助诊断。
材料 ①待检可疑伤寒病人血清(1:10稀释) ②诊断菌液：伤寒杆菌“O” (O) 伤寒杆菌“H” (OH) 甲型副伤寒杆菌“H” (PA) 乙型副伤寒杆菌“H” (PB) ③生理盐水 ④吸管，小试管等。
谢谢大家！
试管
1
2
3
4
5
6
生理盐水（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
病理血清10X（ml）
0.5↘
0.5↘
0.5↘
0.5↘
0.5↘
0.5→ 弃去

食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定

有鞭毛，有动力，短小杆菌。（二）、培养特征
1、需氧或兼性厌氧，最适温度37℃， PH7.2~7.4。
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
第11页
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
(沙门氏菌（红色）侵入人体细胞第12页
• 2、对营养要求不高，在普通培养基生长良好，37 ℃，24h，能形成菌落中等大小，直径2～3mm，圆形或卵形，表面光滑湿润，无色半透明，边缘整齐菌落
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
第23页
四、微生物检验
（一）、基本步骤（程序定→汇报
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
第24页
• 1、前增菌：用无选择性培养基使处于濒死状态M恢复活力;
• 2、选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，基它细菌变到抑制;
BS上菌落
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
SS上菌落
第28页
3、五项生化试验
H2S、靛基质、 PH7.2尿素酶、KCN 、赖氨酸脱羧酶
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
第29页
（1）三糖铁培养培养
经典沙门氏菌在三糖铁培养上特征：表面（-）粉红色、底层（+）黄色、 H2S （+）底层有黑色、有动
• 3、在液体培养基中，呈均匀混浊性生长，无菌膜。
食品质量检测技术肠道致病菌的检验与鉴定
第13页
• （三）、生化特征
• 1、发酵GLU，甘露醇，山梨醇产酸产气（伤寒鸡伤寒沙门氏菌少数不产气）
• 2、不发酵乳糖，蔗糖，侧金黄花醇
• 3、多数产生H2S（+），不产靛基质（-），不分解尿素（-），不产生乙酰甲基甲醇（ V—P）（-），
• 3、选择性平板分离培养：分离出所需细菌;

肠道致病菌的分离与鉴定

肠道致病菌的分离与鉴定一、实验目的(1)掌握肠道致病菌的分离、鉴定的主要步骤(2)掌握平板划线分离法(3)掌握玻片凝集试验的操作方法以及实际意义二、实验材料(1)实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、(2)实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基(EMB、克氏双糖铁培养基(KIA)、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基三、实验流程(1)肠道致病菌的分离①待测标本的制作：把接种环放置于点燃的酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌的接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水的试管中，混匀。

②细菌的分离接种：用接种环取适量配置好的细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMBt养基。

将培养基置于37C培养18~24小时。

(2)肠道致病菌的纯化①单菌落接种：从已培养待测细菌的EMB培养基上用已灭菌的接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37 C培养18~24小时。

②待测细菌的初步判断：取出已纯化培养待测细菌的KIA培养基，观察现象，初步断定该细菌是致病菌或是非致病菌。

（3）肠道致病菌的鉴定①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管内的小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌的接种针取已培养的KIA 培养基上的培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37 C培养18~24小时。

取出并观察记录现象。

（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌）②动力检查：用已灭菌的接种针取KIA培养基上的培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37 C 培养18~24小时。

取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基中，并观察记录现象。

（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌）③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌的接种环分别取KIA培养基上的培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。

