病毒空斑纯化步骤

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病毒的分离纯化

病毒的分离纯化
我设计了一套方案，请大家批评指正：
1. 新鲜病叶200g，-70℃冰冻30分钟，以2倍体积0.2mol/L磷酸缓冲液（PH7.5，含0.1%巯基乙醇,2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA）。

组织捣碎机捣碎，双层纱布过滤。

2. 滤液中加入等体积的氯仿，冰浴激烈搅拌15分钟，充分乳化后2000 g离心15分钟
3. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。

冰浴搅拌，4℃下过夜，次日取出10000g离心20分钟。

4. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素），2小时后，2000g离心10分钟。

5. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。

冰浴搅拌4小时，10000g离心30分钟。

6. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH
7.2，2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA，1mol/L尿素），4℃下4小时后，10000g离心10分钟。

7. 上清用10%～40%蔗糖密度梯度离心(30000r/min,1.5h)，收集病毒带，用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）稀释，123000g离心2小时。

8.沉淀用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）悬浮，5000g离心15分钟，上清即为提纯病毒制品。

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病毒空斑实验原理

病毒空斑实验原理
病毒空斑实验是一种常用的分子生物学技术，用于研究病毒的
感染和复制机制。

通过这种实验，我们可以了解病毒在寄主细胞中
的复制过程，从而为病毒的防治提供重要的理论基础。

下面，我们
将详细介绍病毒空斑实验的原理及其应用。

病毒空斑实验的原理主要包括以下几个步骤，制备病毒悬液、
接种寄主细胞、观察病毒感染情况。

首先，我们需要从感染病毒的
细胞中提取病毒颗粒，制备成病毒悬液。

然后，将病毒悬液接种到
寄主细胞培养物中，观察病毒在细胞中的感染情况，最终形成病毒
空斑。

通过观察病毒空斑的形成情况，我们可以推断病毒的感染能
力和复制速度，进而研究病毒的生物学特性。

病毒空斑实验在病毒学研究中具有重要的应用价值。

首先，通
过病毒空斑实验，我们可以研究不同病毒株的感染特性和复制机制，为病毒分类和鉴定提供重要依据。

其次，病毒空斑实验还可以用于
筛选抗病毒药物和研究病毒的致病机制，为病毒性疾病的防治提供
理论支持。

此外，病毒空斑实验还可以应用于病毒基因工程和病毒
载体的构建，为基因治疗和疫苗研发提供技术支持。

总之，病毒空斑实验是一种重要的病毒学研究技术，通过该实验可以深入了解病毒的感染和复制机制，为病毒性疾病的防治提供重要的理论基础和技术支持。

希望通过本文的介绍，读者对病毒空斑实验的原理和应用有所了解，为病毒学研究和病毒性疾病的防治做出贡献。

病毒蚀斑技术

病毒蚀斑技术病毒蚀斑，又称空斑，是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。

将适当稀释的病毒悬液接种敏感的单层细胞，再在单层细胞上覆盖一层固体介质，例如琼脂糖、甲基纤维素等，则当病毒在最初感染的细胞内增殖后，由于固体介质的限制，只能进而感染和破坏邻近的细胞。

经过几个这样的增殖周期，就将形成一个局限性的肉眼可见的变性细胞区，直径小到1～2mm，大至3～4mm，这就是蚀斑。

某些病毒在一般单层细胞培养内不形成CPE，但是却可在加入覆盖层后形成可见的蚀斑。

因此可用蚀斑方法进行此类病毒的检测。

混悬于琼脂等固体介质中的稠密细胞，在接种病毒后，也可产生蚀斑。

为了便于观察，常在覆盖琼脂中加入使细胞着染的染料。

这些染料或着染死细胞而不染活细胞，如台盼蓝；或着染活细胞而不着染死细胞，如中性红。

中性红是蚀斑技术中最常应用的一种染料。

这种染料在中性时呈红黄色，偏碱时变黄，偏酸时呈玫瑰色。

在以中性红着染的细胞培养瓶内，当蚀斑长到1mm直径以上时，可在白色衬底上清楚看到红色背景中不着色的蚀斑。

某些病毒，例如新城疫的某些变异株和SV40病毒感染的细胞，其对中性红的亲和力反而高于未感染细胞，因此可形成红色蚀斑。

从理论上讲，一个病毒粒子可以形成一个蚀斑。

反过来说，每产生一个蚀斑，也就是说明原接种物中含有一个活的病毒粒子。

但是实际情况远非如此，因为并非每个病毒粒子都有感染和增殖的能力，操作过程中也常有许多病毒粒子灭活,而且即使是有增殖能力的病毒粒子，也不一定能够遇上合适的敏感细胞。

