提RNA+逆转录+qRT_PCR步骤模板
qrt-pcr操作流程
qrt-pcr操作流程qRT-PCR操作流程引言qRT-PCR（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction）是一种广泛应用于基因表达研究的技术，通过逆转录将RNA转化为cDNA，再利用聚合酶链反应（PCR）技术进行扩增和检测。
本文将详细介绍qRT-PCR的操作流程。
1. 实验前准备在进行qRT-PCR实验之前，需要准备以下材料和设备：- RNA样本：提取需要研究的组织或细胞中的总RNA。
- 逆转录试剂盒：包括逆转录酶、随机引物、dNTPs等。
- PCR试剂盒：包括聚合酶、引物、dNTPs等。
- qRT-PCR仪器：包括逆转录仪和实时荧光定量PCR仪。
- 实验耗材：包括离心管、PCR管、PCR板等。
2. RNA逆转录a. 将RNA样本与逆转录试剂混合，并在逆转录仪中进行反应。
通常情况下，逆转录反应体系包括RNA样本、逆转录酶、随机引物、dNTPs等。
b. 根据逆转录试剂盒的说明书，设置逆转录反应的温度和时间。
一般来说，逆转录反应的温度范围为42-55°C，反应时间为30-60分钟。
3. cDNA合成a. 将逆转录反应得到的cDNA样品与PCR试剂混合，并在PCR仪器中进行扩增反应。
通常情况下，PCR反应体系包括cDNA样品、聚合酶、引物、dNTPs等。
b. 根据PCR试剂盒的说明书，设置PCR反应的温度和时间。
一般来说，PCR反应包括初始变性步骤（95°C，3-5分钟）、循环扩增步骤（95°C，15-30秒；引物退火温度，30-60秒；72°C，15-30秒）、终止步骤（72°C，5-10分钟）等。
c. 根据所需的扩增产物大小，设置PCR反应的循环次数。
一般来说，循环次数在25-40次之间。
4. 实时荧光定量PCRa. 将PCR反应产物与实时荧光定量PCR试剂混合，并将混合物加入PCR板中。
提RNA反转录的详细流程
SMART 技术制备GS FLX 样品cDNA详细流程第一天一．RNA的提取1.用QiagenRneasy Mini Kit 提取组织总RNA(详见Handbook)：1）在1.5 ml管中加入600ulRLT和6ul B-巯基乙醇2）取10—30mg组织样品放入管中，用剪刀或电动匀浆机破碎，3—5min3）12000rpm/3min,取上清移入新管4）加入1倍体积70%乙醇，轻柔混匀（吸打），不能离心，并立即转入收集柱，10000rpm/30s,弃废液。
(分两次移吸附柱，离心弃废液后，打开盖子让酒精挥发一下再操作)5）加入700ulRW1, 10000rpm/30s,弃废液6）加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液7）加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新收集管，空转12000rpm/1min8）将收集柱移入 1.5mlRnase-free管中，加30—50ulRnase-free water,静置1min,10000rpm/1min..(由于下步用Dnase去除DNA,需用87.5ul RNA溶液，因此用45ul Rnase-free water洗两次)9）定量，跑胶2.用Tiangen Rnase-Free Dnase I 去除DNA 污染1）反应体系：共100ul87.5ul RNA 溶液10ul buffer RDD2.5ul Dnase I储存液（配制：干粉溶于550ul的Rnase-Free ddH20中，分装，-20℃保存）2）20—25℃孕育10min3.用Qiagen Rnwasy Mini Kit 纯化1）100ul除DNA后的RNA+350ulRLT,混匀2）加入250ul无水乙醇，轻柔混匀，不能离心，并立即移入收集柱，10000rpm/30s，弃废液3）加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液4）加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新的收集管，空转1min5) 换1.5ml管，加30—50ulRnase-free water，置1min,10000rpm/1min6）定量，跑胶第二天二．反转录（SMART Kit,详见Manual）1.做逆转录之前对RNA的处理：浓缩RNA1）在所提取的RNA里（大约为10ug），加无水乙醇（2倍体积），醋酸钠（3M. PH=15.2 0.1倍体积）2）-70℃, 酝酿40min或过夜.3）取出溶液，3000g/1min; 换个方向，12000rpm/5min4）弃上清，用70%的乙醇洗两次。
提取组织RNA,反转录,qPCR流程图
一、Total RNA的提取：1.取出样本，放入灭过菌的研钵中，倒入液氮，研磨，整个过程要始终保持有液氮，10min左右，研磨充分后加入1.5ml的EP管，加入1ml Trizol，充分匀浆。
（另一种，加入trizol会冻起来，就一直研磨，直到最后化成液体。
）2.室温静置10min，12000g，4度，5min，上清转移到新的1.5ml的EP管中3.加入1/4体积的氯仿，振荡混匀，室温静置15min，12000g，4度，15min，上清转移至新管；4.加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀，室温静置10min，12000g，4度，10min5.弃上清，留沉淀，加入1ml的75%乙醇清洗沉淀，7500g，4度，5min，弃上清保留沉淀。
重复三次6.弃上清留沉淀，自然风干（5~10min），加入32ul DEPC处理过的水，测OD260/280的值，根据结果调整至1μg/μl=1000ng/μl，立即进行反转录，剩余的RNA标好号存放在-80℃下。
附：1OD260=40μg/ml用样本跑电泳，确定RNA的完整性，注意在这之前把胶配好。
（可无）可见明显的两条带，并且28S是18S亮度的两倍，还有下边一条不太明显的5SRNA的条带。
证明RNA完整无降解。
二、反转录：说明书：10 μl 反应体系可最大使用500 ng 的Total RNA。
20/1μg（以前用的40，下次用20）20ul的体系：先把buffer和RNase Free dH20和enzyme 配成mix 5×PrimeScript Buffer（for Real Time）：4μlPrimeScript RT Enzyme Mix I ：1μlOligo dT Primer（50 μM）：1μlRandom 6 mers（100 μM）：1μl总RNA ：1μl(1μg/μl)RNase Free dH2O ：12μl反转录反应条件如下:37℃15 min （反转录反应）85℃5 sec（反转录酶的失活反应）4℃-20℃分装保存（尽量不要反复冻融，avoid freeze-thaw cycles）三、内参检测β-actin 50µl体系PCR 反应条件:扩增1 kb 的DNA 片段的PCR 反应条件如下：预变性：95℃，3min98℃10 sec.55℃30 sec.（下次60℃，去掉非特异性）72℃30 s（对于80bp的内参来说是不是可以省去）72℃5min.4℃保存电泳：2%琼脂糖凝胶，125V，15min，注意换成20bp的marker，不要加太多。
组织RNA提取与逆转录PCR步骤