常见肠道致病菌的分离与鉴定

6.副溶血弧菌
将粪便标本接种于弧菌增菌液中，6~8小时接种 TCBS平板，同时接种TCBS平板，35°C培养18~24 小时，检查有无呈绿色或蓝色中心，圆形，直径 2~3mm的菌落，挑取可疑菌落接种克氏双糖铁和尿素动力靛基质培养基进行初步生化鉴定，最后采用商品化鉴定系统鉴定至种。
7.艰难梭菌
二、培养与鉴定
医院中引起的腹泻一般不会是感染了食源性病原菌引起，故对于住院超过3天的患者的粪便标本不进行常规培养，除非是为了分离艰难梭菌和测定毒素以诊断抗生素相关性腹泻。
1．沙门、志贺菌属菌培养
黏液、脓血便接种于SS琼脂平板或XLD琼脂平板和麦康凯（MAC）琼脂平板（或中国蓝琼脂平板）以及血平板， 35℃孵育18～24小时，挑取不发酵乳糖菌落，至三糖铁琼脂初步观察生化反应并进行血清学凝集试验。可根据生化反应结果初步判断细菌菌属，再根据血清学鉴定结果鉴定至种
不染色标本
1．霍乱弧菌感染标本呈米泔样或洗肉水样，镜检发现逗点状或弯曲状的弧菌，呈流星样穿梭，运动活泼。加入O1群或O139群霍乱弧菌多价诊断血清，大于80%的细菌停止运动或运动明显减弱 2．弯曲菌感染呈S形、螺旋形并快速、拧塞样或投镖样运动的细菌 3．酵母样真菌感染高倍镜发现光亮的卵圆形孢子或假菌丝
标本的运送
1．标本采集后应尽快送检室温保存≤2小时 2．特殊细菌艰难梭菌培养标本在4℃环境≤ 24小
时；弯曲菌与弧菌的标本需加入CaCl2(100mg/L) 3．置于运送培养基中的直肠拭子保存时间室温≤
24小时
标本验收
检查申请单信息填写是否完整、正确，包括标本采集时间、采集方式、抗生素使用情况、标本量是否足够、标本容器有无渗漏等
标本拒收
1．粪便标本放置时间超过2小时 2．成形粪便或粪便标本混有尿液 3．粪便标本量过少、干涸或保存不当 4．直肠拭子未置于运送培养基中应及时与临床医师联系，说明原因，要求重新留取标本送检

洱海下游肠道致病菌噬菌体分离与鉴定

噬菌斑在双层琼脂平板为７４，形状不规则，明ｔ＂ｔ、ｔ透状空斑。本研究在洱海水样中分离出了伤寒杆菌噬菌体、乙型副伤寒杆菌噬菌体、痢疾杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体。提示洱海下游水体中有相应病原体存在。
Ｇｍｌａａａｙ两位细菌学家发现并命名 ’噬菌体在自ｅ４。
然界分布极广，凡是有上述微生物的地方，有相应都
［］苏胜兵，５马红霞，徐凤宇．菌体在细菌性疾病诊断和治噬
的噬菌体存在Ｉ。５噬菌体在数量上～般是细菌的１）０
倍左右，被认为是地球上数量最多的病毒类型６。Ｊ
ＩｏａｉｎａｄＩｅｔｃｔｎｏａｔｒｏｈｇｓＳｅｉｃｔｎｅｔｎｌｔｏｅｈａｅｆＤｏｓｒａｏｈｉＬａｅｓｌｔｏｎｄｎｉａｉｆＢｃｅｉｐａｅｐｃｆｏＩｔｓｉａｈｇｎｉｔｅＷｔｒｏｗｎｔｅｍｆＥｒａｋｉｆｏｉＰａｎ
疗中的应用［］中国兽医科学，０１４（）５６５０Ｊ．２１，１５：４ — ５．［］Ｗｅｎａｅ．ｃｌｙｏｒｋｒｏｃｖｕｅ［）Ｆｒｓ６ｉｂｕｒＧＥｏｇｆｏａｙｔｉｓｓＪ．ｅＭｏｐｉｒｎ
Ｍｉｒｂｏｏｖｅ，０４，８２）１７８．ｃｏｉｌｇＲｅｉｗｓ２０２（：２－１１ｙ
３讨论
噬菌体（ａｔｒｐａｅｐａｅ是一类感染细菌、ｂｃｉｈｇ，ｈｇ）ｅｏ

微生物肠杆菌科综合实验报告

肠道杆菌实验论文班级：检验一班实验日期：2013-09-24~30 实验组：第二组指导老师：综合实验报告专业班级：医学检验时间：2013年 9月 24日～9月30日实验名称肠道杆菌指导教师熊亚南一、预习报告1. 实验目的1.1掌握肠道条件致病菌与肠道致病菌的菌落特点。

1.2掌握肠道杆菌的主要生化反应。

1.3掌握肠道杆菌的分离鉴定方法。

1.4掌握粪便标本细菌学检测流程2. 实验基本原理肠道杆菌的细菌为革兰氏阴性菌，大多数有鞭毛，能运动。

少数无鞭毛不能运动，不产生芽孢，需氧或兼性厌氧，在普通培养基上，一般都生长良好，均能发酵葡萄糖产酸或产气，触酶试验阳性，氧化酶试验阴性，还原硝酸盐。

这类细菌是人类和动物肠道中的细菌，有的引起腹泻、肠炎、肠热症和痢疾等。

有的为条件致病菌，有时也可引起身体各个部位的感染。

3. 实验流程图高压灭菌锅试管锥形瓶接种环酒精灯无菌玻片显微镜、载玻片镊子二、实验报告1.材料与方法1.1材料2号菌液双糖铁培养基CB培养基SS培养基基础培养基青霉素庆大霉素氯霉素复方新诺明志贺氏诊断血清沙门氏诊断血清无菌生理盐水、结晶紫染液、卢戈碘液、95%乙醇溶液、稀释石碳酸复红染液、无水乙醇、松柏油1.2方法1.2.1标本分离将菌种用平板划线法，分别接种于CB和SB培养基中，37℃温室培养24小时，进行菌落分离。