根据电子显微镜的观察，经常是几百个乃至上千个病毒粒子才能形成一个蚀斑，即使在最好的试验条件下，例如应用增殖力和抵抗力较高的病毒、敏感的细胞以及十分严密和适当的实验条件，也需几十个病毒粒子才能产生一个蚀斑。

因此，以蚀斑形成单位(PFU)表示病毒悬液中的感染病毒浓度，似乎更为确切，例如说某个病毒悬液每ml含有108个PFU……等等。

病毒蚀斑技术的原理，实际上就是将病毒悬液作连续的10×稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂，待其出现蚀斑后计数，即可算出病毒悬液中每ml所含的蚀斑单位。

病毒空斑纯化步骤

猪流行性腹泻病毒(PEDV)纯化分离方案(1) 将已准备好的VERO细胞消化均匀铺于6孔板中。

(2) 细胞长成单层后吸去培养液，将病毒做10倍稀释，共做5个梯度并向每孔滴加0.4ml稀释好的病毒液, 置37℃吸附2小时后弃残液。

(3) 制备2％的琼脂糖（PCR电泳胶一样的琼脂糖），置40－50℃水浴待用。

(4) 将上述琼脂糖和双倍维持液（1:1）混合后，加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成覆盖层。

(5) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱培养48h。

(6) 制备含0.002％中性红的2%琼脂糖：双倍维持液（1:1），置40－50℃水浴待用。

(7) 吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成第二覆盖层。

(8) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养，48小时内观察结果。

(9) 挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。

主要问题：1、铺完琼脂糖层之后，24h之后细胞轮廓模糊，不清晰。

48h之后有些孔的细胞基本上看不清了，但是这都不是病毒造成的。

（支原体的存在会不会导致这种情况）2、使用中性红染色在一开始就染色还是等病毒造成一定的噬斑再染色，覆盖一层还是两层琼脂糖层？3、使用的琼脂糖是不是有问题，与琼脂区别大不大？4、之前按照这个方法加了中性红的琼脂糖层之后，细胞着色很不理想。

看不出明显的染色区域，只是有些红色的点点。

5、温度不会出现问题，因为把握的很好，细胞不会被烫死的。

就是不知道自己配制的液会不会由于渗透压的原因导致细胞死亡。

6、一直拿不出照片的原因就是没法看到空斑，板孔中不能显示出一个一个比较像样的噬斑，我挑也是挑病变情况有点不一样的病灶。

7、8、（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）9、。

病毒空斑纯化

病毒空斑纯化病毒蚀斑如同噬菌体的噬斑，一个蚀斑为一个病毒体的繁殖后代品系。

在细胞培养中做蚀斑是一种较精确的测定病毒感染的方法，将病毒各稀释度种入单层细胞瓶，吸附1h，在单层细胞上覆以营养琼脂培养基，病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。

但由于琼脂的限制只能感染临近的细胞，形成“蚀斑”的退化细胞区，经中性红活细胞染料着色后，活细胞显红色，而蚀斑区细胞已退化步着色，形成不染色区域。

凡是能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可以采用蚀斑技术来分离和测定。

蚀斑技术在测定病毒感染时是很好的定量方法，也是测定干扰素和抗体中和病毒繁殖能力的一种非常敏感的方法。

此外还可以用来纯化病毒，纯化时挑选合适的空斑进行传代即可。

若目的是要提高病毒能力，应选大空斑，若是为了减毒以制备疫苗应挑选小空斑，但每瓶空斑数不得超过20-40个。

试验时，培养瓶应翻转培养，以防止水滴在琼脂面流动，以免各个蚀斑交叉融合，中性红应在蚀斑出现前加入，在暗处孵育，以防止染料抑制病毒和破坏细胞。

对那些生长缓慢的病毒蚀斑，中性红则不是加在最初的覆盖层里，而是加在经过几天培养后的最后一层覆盖层上，可使培养物维持更久，甚至有的中间还得补加营养琼脂覆盖层1-2次。

蚀斑使用的琼脂往往有少量抑制物而影响蚀斑的产生，应将琼脂用单蒸水浸泡过夜，再用单蒸水冲洗2-3次，而后用去离子水冲洗1-2次后，用Hanks液配制成3%浓度，煮沸1h 除菌备用。

