第三章 基因工程设计策略及操作流程2[可修改版ppt]
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）末端加连杆的连接
• 连杆又叫衔接物(linker)，是指用化学法合 成的由10-12个核苷酸组成，具有一个或数 个限制性酶识别位点的寡核苷酸片段。
• 将连杆加在待连接的DNA分子的末端，然
后用在连杆中具有识别位点的限制性内切
酶处理，即可得到具有互补黏性末端的两 种DNA片段，再在DNA连接酶作用下实现 连接。
• 置换式可用两种限制性内切酶或是在载体 上有两个识别序列的一种限制性内切酶处 理载体，载体被切成大小不等的两个片段， 把外源DNA与载体大片段连接，即置换了 载体中原有的小片段，形成重组DNA分子。
• 形成重组DNA的实质就是催化外源DNA与 载体DNA间高效地形成3′,5′-磷酸二酯键， 连接方式有很多种，具体使用时要根据外 源DNA与载体DNA末端的性质选择合适的 方法，以保证连接效率。
• 待连接的DNA片段末端加上长度约10-40个 核苷酸的互补的同聚物尾巴后，在T4 DNA 连接酶的作用下形成重组DNA分子，重组 DNA分子中有缺口的部分可待其转入受体 细胞后，利用受体细胞中的DNA聚合酶和 DNA连接酶将缺口填补起来。
能把任何片 段连接起来
不能把插 入片段再 切下来
片段末端同聚物加尾法
• 一个为平末端和一个为黏性末端的DNA片 段之间的连接，也可以两个平末端DNA片 段间的连接。需要末端转移酶（terminal transforase）催化，在酶的作用下按照 5′→3′方向将四种脱氧核苷酸分子的任意一 种依次添加到DNA片段的3′-OH末端，形成 同聚物poly(dC)或poly(dG)或poly(dT)或 poly(dA)。
充分混匀后，16℃过夜连接
• 连接效率的检测可用琼脂糖凝胶电泳法， 以载体酶切片段、外源DNA酶切片段为对 照，若只出现两条与对照带相同的条带， 表明连接反应失败；若出现一系列新带， 表明发生连接。
• 为了保证连接效率，减少连接过程中的副 产物，连接时要注意以下几点：接反应中 外源DNA片段和载体DNA片段的浓度、防 止载体自身环化、产生两种重组DNA分子。
• 如果把由两种不同限制性内切酶切割产生 的平末端DNA片段进行连接，得到的连接 产物就丧失了原有的识别序列。
• 如果将由同一种限制性内切酶产生的平末 端DNA片段进行连接，得到的连接产物仍 保留原有的识别序列或是出现一个新的识 别序列。
平末端片段的连接
（3）末端修饰后的连接
①片段末端同聚物加尾法：
载体去磷酸化
双酶切法
（2）平末端的连接
5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易 被连接酶连接。
T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但 效率很低，只有粘性末端的1%。
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
5’ P3’ HO-
-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
EcoR I linker：
GGAATTCC CCTTAAGG
• 这种方法适合于具有平末端的两种DNA片 段，或是具有平末端和黏性末端的两种 DNA片段，也适用于非互补黏性末端的两 种DNA片段的连接。
末端加连杆
（5）DNA接头 (adapter)连接 法 1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。
① adapter
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶 切位点序列）。
BamHI adapter
5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’
② adapter的作用
用T4DNA连接酶连到DNA分子的两 端，直接成为人工粘性末端。
P-P
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
第三章 基因工程设 计策略及操作流程2
3.4.1 基因的体外连接重组