组织RNA提取与逆转录PCR步骤RT—PER：1、，取2ulRNA模板，70℃预变性10min2、冰浴5 min3、按顺序加入以下试剂：（20ul体系）25 mmol／L的MgCl2 4ul逆转录缓冲液2ul10 mmol／LdNTP 2ulRNase 0.5ulAMV 15ul随机引物或特异下游引物1ulDEPC水X4、室温下孵育15min5、42℃孵育1 h转录引物可以有三种选择：随机引物、OligodT和目的片断的特异性下游引物.引物的设计为了避免扩增基因组DNA，引物在设计时尽量跨过两个外显子，特别是其下游引物Mg2+浓度优化结果为4．OmmoL／LRNA提取与RT-PCR1.1匀浆1) 每个无菌的2 ml圆底离心管中加入0.75 ml TRIZOL试剂，每个大鼠的腺垂体从-80°C取出后立即于预冷的TRIZOL试剂里用POLYTRON组织匀浆器（瑞士）进行匀浆。
【注：1. 匀浆液的量按每50-100 mg组织加1 ml TRIZOL，样品的体积不能超过匀浆液体积的10%。
2. TRIZOL试剂用前应于4°C保存，操作时应带手套和口罩。
3. 匀浆器头用前需在3% H2O2（DEPCC水配）里浸泡，然后于0.1% DEPC水中空转2次，最后于TRIZOL试剂中空转2次，方可用于匀浆。
4. 匀浆时间不宜太长，转速不宜过大，刚开始时由慢到快至中档处，然后减速，重复1-2次，未见有组织碎块即可．５．如果样品数多的话，可先将TRIZOL试剂一并加好，然后逐一加入样品匀浆。
６.特注：每加完一种试剂，都应及时盖上管盖，夹取管子或者打开管子时，尽可能不要碰到管的内缘。
】。
2) 将匀浆样品置于15-30°C下静置5分钟，以使核酸蛋白复合物完全分离。
如果所提取的组织中含有较多的蛋白、脂肪等，则应在匀浆结束后将匀浆液于4°C，12000 g，离心10分钟，取上清用于以下操作。
RNA提取-逆转录-qPCR
RNA提取、逆转录与qPCRRNA提取一研磨组织1. 用锡箔纸包裹研钵，钵杵放于铁饭盒中，置于烘箱160℃，2h2. 将烘箱温度调至45℃，取出研钵和铁饭盒，关闭烘箱3. 待研钵和钵杵自然冷却后，取出存放于液氮的组织，置于冰上4. 待Trizol溶解后，将组织与Trizol一同加入研钵5. 加入适量液氮研磨至无肉眼可见组织块，加入1mL Trizol6. 取1mL 液体与Ep管（-80℃保存），剩余液体移至冻存管（液氮保存）二提取RNA（Trizol reagent protocol）1 从-80℃冰箱，取出已加入Trizol 的样品，室温放置5min（65℃水浴锅预热，4℃离心机预冷，逆转录试剂4℃解冻oligo dT、dNTP、5XRT buffer）2 加入0.2mL氯仿（三氯甲烷）/1mL Trizol, 迅速盖上盖子3 剧烈震荡15s（可使用涡旋振荡器）（使液体充分混匀）4 室温孵育2-3min（冰上预冷异丙醇、乙醇）5 离心，12000g，15min，4℃6 将离心管倾斜45°，将上清移至新的Ep管（切勿吸起中间的蛋白质）（水相一般为Trizol体积的50%，建议吸取400ul-500ul/1mL Trizol）7 加入500uL 预冷的异丙醇/1mL Trizol，用手上下颠倒Ep管数次，混匀8 室温孵育10min9 离心，12000g，10min，4℃（提取组织RNA时，离心后可见Ep管底部有胶状沉淀）（配制75%乙醇，置于冰上。
）10用枪小心吸走上清，留下沉淀（不要直接倒掉上清，否则容易导致异丙醇残留，260/230偏低）11 加入预冷的1mL 75%乙醇/1mL Trizol12 轻轻弹Ep管管底数次（尽量将沉淀弹起），离心7500g，5min，4℃，用1mL的枪吸走上清（残留一点点上清）13 打开盖子，室温干燥5-10min（注意不要彻底干燥，否则RNA容易降解）14 加入100-120ul ddH2O（一般浓度在1000ng/ul以上）15 热激，60℃10min（用完将温度调至80℃）16 置于冰上冷却，使用Nanodrop测RNA浓度(测完浓度后，左边可以选report，将结果保存为xml格式，在excel中打开处理数据)17 将RNA稀释至500ng/ul或者1000ng/ul逆转录（25ul体系-2ugRNA）1 PCR管中加入试剂1（M1）dNTP（Takara, 2mM）3ul M1 oligodT（Takara,codeD511, 14nmol）3ulddH2O 8ulRNA(500ng/ul) 4ul (一般M1多配1个体系)2 混匀，80℃变性5min，冰上2min3 加入试剂2（M2）RT Ace (TOYOBO，A3477L，100U/ul) 1ulRRI (Takara,code D2313A,40U/ul) 1ul5xRT buffer(TOYOBO，A3477L) 5ul4 混匀，逆转录42℃，1h99℃，5min16℃，forever5 -20℃保存qPCR定量1 取cDNA母液4ul，加入196ul ddH2O（稀释50倍）2 qPCR（10ul体系）SYBR（Takara，codeDRR041A）5ul Primer（F+R，5pmol/ul）0.8ul cDNA 4.2ul （一般将SYBR和Primer混匀，ddH2O和cDNA混匀）（usually prepare 1 more sybr+primer mixture/10wells）调基线：233.7。
RNA提取及PCR操作流程
RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)操作步骤:1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。
样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。
TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。
TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。
加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA 降解。
一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。
取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。
样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。
RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。
用异丙醇沉淀水相中的RNA。
每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。
RNA提取-反转录-半定量PCR
RNA提取原理及每个步骤的原理一、实验目的：提取组织中RNA,作为逆转录cDNA的原料二、实验原理：（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）a） TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
试剂主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。
加入氯仿后离心，样品分成水样层（无色）和有机层（黄色）。
RNA存在于水样层中。
收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
三、实验材料：氯仿，异丙醇，Rnase-free ddH2O，75%乙醇（用Rnase-free水配制）四、实验步骤：（TIANGEN：Phase lock Gel TM Henny 配合Trizol A+提总RNA 操作）实验流程图细胞细胞选择冷贴壁细胞斗悬浮细胞pHS.71.匀浆处理（*打开离心机，降温）a） -80℃冻存组织，转移至普通2ml管中，每30mg组织加1ml Trizol A+。