操做人：1.2.2 鉴别实验1.2.2.1 双糖铁实验用接种针以无菌操作技术挑取可疑菌落，立即垂直插入培养基中心至接近管底处，再循原路退出到斜面上；接种针自斜面最低处向上划一直线（要求通过试管培养基的中心点），然后再从斜面低处向上轻轻来回作蜿蜒划线；接种完毕，盖好试管塞。

贴上标签纸。

37℃培养18~24小时，取出观察结果并分析，观察结果。

1.2.2.2 Gram stain实验1.2.2.2.1 涂片于洁净无油的载玻片上,加无菌生理盐水一滴,按无菌操作法用接种环取待检标本少许，研入无菌盐水中，使成一个均匀、极薄菌膜，直径在1cm 左右。

肠道致病菌分离与鉴定虚拟仿真实验教学系统建设与实践

基金项目：　安徽省高等学校质量工程项目（２０１５ｘｎｚｘ０３０）作者简介：　王晓楠，女，１９８２－０６生，硕士，实验师，Ｅｍａｉｌ：ａｙｄｗｘｎ＠１２６．ｃｏｍ收稿日期：　２０１８－０５－１０肠道致病菌分离与鉴定虚拟仿真实验教学系统建设与实践王晓楠，李京培，唐媛媛，刘莉茵，杨　晨，李　群△　（安徽医科大学基础医学院病原与免疫学实验室，　合肥　２３００３２；　△通讯作者）摘要：　将微生物学专业实验体系和现代化的虚拟仿真技术相结合，开展虚拟仿真实验教学是信息化教学的必然趋势。

文章分析了微生物学中肠道致病菌传统实验教学的不足，阐述了肠道致病菌分离与鉴定虚拟仿真实验教学系统的建设和教学模式。

系统涵盖肠道感染理论知识、实验操作视频和虚拟临床病例实训，将经典的微生物学实验与临床病例紧密结合。

该系统应用于实践教学后，培养了学生的实验操作技能及科研创新能力，拓宽了以课堂为中心的教学模式，是传统实验的有效补充。

关键词：　微生物学；　实验教学；　虚拟仿真中图分类号：　Ｒ３７　文献标志码：　Ａ　文章编号：　２０９５－１４５０（２０１８）１０－０９０４－０４　ＤＯＩ：１０．１３７５４／ｊ．ｉｓｓｎ２０９５－１４５０．２０１８．１０．３１教育信息化已经成为当今教学改革发展的趋势，以网络为基础的各种学习也逐渐进入国内的各个高校。

虚拟仿真实验利用虚拟现实、多媒体、数据库和网络等技术，可以突破传统实验教学时间、空间以及生物安全问题等实验条件的限制，构建高度仿真的实验环境［１］，通过人机交互及网络通讯等技术模拟实验操作的流程和场景。

微生物学是一门实践性很强的科学，其理论是建立在实验基础之上的，实验操作也是医学生必须学习并加深掌握医学知识的重要途径［２］。

微生物学的实验是技术和经验性质的，往往需要反复操作实践才能收到满意的效果［３］。

虚拟仿真实验在有限的学时、经费内为学生教授普通实验教学无法进行的又十分常用、重要的微生物学实验项目，对于实践操作很强的微生物学的学习将起到越来越重要的作用［４］。