有人在试验时补加25mmol的MgCl2或CaCl2及1mmol的半胱氨酸，可加强肠道病毒形成蚀斑。

而MgCl2的加强作用最强。

流感病毒纯化（蔗糖梯度法）概论转头选择密度梯度选用一、概论在密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。

梯度液的密度随着离心本经的增大而增加。

密度梯度可以予形成，也可以在离心过程中自形成，经常，密度梯度的可以分为：速率一区带（Rate-30nal）离和等密度（Isopycnic）离心。

病毒的纯化与保存

之充分沉淀后应用。
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凝胶吸附法-氢氧化锌凝胶
是由7 mol/L氨水与0.1 mol/L醋酸锌溶液滴加混合(pH8.5)制备，在制备后数小时内较稳定。
方法：将水泡性口炎病毒悬液与氢氧化锌凝胶混合，使它们形成复合体后沉淀，然后用0.08mol/L EDTA(pH8.5)解离回收
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1、释放病毒到胞外 1.1 容易释放病毒(培养液/尿囊液)
1.2 不容易释放病毒(细胞破碎) 2、去除细胞碎块
低速离心，以2000～6000r/min离心30～ 40分钟，可除去90％以上的细胞碎片和杂质
3、病毒悬液浓缩
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细胞破碎方法(熟悉)
超声破碎：密集的小气泡迅速炸裂，破坏细胞高压匀浆：机械切割力高速珠磨：玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂酶溶法：溶菌酶、蛋白酶、葡聚糖酶化学渗透：渗透压改变使细胞破裂反复冻融：形成冰晶，使细胞膨胀破裂
4) 1000 r/min 离心10分钟，上清即是浓缩的病毒悬液。
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葡聚糖柱层析法(熟悉)
葡聚糖凝胶是指由葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。
最常见的是Sephadex 系列，主要型号是G-10 ~ G-200，后面的数字是凝胶的吸水率(单位是 mL / g 干胶)乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5mL/g 干胶。
(2)液体浓缩法
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聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握)
(3)固体浓缩法将PEG固体覆盖于装有病毒悬液的透析袋上，进行浓缩。透析袋孔径大小
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超过滤法(熟悉)
原理：利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将大分子或病毒等颗粒截留。

空斑实验简介

3、空斑纯化3.1病毒TCID501）在离心管中用MEM将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-6。

2）将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8 孔，每孔接种100µl。

3）在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。

4）设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。

（100µl生长液+100µl细胞悬液）5）逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。

6）结果的计算，按Reed-Muench法。

Reed-Muench法距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）＝（91.6-50）/（91.6-40）＝0.8lg TCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。

3.2中性红溶液和DMEM营养琼脂的配制（1）中性红溶液的配制1）取中性红1g、NaCl 8.5g溶于1L超纯水中2）高压灭菌后分装保存于4℃冰箱中。

（2）DMEM营养琼脂的配制1）取2g琼脂糖于100ml超纯水中，微波炉中火2min溶解后摇匀，高压灭菌。

2）取小牛血清4ml、中性红3.3ml无菌操作加到100ml双倍DMEM中，37℃水浴30min，摇晃均匀。

3）溶解的2%琼脂置于44℃水浴30min，与双倍DMEM混合液混合后，置于44℃待用。

3.3铺6六孔板(1) 将已准备好的V ero细胞消化均匀铺于6孔板中。

(2)细胞长成单层后吸去培养液，每孔加2ml无血清维持液置于37℃1h。

(3)将病毒用无血清维持液做10倍递增稀释。

(4)吸去孔内维持液，按合适稀释度每孔滴加200μl稀释好的病毒液, 每个稀释度加两个孔，置37℃吸附1小时后弃病毒液。

空斑实验

问：我准备做病毒空斑实验，不知到怎样配置甲基纤维素覆盖培养液，敬请各位指教答：1、我是这么做的：24孔板VERO，HSV11）24孔板预板2）24h后，弃培养液，用hanks液洗1次3）接种病毒液0.1ml/孔4）放入37度5％CO2培养箱1h，期间每15min慢摇一次，使病毒充分吸附5）加入1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基，放入37度5％CO2培养箱继续培养6）3天后，吸弃培养基7）加入5％甲醛1ml/孔固定4min，弃甲醛，加入结晶紫0.8ml/孔染色20min8）自来水缓缓冲洗染液，计算孔斑数2、我的老师做空斑试验也是用甲基纤维素，不过浓度是2%，配置方法是：甲基纤维素：3克溶于150ml 蒸馏水中，最终浓度为2%；染色用的碘液：25g溶于500ml95%的乙醇中。