• 含目的基因的外源DNA在体外通过限制性 内切酶和DNA连接酶的作用与载体连接， 获得重组DNA的过程，称为基因的体外连 接重组。
• 基因的体外重组有两种方式：插入式和置 换式。
基因体外重组的类型
• 插入式是用一种限制性内切酶消化载体， 在载体上此酶只有一个识别序列，实现外 源片段插入载体的切口；
ligase nick
C 载体与载体的连接
连接体系
20 μL的互补黏性末端连接反应体系为： 2 μL T4 DNA连接酶缓冲液或E. coli DNA连 接酶缓冲液 5 μL外源DNA片段 5 μL载体DNA片段 1 μL T4 DNA连接酶或E. coli DNA连接酶 其它用ddH2O补齐
• 将重组分子导入受体细胞的方法有很多种， 如转化、转染、显微注射和电穿孔等多种 方式，在转移重组分子时根据受体细胞的 区别选择合适的导入方法。
• 一般原核细胞和低等真核细胞作受体时主 要用转化和转染法，而高等动植物的真核 细胞作受体时主要用显微注射和电穿孔法。
感受态制备过程
②黏性末端修饰为平末端
• 适用于两个DNA片段末端为非互补黏性末 端的情况，也可用于一个片段为平末端另 一片段为黏性末端的情况。
• 将黏性末端改为平末端需要在核酸外切酶 Ⅶ（exonuclease Ⅶ，ExoⅦ）的作用下， 将双链DNA片段的5′或3′端突出部分的单链 断裂，使黏性末端的DNA片段变为平末端。
DNA连接酶
（1）互补黏性末端的连接
• 互补黏性末端的产生是由于外源DNA和载 体DNA用同一种限制性内切酶切割或是用 两种同尾酶切割，但用同尾酶切割后产生 的重组DNA分子丧失了原有的两种限制性 内切酶的识别序列。
黏性末端的连接
A两段DNA的连接
依靠粘性末端
B DNA片断与载体的连接
依靠粘性末端
BamHI adapter
5‘p-GATCCCGGGGCC-
-CCGG -GGCCCTAG-P5’
CCGG
5‘p-GATCCCGG-
GGCCCTAG-P5’
GGCC-
接头自我连接
CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5’
3.4.2 重组分子的转移
• 重组分子构建完成后，必须导入到合适的 受体细胞，才能实现复制、扩增和表达。 受体细胞又称为宿主细胞，是指能够摄取 外源DNA并使其稳定维持的细胞。
• 连杆又叫衔接物(linker)，是指用化学法合 成的由10-12个核苷酸组成，具有一个或数 个限制性酶识别位点的寡核苷酸片段。
• 将连杆加在待连接的DNA分子的末端，然
后用在连杆中具有识别位点的限制性内切
酶处理，即可得到具有互补黏性末端的两 种DNA片段，再在DNA连接酶作用下实现 连接。
• 置换式可用两种限制性内切酶或是在载体 上有两个识别序列的一种限制性内切酶处 理载体，载体被切成大小不等的两个片段， 把外源DNA与载体大片段连接，即置换了 载体中原有的小片段，形成重组DNA分子。
• 形成重组DNA的实质就是催化外源DNA与 载体DNA间高效地形成3′,5′-磷酸二酯键， 连接方式有很多种，具体使用时要根据外 源DNA与载体DNA末端的性质选择合适的 方法，以保证连接效率。
• 待连接的DNA片段末端加上长度约10-40个 核苷酸的互补的同聚物尾巴后，在T4 DNA 连接酶的作用下形成重组DNA分子，重组 DNA分子中有缺口的部分可待其转入受体 细胞后，利用受体细胞中的DNA聚合酶和 DNA连接酶将缺口填补起来。
能把任何片 段连接起来
不能把插 入片段再 切下来
片段末端同聚物加尾法
• 一个为平末端和一个为黏性末端的DNA片 段之间的连接，也可以两个平末端DNA片 段间的连接。需要末端转移酶（terminal transforase）催化，在酶的作用下按照 5′→3′方向将四种脱氧核苷酸分子的任意一 种依次添加到DNA片段的3′-OH末端，形成 同聚物poly(dC)或poly(dG)或poly(dT)或 poly(dA)。
充分混匀后，16℃过夜连接
• 连接效率的检测可用琼脂糖凝胶电泳法， 以载体酶切片段、外源DNA酶切片段为对 照，若只出现两条与对照带相同的条带， 表明连接反应失败；若出现一系列新带， 表明发生连接。
• 为了保证连接效率，减少连接过程中的副 产物，连接时要注意以下几点：接反应中 外源DNA片段和载体DNA片段的浓度、防 止载体自身环化、产生两种重组DNA分子。