用匀浆仪匀浆，样品体积不超过Trizol A+体积的10% （注：先加7003 Trizol A+,再加3003，防止外溢；一般匀浆1.5~2min,可设Timer）裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中2.将匀浆样品在20℃左右放置5min使RNA充分释放到溶液中3. 将Phase lock Gel TM（PLG）置于离心机中，15000Xg 离心30s离心到底部，不让贴壁4.将第2步中的匀浆样品全部转移至离心后的PLG中，每1ml Trizol A+加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s分层，PLG可在在水相和有机相之间形成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，这样，全部水相样品可轻松吸出，完全不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流出来。
Q-PCR操作简易流程--根据试剂盒整理
一、总RNA提取流程适量超低温冻结的动物组织，研钵内加液氮研磨，至粉末状♓加入适量（100mg组织加1ml）RNAiso Plus，将研磨成粉末状的样品完全覆盖♓室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状♓将匀浆液转移至离心管，室温静置5min，12000g 4℃离心5min♓小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）♓加入氯仿（为RNAiso Plus 的1/5 体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s♓室温静置5min，12000g 4℃离心15min♓匀浆液分为3层，吸取无色上清液至新离心管中♓上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，在15-30℃下静置10min♓12000g 4℃离心10min，离心后，底部会出现沉淀，即为RNA♓小心弃去上清，沿管壁加入1ml 75%乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁♓12000g 4℃离心15min，小心弃去乙醇，超净台内干燥2-5min♓加入适量（一般40-50ul试沉淀大小）DEPC处理水中，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀♓待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存二、RT-PCR1、冰上在一个管子中制备如下反应混合物：2、轻柔混合，微量离心机离心3-5秒。
70°C孵育混合物5min，冰冷却，短暂离心，收集沉淀。
3、管子置于冰上，按指定顺序加入以下成份：1. 合成适合PCR 扩增的第一链cDNA①冰上在一个管子中制备如下反应混合物：模板RNA*：总RNA 0.1-5μg或poly(A)+ RNA 10ng- 0.5μg或特异RNA 0.01pg - 0.5μg引物：oligo(dT)18引物(0.5μg/μl) 1μl或随机六聚物引物(0.2μg/μl) 1μl或序列特异性引物15–20pmolDEPC处理过的水to 12μl轻柔混合，微量离心机离心3-5秒。
②70°C孵育混合物5min，冰冷却，短暂离心，收集沉淀。
提逆转录步骤
【一、提RNA】一、实验准备：1、试剂：75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用)、2、配75%乙醇(DEPC水+无水乙醇)，放-20℃冰箱预冷；3、预冷离心机(1.5mL EP管用的)；4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩；二、操作步骤：01、弃上清（不回收，直接倒去）；02、1mL/孔 PBS洗两遍（不回收，直接倒去，随后用200μL枪吸尽PBS）；03、每孔加500μL Trizol，轻晃，随后室温放置2min左右；04、枪头吹打，吸出放入1.5mL 进口EP管；05、加入100μL氯仿(即1/5体积的trizol)；06、4℃离心机，12000g，15min；07、吸200μL(可减少)上清放入新的1.5mL 进口EP管中（注意：只能吸到上清）；08、加入等体积异丙醇，充分混匀，常温放置10-30min(15min)；09、4℃离心机，12000g，10min；10、倒掉液体，加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀；11、4℃离心机，7500g，5min；12、倒掉上清，加入1mL预冷的75%乙醇，混匀；13、4℃离心机，7500g，5min；14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10min，用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠；15、每管中加入40μL(40μ-60μL)的DEPC水，吹打溶解；16、测浓度（先知楼21楼测RNA浓度，带DEPC水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头）；三、注意事项01、如果当时不测RNA浓度，可暂时把RNA放在-20℃冰箱。
但长时间(>24h)保存，需要放在-80℃冰箱；02、异丙醇作用是沉淀RNA，作用比乙醇好；03、04、05、06、07、08、09、【二、测RNA浓度】一、实验准备：01、先知楼21楼-2109教室，一个冰盒+DEPC水+10微升枪、灭菌dd H2O、10μL枪头(RNA 专用)、本子+笔；二、操作步骤：01、登记；02、打开电脑==>打开“N”软件==>点击“Nucleic acid”==>选择“OK”==>选择“RNA”；03、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；04、DEPC水校零：即加DEPC水一滴，点击“Blank”，擦干；05、测RNA：加样品一滴，点击“measure”，擦干，随后加下一个样品；06、记录数据，包括RNA浓度（<1000ng/μL）、260/280；07、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；08、-80℃冰箱保存；三、注意事项230nm代表水平()，260nm代表RNA 水平，280nm代表蛋白水平，260/230表示有机物量，260/280代表RNA提取量；1.A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1-1.0。
RNA提取-逆转录
RNA提取和RT-PCR1.准备工作：检查提RNA专用的枪头，EP管，以及PBS，Trizol，氯仿，酚氯仿，异丙醇，75%乙醇，DEPC水（0.1%）。
2.从4℃取出Trizol恢复室温，预冷离心机到4℃。
3.用室温的PBS把细胞洗一次，加入1ml Trizol裂解细胞，静置5分钟，反复吹打10次，收集到EP管内，-80℃可储存一个月（解冻时需要离心）。
4.向Trizol裂解液内加入200ul氯仿，上下用力颠倒混匀半分钟，静置3分钟。
5.4℃，12000g离心15分钟，此时可见细胞裂解液分三层：上层为水相的RNA；中层为DNA,脂类等；下层为细胞残渣，蛋白，多糖等。