最终浓度为5%做出的效果很好。

不过甲基纤维素要提前很长时间配置，大约2周，高压后放入冰箱，使用前无菌操作加入培养液，混匀放入冰箱，过一天后再拿出，使劲摇匀，使纤维素达到一种匀质的状态，静置至起泡完全消失后使用。

染色可以用中性红0.1%（w/v)温箱孵育2-3小时，若是6孔板每孔加1ml;倾倒后即可计数。

问：“1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基，放入37度5％CO2培养箱继续培养”是指把1％甲基纤维素直接加入已放好培养基的孔里，还是甲基纤维素和培养基混好再加入细胞中？配方比例是什么？甲基纤维素要提前很长时间配置，大约2周为什么？什么时候可以计数了？以什么为标准呢？答：1、1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基应是指按1ml/孔的量加甲基纤维素覆盖培养基。

甲基纤维素覆盖培养基应该就是指Viscous medium,它是一种专门培养基。

简单的说就是在普通细胞培养液里面添加了甲基纤维素来提供粘性,甲基纤维素应非营养物质。

因甲基纤维素难溶，所以要先配并灭菌好甲基纤维素溶液。

然后在无菌条件下往其中补加其他培养基所需成分，注意MEM 配的是10×的，这样要加的MEM 溶液体积就少的多。

空斑纯化——精选推荐

空斑纯化/计数
1.病毒的稀释与接种
病毒液用冷DMEM 10倍倍比稀释。

待单层MDCK细胞长到90%-100%时，吸弃细胞培养液，用PBS冲洗2次，每孔每次0.1ml。

选择不同稀释倍数的病毒液接种细胞，每孔0.2ml，每个稀释度做3个孔，37℃吸附1h。

2.覆盖琼脂培养液
将含有双抗的DMEM与2%琼脂液等量混合，并加入TPCK-Trypsin，使其终浓度为2ug/ml。

吸弃病毒液后，将覆盖液铺盖于单层细胞表面。

4℃放置10min，待琼脂凝固后，将琼脂层向上，置37℃培养4-5天，并逐日观察。

3.挑斑/染色计数蚀斑
对光观察，出现蚀斑后，对蚀斑做出标记，用枪头将蚀斑连同琼脂一起挑出，溶解于适量PBS，可进一步利用鸡胚或MDCK细胞繁殖病毒。

当蚀斑出现且数量不再增加时，每孔加0.2ml 0.1%中性红染色4h，由于中性红可使活细胞着色，病毒感染灶则形成无色蚀斑。

（也可用1%的结晶紫染色染十几分钟即可）计数时选择蚀斑不融合，分散呈单个，数目在10-30个/孔的细胞孔，分别计算计算各病毒稀释度的蚀斑数，并求3个孔的平均值，按下列公式计算：
感染性病毒量（pfu/ml）=每孔内蚀斑数/每孔接种病毒量×病毒稀释倍数。

实验技术-空斑纯化方法步骤以及若干问题

材料和试剂：DMEM培养基，细胞板，中性红，琼脂糖，PBS或无抗无血培养基，1ml和10ml 移液管等。

操作步骤：1 PK15细胞铺细胞板，细胞密度要较高，才容易形成空斑（但太高了也不好，有可能会形成很多层细胞，导致有的细胞形成病变的地方有其他层的细胞没有坏死也被染色从而无法形成空斑）。

2 过夜后，用无抗无血的培养基清洗洗吧，然后再进行病毒吸附，原液进行10倍倍比稀释，自己可以摸索一下感染稀释度，一般病毒价较低的时候，可以降低稀释度。

看空斑形成情况，要是空斑形成太大，连成片，就得增加稀释度。

3 吸附1-2小时，用无抗无血培养基（或无菌PBS）清洗2-3遍后配制第一次覆盖液。

使用1.6%的琼脂糖（加热至液体状）和两倍DMEM溶液等体积混合，逐滴加到细胞板中。

没孔加入1-2ml覆盖液。

放置于37度培养箱中培养。

4 每天观察细胞病变情况，出现明显病变时进行二次覆盖，覆盖液和第一次差不多，只是要加入细胞染色液中性红（0.1%），一般体积比为10ml：10ml：1ml （可以适当增加一点，如果染色效果不良的话）。