粪便标本中肠道致病菌的的分离鉴定

实验十粪便标本中肠道致病菌的的分离鉴定实验目的和要求1、掌握脓汁标本中常见病原菌分离和鉴定方法2、掌握药物敏感试验3、掌握肠道杆菌分离和鉴定的一般步骤4、熟悉肠道杆菌鉴定生化反应和血清学反应实验内容一、脓汁标本中未知病原菌的分离和鉴定二、粪便标本中肠道致病菌的分离和鉴定一、标本中未知病原性球菌的分离鉴定程序直接涂片染色镜检：观察细菌形态、排列、染色性观察菌落性状、溶血性、色素血琼脂平板涂片、染色、镜检挑取可疑菌落生化反应测定纯培养致病性测定（甘露醇、凝固酶等）标本血液脑脊液肉汤增菌培养涂片染色镜检二、标本中未知肠道感染细菌的分离鉴定程序标本脓血便、肛拭子选择/鉴别培基生化反应血清学鉴定克氏双糖铁培养基,动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基玻片凝集试验SS平板,EMB平板设计性实验临床标本中病原菌的分离与鉴定设计性实验1.脓汁标本：脓拭子培养基：血琼脂平板其他：3%H2O2、（兔血浆）、生理盐水、革兰染液、玻片等2.痰标本：咽拭子培养基：血琼脂平板其他：生理盐水、10%胆盐、革兰染液、玻片等3.尿标本：尿液培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等4.粪便标本：肛门拭子培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、志贺菌多价血清、玻片等脓拭子分离培养革兰染色（血平板）革兰染色触酶实验甘露醇实验方法：•1、分离培养、观察菌落特征：浓汁标本，用分离划线方法接种血平板，37℃培养18-24h以后观察结果。

重点：色素和溶血现象•2、革兰染色、观察形态学特征：取可疑菌落少许涂片，革兰染色、镜检。

结果观察•1、菌落观察•2、形态学观察（二）生化反应•触酶试验：(-) (+)H 2o 2H 2o o 2氧化氢酶+菌种：可疑菌落试剂：3%过氧化氢方法：见右图结果：见右图甘露醇实验•甘露醇生化反应管药敏实验浓汁标本可疑菌生长现象及生化反应结果观察形态学特征血平板生长现象触酶试验甘露醇试验结论：现象与论点、论据浓汁标本可疑菌药敏实验结果药品名称抑菌圈直径结论：咽拭子革兰染色革兰染色胆汁溶菌试验奥普托辛试验荚膜染色（石炭酸复红单染）分离培养（血平板）？粪便标本SS平板克氏双糖铁斜面培养基动力-半固体培养基生化反应管观察结果糖发酵试验玻片凝集试验革兰染色H2S试验尿液离心沉淀1500转，10分钟分离培养（EMB平板）革兰染色革兰染色克氏双糖铁斜面培养基动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基观察结果观察结果观察结果完成靛基质试验方法：•1、分离培养、观察菌落特征：粪便标本，用分离划线方法接种SS平板培养基37℃培养18-24h以后观察结果。

实验肠道致病菌分离鉴定

镜检：球阳杆阴阳紫阴红
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葡萄球菌
链球菌
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（2）触酶实验
原理：产生过氧化氢酶的细菌，能催化过O2
2H2O+O2
操作步骤：
在洁净玻片上滴一滴生理盐水，用接种环取少许细菌培养物与
生理盐水中乳磨均匀，然后加3％过氧化氢数滴；或直接滴加3 ％过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。
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观察上次实验结果、进行分析
紫外线杀菌实验
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抗生素敏感试验
抑菌圈直径
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如果细菌对药物敏感，则在药片周围有抑菌圈形成，敏感度越高抑菌圈直径越大：
>20mm：极度敏感 5-20mm：中度敏感
10-15mm：轻度敏感
<10mm: 不敏感无抑菌圈: 耐药
本次试验以粪便为标本进行肠道菌的分离鉴定。粪便标本中含有伤寒杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌以及大肠杆菌等肠道菌，要求从标本中分离出单一的致病菌，并通过后续的试验鉴定出致病菌。
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S.S琼脂培养基
S.S琼脂培养基中含有胆盐、煌绿和枸橼酸钠等成分，不仅能抑制G+菌的生长，也能抑制肠道非致病菌的生长。
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2）操作：玻片法
▪ 取干净玻片一块
▪ 血浆及生理盐水各一滴，分别置于玻片两端
▪ 用接种环取细菌少许，分别与生理盐水及血浆充分混匀
▪ 结果观察：30秒钟内盐水中的细菌呈均匀浑浊，而兔血浆则呈块状或颗粒状者为阳性。
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（4）甘露醇试验或血清肉汤接种
1）甘露醇发酵试验：