6.转移上层的水相到新的EP管内，150ul吸三次，共450ul。
7.补充200ul的DEPC水，总体积即为650ul，加入等体积的酚氯仿，混匀，静置3分钟后，4℃离心，12000rcf,15分钟。
8.取上清500ul到新的EP管内，167ul吸三次。
加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟后，4℃，12000g离心10分钟。
9.小心去掉上清，注意不要丢失RNA沉淀，加入1ml 75%乙醇, 上下颠倒，使沉淀块重悬起，加75%乙醇后4℃可储存一周， -20℃可储存一年。
10.4℃，12000g离心10分钟,小心去掉上清，尽量吸干管壁的液体，注意不要丢失RNA沉淀，若沉淀松动可再次离心。
晾干约15分钟，至管壁无液体。
11.加入适量体积（20-30ul）的DEPC水溶解RNA，58℃水浴10分钟。
12.取出3 ul定量，测量buffer: 10mM TrisCl(pH7.8)，根据定量结果进行逆=40µg/ml,A260/A2801.8~2.1）转录。
（1A26013.逆转录：a.根据定量结果取2μg RNA补充DEPC水至14μl；b.加入1μg oligod(T),70℃5min,取出后立刻冰上孵育5min；c.进行逆转录反应：在上一步反应管中直接加共40μl，42℃反应1h。
提RNA 逆转录 qRT CR步骤
【一、提RNA】一、实验准备：1、试剂：75%乙醇、Trizol、进口EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用)、2、配75%乙醇(DEPC水+无水乙醇)，放-20℃冰箱预冷；3、预冷离心机 EP管用的)；4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩；二、操作步骤：01、弃上清（不回收，直接倒去）；02、1mL/孔 PBS洗两遍（不回收，直接倒去，随后用200μL枪吸尽PBS）；03、每孔加500μL Trizol，轻晃，随后室温放置2min左右；04、枪头吹打，吸出放入进口EP管；05、加入100μL氯仿(即1/5体积的trizol)；06、4℃离心机，12000g，15min；07、吸200μL(可减少)上清放入新的进口EP管中（注意：只能吸到上清）；08、加入等体积异丙醇，充分混匀，常温放置10-30min(15min)；09、4℃离心机，12000g，10min；10、倒掉液体，加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀；11、4℃离心机，7500g，5min；12、倒掉上清，加入1mL预冷的75%乙醇，混匀；13、4℃离心机，7500g，5min；14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10min，用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠；15、每管中加入40μL(40μ-60μL)的DEPC水，吹打溶解；16、测浓度（先知楼21楼测RNA浓度，带DEPC水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头）；三、注意事项01、如果当时不测RNA浓度，可暂时把RNA放在-20℃冰箱。
但长时间(>24h)保存，需要放在-80℃冰箱；02、异丙醇作用是沉淀RNA，作用比乙醇好；03、04、05、06、07、08、09、【二、测RNA浓度】一、实验准备：01、先知楼21楼-2109教室，一个冰盒+DEPC水+10微升枪、灭菌dd H2O、10μL枪头(RNA 专用)、本子+笔；二、操作步骤：01、登记；02、打开电脑==>打开“N”软件==>点击“Nucleic acid”==>选择“OK”==>选择“RNA”；03、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；04、DEPC水校零：即加DEPC水一滴，点击“Blank”，擦干；05、测RNA：加样品一滴，点击“measure”，擦干，随后加下一个样品；06、记录数据，包括RNA浓度（<1000ng/μL）、260/280；07、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；08、-80℃冰箱保存；三、注意事项230nm代表水平()，260nm代表RNA 水平，280nm代表蛋白水平，260/230表示有机物量，260/280代表RNA提取量；是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为。
提RNA逆转录qRTPCR步骤材料模板
【一、提RNA】一、实验准备：1、试剂：75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用)、2、配75%乙醇(DEPC水+无水乙醇)，放-20℃冰箱预冷；3、预冷离心机(1.5mL EP管用的)；4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩；二、操作步骤：01、弃上清（不回收，直接倒去）；02、1mL/孔 PBS洗两遍（不回收，直接倒去，随后用200μL枪吸尽PBS）；03、每孔加500μL Trizol，轻晃，随后室温放置2min左右；04、枪头吹打，吸出放入1.5mL 进口EP管；05、加入100μL氯仿(即1/5体积的trizol)；06、4℃离心机，12000g，15min；07、吸200μL(可减少)上清放入新的1.5mL 进口EP管中（注意：只能吸到上清）；08、加入等体积异丙醇，充分混匀，常温放置10-30min(15min)；09、4℃离心机，12000g，10min；10、倒掉液体，加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀；11、4℃离心机，7500g，5min；12、倒掉上清，加入1mL预冷的75%乙醇，混匀；13、4℃离心机，7500g，5min；14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10min，用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠；15、每管中加入40μL(40μ-60μL)的DEPC水，吹打溶解；16、测浓度（先知楼21楼测RNA浓度，带DEPC水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头）；三、注意事项01、如果当时不测RNA浓度，可暂时把RNA放在-20℃冰箱。
但长时间(>24h)保存，需要放在-80℃冰箱；02、异丙醇作用是沉淀RNA，作用比乙醇好；03、04、05、06、07、08、09、【二、测RNA浓度】一、实验准备：01、先知楼21楼-2109教室，一个冰盒+DEPC水+10微升枪、灭菌dd H2O、10μL枪头(RNA 专用)、本子+笔；二、操作步骤：01、登记；02、打开电脑==>打开“N”软件==>点击“Nucleic acid”==>选择“OK”==>选择“RNA”；03、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；04、DEPC水校零：即加DEPC水一滴，点击“Blank”，擦干；05、测RNA：加样品一滴，点击“measure”，擦干，随后加下一个样品；06、记录数据，包括RNA浓度（<1000ng/μL）、260/280；07、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；08、-80℃冰箱保存；三、注意事项230nm代表有机物水平(碳水化合物)，260nm代表RNA 水平，280nm代表蛋白水平，260/230表示有机物量，260/280代表RNA提取量；1.A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1-1.0。