• 如果把由两种不同限制性内切酶切割产生 的平末端DNA片段进行连接，得到的连接 产物就丧失了原有的识别序列。
• 如果将由同一种限制性内切酶产生的平末 端DNA片段进行连接，得到的连接产物仍 保留原有的识别序列或是出现一个新的识 别序列。
平末端片段的连接
（3）末端修饰后的连接
①片段末端同聚物加尾法：
载体去磷酸化
双酶切法
（2）平末端的连接
5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易 被连接酶连接。
T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但 效率很低，只有粘性末端的1%。
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
5’ P3’ HO-
-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
EcoR I linker：
GGAATTCC CCTTAAGG
• 这种方法适合于具有平末端的两种DNA片 段，或是具有平末端和黏性末端的两种 DNA片段，也适用于非互补黏性末端的两 种DNA片段的连接。
末端加连杆
（5）DNA接头 (adapter)连接 法 1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。
① adapter
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶 切位点序列）。
BamHI adapter
5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’
② adapter的作用
用T4DNA连接酶连到DNA分子的两 端，直接成为人工粘性末端。
P-P
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
第三章 基因工程设 计策略及操作流程2
3.4.1 基因的体外连接重组
• 含目的基因的外源DNA在体外通过限制性 内切酶和DNA连接酶的作用与载体连接， 获得重组DNA的过程，称为基因的体外连 接重组。
• 基因的体外重组有两种方式：插入式和置 换式。
基因体外重组的类型
• 插入式是用一种限制性内切酶消化载体， 在载体上此酶只有一个识别序列，实现外 源片段插入载体的切口；
ligase nick
C 载体与载体的连接
连接体系
20 μL的互补黏性末端连接反应体系为： 2 μL T4 DNA连接酶缓冲液或E. coli DNA连 接酶缓冲液 5 μL外源DNA片段 5 μL载体DNA片段 1 μL T4 DNA连接酶或E. coli DNA连接酶 其它用ddH2O补齐
• 将重组分子导入受体细胞的方法有很多种， 如转化、转染、显微注射和电穿孔等多种 方式，在转移重组分子时根据受体细胞的 区别选择合适的导入方法。
• 一般原核细胞和低等真核细胞作受体时主 要用转化和转染法，而高等动植物的真核 细胞作受体时主要用显微注射和电穿孔法。
感受态制备过程
②黏性末端修饰为平末端
• 适用于两个DNA片段末端为非互补黏性末 端的情况，也可用于一个片段为平末端另 一片段为黏性末端的情况。
• 将黏性末端改为平末端需要在核酸外切酶 Ⅶ（exonuclease Ⅶ，ExoⅦ）的作用下， 将双链DNA片段的5′或3′端突出部分的单链 断裂，使黏性末端的DNA片段变为平末端。
DNA连接酶
（1）互补黏性末端的连接
• 互补黏性末端的产生是由于外源DNA和载 体DNA用同一种限制性内切酶切割或是用 两种同尾酶切割，但用同尾酶切割后产生 的重组DNA分子丧失了原有的两种限制性 内切酶的识别序列。
黏性末端的连接
A两段DNA的连接
依靠粘性末端
B DNA片断与载体的连接
依靠粘性末端
BamHI adapter
5‘p-GATCCCGGGGCC-
-CCGG -GGCCCTAG-P5’
CCGG
5‘p-GATCCCGG-
GGCCCTAG-P5’
GGCC-
接头自我连接
CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5’
3.4.2 重组分子的转移
• 重组分子构建完成后，必须导入到合适的 受体细胞，才能实现复制、扩增和表达。 受体细胞又称为宿主细胞，是指能够摄取 外源DNA并使其稳定维持的细胞。