鸡肠道致病菌的分离鉴定试验设计

鸡肠道致病菌的分离鉴定试验设计鸡肠道致病菌种类：大肠杆菌与沙门氏菌实验内容：阶段一：大肠杆菌与沙门氏菌的形态培养特性的观察，实验材料的增菌与直接分离培养。

阶段二：识别菌落、做纯培养及三糖铁琼脂接种阶段三：菌种纯度检查及生化培养基接种阶段四：生化反应结果观察与沙门氏菌血清学诊断。

阶段一：1、材料实验菌种混合菌液甲（大肠杆菌和沙门氏菌），混合菌液乙（产气肠杆菌与普通变形杆菌）观察材料四种细菌的融通培养物、琼脂平板、麦康凯或SS琼脂平板的培养物、三糖铁琼脂培养物。

培养基亚硒酸盐亮绿增菌液或四磺酸钠增菌液；SS琼脂平板、麦康凯、琼脂平板等选择与鉴别培养基。

2、内容与方法培养特性观察对大肠杆菌、沙门氏菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌在常用培养基上的培养特性作仔细观察并相互比较。

形态观察以无菌接种环分别挑取上述四种细菌在麦康凯等琼脂平板上生长的单个菌落。

在玻片上制成涂片，待自然干燥后，以火焰固定，用革兰氏染色法染色，镜检。

观察没在细菌的形态、大小与排列方式，并作比较。

这四种细菌都是革兰氏阴性而两端钝圆的杆菌，无芽孢和荚膜，大小差异不显著。

增菌培养用无菌2ml刻度吸管吸取混合菌液甲2ml，分别加入亚硝酸盐亮绿增菌液100ml 的试管与四磺酸钠增菌液10ml的试管中各1ml。

换另一支无菌吸管，以同样的方法将混合菌液乙接种到两种增菌液中，接种后轻轻摇匀，置37摄氏度恒温箱内培养18---24h。

直接分离培养每种混合菌液用常规划线方法，接种麦康凯琼脂平板和SS琼脂平板各一个。

置37摄氏度恒温箱内培养24h后取出，观察每种平板上两种细菌的生长情况，单个菌落的形态，并比较之。

保留活动单个菌落的平板培养物，待阶段二使用。

阶段二1、材料普通琼脂斜面、三糖铁琼脂等。

2、内容与安排纯培养从经24h培养的麦康凯琼脂平板上，分别选出4种不同的细菌的单个菌落。

然后，用无菌接种环在四个单个菌落的中央表面轻轻取培养物少许，各移植至普通琼脂斜面一管，置37摄氏度恒温箱中培养24后，取出后在冰箱内或室温保存备用。

微生物实验肠道病原菌的分离与鉴定

病例PPT汇报：粪便中肠道病原菌的讨论结果和依据
一、粪便标本致病性肠道杆菌的分离和鉴定程序
二、粪便标本致病性肠道杆菌的分离和鉴定
1.粪便接种SS（ Salmonella Shigella agar ）培养基
粪便四分区划线接种SS琼脂平板，37℃培养18-24小时。
大肠杆菌痢疾杆菌伤寒杆菌
SS平板粉红色大菌落无色细小半透明菌落无色细小半透明菌落
实验九粪便中病原菌的分离鉴定-1
【目的要求】
1.掌握肠道杆菌的生物学性状。 2.熟悉粪便中病原菌的分离鉴定程序。
病例回顾
某患者，女，45岁。于前日参加聚餐，昨日感觉腹部不适，今晨起有发热、腹痛、水样腹泻，至下午就诊已腹泻5次，最后两次量不多，但有黏液样物质带有血色。实验室检测：粪便检查发现有脓细胞5个，红细胞8 个；血液检测WBC14.5×109/L（4-10x109/L）。
2.可疑菌落穿刺接种双糖铁培养基第2天观察SS培养基的培养结果并记录，挑取较小、无色、半
透明的可疑菌落穿刺接种双糖铁培养基，37℃培养18-24小时。第3天取出双糖铁培养基放入冰箱，下次课备用。
原始管
反应管
三、肠道杆菌的生物学性状--大肠埃希菌
大肠埃希菌
Rod-Shaped Bacterium, 45) E. coli (0157:H7) a rod prokaryote. Hemorrhagic type
E. coli with fimbriae
三、肠道杆菌的生物学性状--伤寒沙门菌
伤寒沙门菌
三、肠道杆菌的生物学性状--志贺菌
志贺菌
【实验报告】
记录粪便标本接种SS培养基和双糖铁培养的结果，并对其进行初步判断。

实验-肠道致病菌的分离鉴定

肠道杆菌的分离鉴定

标本中未知细菌的分离和鉴定

实验六 微生物生理生化反应观察

微生物实验 肠道病原菌的分离与鉴定

实验二肠杆菌科细菌的分离鉴定ⅰ(培养基制备)

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