总RNA提取及QPCR标准操作流程
总RNA提取及反转录标准操作流程一、仪器试剂Trizol试剂三氯甲烷（4℃预冷）异丙醇（4℃预冷）75%乙醇（DEPC处理水配置）（4℃预冷）DEPC处理水/RNase free water（反转录试剂盒）1.5mL无酶EP管200μL无酶PCR管冷冻离心机Nano Drop 2000反转录试剂盒（Takara RR036A）二、实验须知1. 选择人员走动较少的实验台或超净台（无须打开风机）操作。
2. 操作及观摩人员必须佩戴干净的一次性手套及口罩。
3. 尽可能在冰盘上操作。
3. 取EP管时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。
取完EP管后，袋子及时封好。
4. Trizol含剧毒，若溅到皮肤上，请立即用清水冲洗；若溅到眼内，立即大量清水冲洗，并送医就诊。
三、样品处理1. 组织样品将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解。
注1：样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
注2：组织样品收取后应立即处理或液氮冷冻并-80摄氏度保藏。
胰腺组织样品因其各种酶含量极其丰富，应尤为注意，研磨过程中注意保持样品低温状态。
2. 贴壁细胞样品弃去细胞培养皿中培养基，根据下表加入适量 Trizol溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml 无酶EP管中，室温静置5min，使细胞充分裂解。
注：加入Trizol溶液后，可将培养皿放入-80℃冰箱，20min后取出化开，通过冻融增加细胞裂解效果。
3. 悬浮细胞500g×5min离心收集细胞，弃去培养基，约5-10×106细胞加入1mLTrizol 溶液，吹打混匀，室温静置5min，使细胞充分裂解。
注：某些酵母或细菌细胞须超声裂解。
4.注意事项1）样品裂解液可室温存放数小时，-80℃可至少存放一月。
2）若样品含大量脂肪、蛋白、多糖及包外物质，如脂肪、肌肉或块茎植物等样品，可增加一步离心操作，具体步骤如下：12000g、4℃离心10min，胞外基质、多糖、高分子量DNA将会形成颗粒沉淀于底部，RNA包含于上清中，而高脂样品会在上清液上方形成一层脂肪层。
抽提RNA与反转录PCR
RNA 抽提一、物品准备1、DEPC水：4L ddH2O+1mL DEPC，通风橱搅拌过夜，分装后121℃灭菌30min。
分装DEPC水的瓶子若为第一次使用，应用搅拌2h左右的DEPC水浸泡过夜。
2、装离心管的铁盒，先灭菌，装管时用DEPC水润洗即可。
3、离心管：用进口离心管，用镊子取出，镊子用前在酒精灯烧。
4、枪头：RNA free 进口枪头，用酒精灯烧过后的镊子从包装袋里取出，置于RNA装用枪头盒中。
二、RNA抽提1、磨样：用液氮取样后置于-70℃超低温冰箱中保存，将样品从超低温冰箱取出后置于RNA抽提专用研钵中，用液氮研磨彻底后，迅速取0.1g~0.2g磨好的样品置于分装好的Trizol中（使用前用进口离心管分装，1mL每管），填平管口，颠倒混匀至无结块的样品。
注意弄干净管口，样品量大至为填平管口，磨样期间将冷冻离心机预冷；2.、加200uL 24:1氯仿/异戊醇，剧烈振荡45S后，室温静置10-15min，使样品充分被萃取；3、12000rpm，4℃冷冻离心15min；4、吸取上清600uL,加入2/3体积的异丙醇，轻柔颠倒30S后静置10min；5、12000rpm，4℃冷冻离心15min；6、倒去上清，用面巾纸吸干，加75%乙醇（DEPC水配置）500uL，颠倒使沉淀漂浮起来；7、12000rpm，4℃离心5min，倒去上清；8、短暂离心后，用进口枪头吸去残夜，置于超净台用吸水纸吸干，吹5-10min至RNA沉淀恰好干燥（周围变半透明）；9、加30uL DEPC水，65℃水浴溶解5min。
10、取1uL测定RNA浓度，1.8<A260/A280<2.1为好，>2.2为易降解。
三、RNA质量检测1、先用40%NaOH浸泡电泳所用槽子和梳子，量筒，制胶板，三角瓶过夜；2、1%琼脂糖胶制备：用新用的琼脂糖、TBE母液（用DEPC水配置）稀释成1×TBE缓冲液体配置；3、取1ul原液体RNA+7ul DEPC水+2uL新的loading buffer，上样即可；4、电泳；5、看胶：RNA一般为3条主带28S、18S、5S，28S:18S亮度为2:1最佳，28S上还有一条大带，说明有基因组DNA污染，5S下游拖带说明RNA有降解。
提取RNA到PCR检测全部实验步骤
PCR 体系： SYBRGREEN12.5 μ DEPC 水10.5 μ 前引物0.5 μ 后引物0.5 μ DNA 模版1 μl 算好总量，提前混合 使用前离心，再根据说明书溶解 成母液，再稀释 10 倍成为工作液 提取 RNA （以下步骤都在冰盒中进行）1. TRLzol 加入培养皿中（ 1ml ），静置 5min 后，将每个面都吹一下，转入 1.5ml 的离心管（附一）2. 加入氯仿，量为 TRLZOL 的五分之一 ，悬空打入，然后摇匀静置 5min ，然后 离心： 4℃， 12000g ， 15min3. 吸取三层中最上层的水层， 加入等量的异丙醇，悬空打入，混匀，静置 10min ， 离心:4 ℃， 12000g ，10min ，吸去上清液4. 加入 1ml 的 75％的乙醇，离心： 4℃， 12000g ，5min （重复两遍 ）5. 吸干酒精，静置 10min 使酒精风干，再加入 20μl 的DEPC 水，加入后吹打几 下，使 RNA 溶解。
6. 用 DEPC 水稀释 10-20 倍，每份总量为 10μl ，既 9μ l 的水和 1μ l 的 RNA ， 测 RNA 浓度（附二）500ng9. 按照要求加入药品，放入仪器中，设置 HAO ，10μ l 逆转录10.转录完成后，取1μl 的样品，稀释10倍，用Q5000测浓度，一般都是 120-130，所以可以稀释 13 倍，使 cDNA 不超过 100ng7. 10μ l ，RNA 加入量不超过 500ng ，但是尽量靠近 500ng 。
5×Prime2 μl RT Enzyme0.5 l Primer0.5 l Random0.5 l RNA6.5μl DEPC 水10μl 8. 先配好前四样的混合液，后两样根据测的RNA 浓度计算，保证 RNA 不超过逆转录，总体系12. 前后引物和模版稀释后都需要涡旋离心。
加入SYBRG REEN需要避光，准备八连管。
qPCR实验操作流程
Q-P C R实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。
取完EP管/枪头后，袋子及时封好。
④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。
⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1mlTrizol（Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1mlTrizol（Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNasefreeEP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀），去上清；6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP 管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
提RNA 逆转录 qRT-PCR步骤模板
【一、提RNA】一、实验准备：1、试剂：75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用)、2、配75%乙醇(DEPC水+无水乙醇)，放-20℃冰箱预冷；3、预冷离心机(1.5mL EP管用的)；4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩；二、操作步骤：01、弃上清（不回收，直接倒去）；02、1mL/孔 PBS洗两遍（不回收，直接倒去，随后用200μL枪吸尽PBS）；03、每孔加500μL Trizol，轻晃，随后室温放置2min左右；04、枪头吹打，吸出放入1.5mL 进口EP管；05、加入100μL氯仿(即1/5体积的trizol)；06、4℃离心机，12000g，15min；07、吸200μL(可减少)上清放入新的1.5mL 进口EP管中（注意：只能吸到上清）；08、加入等体积异丙醇，充分混匀，常温放置10-30min(15min)；09、4℃离心机，12000g，10min；10、倒掉液体，加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀；11、4℃离心机，7500g，5min；12、倒掉上清，加入1mL预冷的75%乙醇，混匀；13、4℃离心机，7500g，5min；14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10min，用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠；15、每管中加入40μL(40μ-60μL)的DEPC水，吹打溶解；16、测浓度（先知楼21楼测RNA浓度，带DEPC水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头）；三、注意事项01、如果当时不测RNA浓度，可暂时把RNA放在-20℃冰箱。
但长时间(>24h)保存，需要放在-80℃冰箱；02、异丙醇作用是沉淀RNA，作用比乙醇好；03、04、05、06、07、08、09、【二、测RNA浓度】一、实验准备：01、先知楼21楼-2109教室，一个冰盒+DEPC水+10微升枪、灭菌dd H2O、10μL枪头(RNA 专用)、本子+笔；二、操作步骤：01、登记；02、打开电脑==>打开“N”软件==>点击“Nucleic acid”==>选择“OK”==>选择“RNA”；03、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；04、DEPC水校零：即加DEPC水一滴，点击“Blank”，擦干；05、测RNA：加样品一滴，点击“measure”，擦干，随后加下一个样品；06、记录数据，包括RNA浓度（<1000ng/μL）、260/280；07、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；08、-80℃冰箱保存；三、注意事项230nm代表有机物水平(碳水化合物)，260nm代表RNA 水平，280nm代表蛋白水平，260/230表示有机物量，260/280代表RNA提取量；1.A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1-1.0。
总RNA提取及QPCR标准操作流程
总RNA提取及反转录标准操作流程一、仪器试剂Trizol试剂三氯甲烷（4℃预冷）异丙醇（4℃预冷）75%乙醇（DEPC处理水配置）（4℃预冷）DEPC处理水/RNase free water（反转录试剂盒）无酶EP管200μL无酶PCR管冷冻离心机Nano Drop 2000反转录试剂盒（Takara RR036A）二、实验须知1. 选择人员走动较少的实验台或超净台（无须打开风机）操作。
2. 操作及观摩人员必须佩戴干净的一次性手套及口罩。
3. 尽可能在冰盘上操作。
3. 取EP管时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。
取完EP管后，袋子及时封好。
4. Trizol含剧毒，若溅到皮肤上，请立即用清水冲洗；若溅到眼内，立即大量清水冲洗，并送医就诊。
三、样品处理1. 组织样品将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解。
注1：样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
注2：组织样品收取后应立即处理或液氮冷冻并-80摄氏度保藏。
胰腺组织样品因其各种酶含量极其丰富，应尤为注意，研磨过程中注意保持样品低温状态。
2. 贴壁细胞样品弃去细胞培养皿中培养基，根据下表加入适量 Trizol溶液，吹打混匀，并吸至无酶EP管中，室温静置5min，使细胞充分裂解。
注：加入Trizol溶液后，可将培养皿放入-80℃冰箱，20min后取出化开，通过冻融增加细胞裂解效果。
3. 悬浮细胞500g×5min离心收集细胞，弃去培养基，约5-10×106细胞加入1mLTrizol溶液，吹打混匀，室温静置5min，使细胞充分裂解。
注：某些酵母或细菌细胞须超声裂解。
4. 注意事项1）样品裂解液可室温存放数小时，-80℃可至少存放一月。
2）若样品含大量脂肪、蛋白、多糖及包外物质，如脂肪、肌肉或块茎植物等样品，可增加一步离心操作，具体步骤如下：○1 12000g、4℃离心10min，胞外基质、多糖、高分子量DNA将会形成颗粒沉淀于底部，RNA包含于上清中，而高脂样品会在上清液上方形成一层脂肪层。
RNA提取及PCR操作流程
RNA提取及PCR操作流程RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)操作步骤:1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。
样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。
TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。
TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。
加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA 降解。
一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。
取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。
样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。
RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。
用异丙醇沉淀水相中的RNA。
每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。
RNA提取、逆转录和PCR
总RNA的提取一、仪器及试剂：仪器：低温高速离心机；紫外分光光度计；高精度加样器及枪头：0.5-10uL、20-200uL、200-1000uL；EP管等试剂：天根总RNA提取试剂盒；氯仿；无水乙醇等。
样品：大鼠外周血或单个核细胞等。
二、实验步骤(准备工作：RD和RW加无水乙醇)：1、细胞悬液：离心去上清，5-10×106细胞加RZ 1ml(新鲜血液：0.25ml血+0.75mlRZ裂解液)，室温 5min；2、加 200ul 氯仿，震荡混匀 15s，室温 3min；3、 4℃12000rpm 离心 10min，上层水相层转移至新管（无 RNase）中；4、加 0.5 倍体积（500ul）无水乙醇，混匀；5、上柱，4℃12000rpm 离心 30s,弃废液；6、加 500ulRD，4℃12000rpm 离心 30s,弃废液；7、加 600ulRW，室温 2min，4℃12000rpm 离心 30s,弃废液；8、重复上一步；9、换新收集管，4℃12000rpm 离心 2min,弃废液；10、换新收集管，加 30-100ulRNase-free ddH2O，室温 2min，4℃12000rpm 离心 2min；11、浓度及纯度检测；12、保存在-70℃。
总R NA逆转录成c DNA一、仪器及试剂：仪器：低温高速离心机；高精度加样器及枪头：0.5-10uL、20-200uL、200-1000uL；EP管等试剂：RevertAid™First Strand cDNA Synthesis Kit。
样品：大鼠总RNA。
二、实验步骤：1. 冰上充分溶解逆转录试剂盒中的相关试剂和R NA。
2. 取P CR 管，冰上依次加入以下试剂：Oligo(dT) 1ul总R NA 0.1 ng - 5 µg（1ul）加R Nase-free 水至12ul，混匀。
3. 4℃微离心（5000r/min×5sec）4. 置P CR 管与P CR仪中，65℃孵育5min，迅速置冰上，微离心。
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【一、提RNA】一、实验准备：1、试剂：75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用)、2、配75%乙醇(DEPC水+无水乙醇)，放-20℃冰箱预冷；3、预冷离心机(1.5mL EP管用的)；4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩；二、操作步骤：01、弃上清（不回收，直接倒去）；02、1mL/孔PBS洗两遍（不回收，直接倒去，随后用200μL枪吸尽PBS）；03、每孔加500μL Trizol，轻晃，随后室温放置2min左右；04、枪头吹打，吸出放入1.5mL 进口EP管；05、加入100μL氯仿(即1/5体积的trizol)；06、4℃离心机，12000g，15min；07、吸200μL(可减少)上清放入新的1.5mL 进口EP管中（注意：只能吸到上清）；08、加入等体积异丙醇，充分混匀，常温放置10-30min(15min)；09、4℃离心机，12000g，10min；10、倒掉液体，加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀；11、4℃离心机，7500g，5min；12、倒掉上清，加入1mL预冷的75%乙醇，混匀；13、4℃离心机，7500g，5min；14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10min，用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠；15、每管中加入40μL(40μ-60μL)的DEPC水，吹打溶解；16、测浓度（先知楼21楼测RNA浓度，带DEPC水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头）；三、注意事项01、如果当时不测RNA浓度，可暂时把RNA放在-20℃冰箱。
但长时间(>24h)保存，需要放在-80℃冰箱；02、异丙醇作用是沉淀RNA，作用比乙醇好；03、04、05、06、07、08、09、【二、测RNA浓度】一、实验准备：01、先知楼21楼-2109教室，一个冰盒+DEPC水+10微升枪、灭菌dd H2O、10μL枪头(RNA 专用)、本子+笔；二、操作步骤：01、登记；02、打开电脑==>打开“N”软件==>点击“Nucleic acid”==>选择“OK”==>选择“RNA”；03、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；04、DEPC水校零：即加DEPC水一滴，点击“Blank”，擦干；05、测RNA：加样品一滴，点击“measure”，擦干，随后加下一个样品；06、记录数据，包括RNA浓度（<1000ng/μL）、260/280；07、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；08、-80℃冰箱保存；三、注意事项230nm代表有机物水平(碳水化合物)，260nm代表RNA 水平，280nm代表蛋白水平，260/230表示有机物量，260/280代表RNA提取量；1.A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1-1.0。
如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；如果吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。
DNA 样品的A260 吸光度值是否>0.1。
（请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值<0.1）；2.A280nm、A270nm是蛋白最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA 的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。
如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。
比值=1.5 相当于50％蛋白质/DNA溶液.酚的最大吸收峰在270nm。
3. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA 和RNA的A260/A230比值为2.5。
若比值小于2.0 标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。
A230产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。
在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正。
4. A320nm或A340nm 为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。
该值应该接近0.0。
如果不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。
纯样品的A320一般是0。
5. A260/A280和A260/A230 是核酸纯度的指示值。
纯度好的DNA或RNA，在pH7-8.5 下A260 / A280的比值应该在2.0 或2.5。
纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。
如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。
A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐（胍盐）等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。
当0.5％BSA蛋白质污染时，蛋白污染会导致260和280的数值都下降，其净结果是260/280比值下降，但260/280的比值变化并不显著，正如分子克隆3所说。
但蛋白残留会导致230的数值显著上升，显著影响260/230的比值。
也就是说，如果RNA样品的260/280＝1.7，260 /230＝0.5，那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留，而是蛋白残留.用分光光度计测量RNA时，用水而不是用TE 缓冲液稀释RNA样品会造成A260/A280比值下降。
原因是低离子强度和低pH溶液会增加280 nm处的光吸收值。
加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多，那样就很容易被蛋白污染，所以现在一般取400ul左右。
6.当260/230<1时，只有两种情况。
一是胍盐污染，二是蛋白污染。
【三、逆转录】一、实验准备：01、进口10μL枪头(qRT-PCR专用)、冰盒一个、200μL进口EP管；02、冰上融化1、2、4、2号试剂(提前半小时)；03、二、操作步骤：试剂盒：1. 2μL2. 0.5μL(最后加入)3. 0.5μL4. 0.5μLRNA 1000ngDEPC水----------------10μL体系01、200μL进口管子：EP管加相应DEPC水==>加1号试剂（2μL）==>加3号试剂(0.5μL)==>加4号试剂(0.5μL)==>加2号试剂(0.5μL)==>加RNA==>离心==>上机；02、上机：OPEN==>点击“User”菜单下的“clx”，点击“Accept”==>选择“run”下面的到“exp001 rt”==>修改体系“10μL”(默认为25微升)==>点击“Start”，进入界面；03、37.0℃15min==>85.0℃5s==>4.0℃60min；04、4℃冰箱保存；三、注意事项01、加液尽量无气泡，枪不要打到底；02、严格冰上操作，防止RNA降解；【qRT-PCR】一、实验准备：01、试剂：Roche的SyBr Green(rox)02、1.5mL EP管、0.2mL EP管、96孔板/八连冠；10μL、20μL、100μL、200μL、2.5μL、1000μL枪；03、冰盒一个、Rox化冻(避光)、引物化冻（GAPDH）、cDNA、DEPC水；二、操作步骤：01、Rox 10μL；+ dd H2O 6μL；+ P1(F) 1+ P2(R) 1+ cDNA 2------------20μL体系02、计算：每个样，X个抗体(至少包括GAPDH-内参,还有目的)，三个副孔。
即如果六个样，2个抗体(GAPDH,PLK1)，三个副孔。
6*1*3=18≈20(PLK1)，6*1*3=18≈20(GAPDH)；1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 126/PLK16/PLK16/PLK15/PLK15/PLK15/PLK 16/GAP6/GAP6/GAP5/GAP5/GAP5/GAP4/PLK14/PLK14/PLK13/PLK13/PLK13/PLK12/PLK12/PLK12/PLK11/PLK11/PLK11/PLK 14/GAP4/GAP4/GAP3/GAP3/GAP3/GAP2/GAP2/GAP2/GAP1/GAP1/GAP1/GAP PLK1Rox：10*20=200μLDEPC水：6*20=120μLF：1*20=20μLR：1*20=20μLGAPDHRox：10*20=200μLDEPC水：6*20=120μLF：1*20=20μLR：1*20=20μL03、稀释cDNA 10倍(18μL DEPC水+2μL)==>配置Mix(Rox+ DEPC水+F+R)==>加样(一横排先加18μL mix(GAPDH)，随后加入18μL mix(PLK1)。
随后六个孔加同一个cDNA；06、去除气泡：加好样后，观察有无气泡。
如果有气泡，弹开，随后>2000rpm离心，时间不定(5s即可)；07、上机+设置程序：A、双击打开程序“StepOne Software v2.1 ”==>点击“OK ”==>点击“Ignore & Continue Startup ”==>点击“Advanced Setup ”==>进入“Experment Properties界面”；B、Experment Properties界面：将Expriment Name从Untitled 修改为“日期，如2015-12-17”，将User Name(Optional)修改为“CZL”；Which instrument are you using to run the experiment ?中选择“96 wells”，一般无需修改；What type of experiment do you want to setup ?中选择“Quantitation-Comparative C T(△△C T)”；Which reagents do you want to use to detect the target sequence ? 中选择“SYBR Green Reagents”；Which ramp speed do you want to use in the instrument run ? 中选择“Fast(~ 40 minutes to complete a run)”；C、Plate Setup界面-Define Targets and Samples界面：Define Targets栏中：如果有GAPDH、PLK1、Akt、PI3K三个引物，则点击“Add New Target ”三下，出现“Target1、Target2、Target3、Target4”三个==>将其重命名；Define Samples栏中：如果有6个样品(N;1.5;3;6;9;12)，则点击“Add New Sample”，出现“Sample 1、Sample 2、Sample 3、Sample 4、Sample 5、Sample 6”六个==>将其重命名；Plate Setup界面-Assign Targets and Samples界面：GAP/ 1GAP/1GAP/1GAP/2GAP/2GAP/2GAP/3GAP/3GAP/3GAP/4GAP/4GAP/4Plk1/1Plk1/1Plk1/1Plk1/2Plk1/2Plk1/2Plk1/3Plk1/3Plk1/3Plk1/4Plk1/4Plk1/4 Akt/1Akt/1Akt/1Akt/2Akt/2Akt/2Akt/3Akt/3Akt/3Akt/4Akt/4Akt/4 PI3K/1PI3K/1PI3K/1PI3K/2PI3K/2PI3K/2PI3K/3PI3K/3PI3K/3PI3K/4PI3K/4PI3K/4GAP/ 5GAP/5GAP/5GAP/6GAP/6GAP/6Plk1/5Plk1/5Plk1/5Plk1/6Plk1/6Plk1/6Akt/5Akt/5Akt/5Akt/6Akt/6Akt/6PI3K/5PI3K/5PI3K/5PI3K/6PI3K/6PI3K/6D、Run Method界面：设置温度；随后修改“Reaction Volume Per Well”，将其改为“20μL体系”；E、点击“Start Run”三、注意事项01、注意一定要禁止气泡。