5 染色5H以上应该就可以观察染色情况，理论上伪狂犬病毒应能形成白色空斑而PCV2不会产生空斑。

在不知道PCV2在哪里的情况下，我们随机挑取若干个没有空斑的细胞，而后进行传代。

应该可以得到无伪狂犬污染的PCV2病毒种。

1 蚀斑实验需要细胞长至什么程度可以接毒？显微镜下观察，一般情况下，铺满细胞板底部即可，这样不会造成空洞影响蚀斑观察。

不同的细胞不一样，一般时候是长满T25的细胞传一个六孔板，第二天就接毒。

2 细胞上用什么覆盖物？琼脂？琼脂糖？低熔点琼脂糖？浓度应该是多大？我用的是lonza公司的低熔点琼脂糖，终浓度是0.75%。

感觉不错，就是挺贵的，2k+人民币。

3 如果做挑斑纯化，是不是就不可以染色，染色后对毒力有何影响？不染色就可以看出来，因为培养基本身里面就含有酚红呈现颜色，形成的斑没有颜色，可以直接挑斑；我也染色后挑过，感觉影响不大，可能不同病毒不一样吧。

病毒纯化浓缩方法

病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。

将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。

（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。

（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。

（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。

将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。

同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。

另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。

（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。

（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。

（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。

管底可见少量的半透明或白色沉淀。

将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。

（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。

（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。

（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。

病毒空斑实验原理

病毒空斑实验原理
病毒空斑实验是一种常用的分子生物学实验方法，用于研究病
毒的感染机制、复制过程以及宿主细胞对病毒的抵抗能力。

该实验
通过在宿主细胞中引入病毒基因组的部分序列，观察病毒基因组在
宿主细胞中的复制和表达情况，从而揭示病毒与宿主细胞之间的相
互作用关系。

下面将介绍病毒空斑实验的原理及操作步骤。

首先，进行病毒空斑实验需要准备病毒基因组的部分序列，通
常是通过PCR扩增或合成基因片段的方式获取。

这些基因片段可以
是病毒的基因组的一部分，也可以是编码病毒蛋白的基因。

接下来，将这些基因片段与适当的载体连接，构建成重组质粒。

这些重组质
粒可以是质粒载体，也可以是病毒载体。

然后，将构建好的重组质粒转染至宿主细胞中，使其表达病毒
基因组的部分序列。

在转染后的一段时间内，观察宿主细胞的生长
情况，以及病毒基因组的复制和表达情况。

如果病毒基因组的部分
序列对宿主细胞有毒性，那么在转染后的一段时间内，宿主细胞会
出现空斑，即细胞死亡区域。

最后，通过对空斑进行染色或其他适当的检测方法，可以观察
到病毒基因组的复制和表达情况。

通过比较不同条件下空斑的形成情况，可以揭示病毒基因组的复制和表达机制，以及宿主细胞对病毒的抵抗能力。

总之，病毒空斑实验是一种重要的研究病毒感染机制的实验方法，通过该实验可以揭示病毒与宿主细胞之间的相互作用关系，为病毒的防治和治疗提供重要的理论依据。

希望本文介绍的病毒空斑实验原理及操作步骤能够对相关研究工作提供帮助。

5.病毒的培养与纯化

四、病毒的培养和纯化
同微生物学其他学科分支一样，病毒学的进步完全得益于
研究方法和技术手段的发展。

通过病毒的分离与纯化获得纯化的、有感染性的病毒制备物
是病毒学研究和实践的基本技术。

1、病毒的培养
病毒的培养：二元培养物法
1、病毒的培养
培养液
细菌培养液变清亮
噬菌体细菌培养物
营养琼脂平板
细菌平板成为残迹平板若是噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，
经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局
部透明区域，即噬斑（plaque）。

如同对细菌计数一样，形成的噬菌斑也可用于对
噬菌体的数目进行估算。

1、病毒的培养
动物病毒实验动物
鸡胚
多种细胞培养
1、病毒的培养
大多数动物病毒感染敏感细胞
培养能引起其显微表现的改变
，即产生致细胞病变效应
（cytopathic effect,CPE），例如
细胞聚集成团、肿大、圆缩、
脱落，细胞融合形成多核细胞，
细胞内出现包涵体（inclusion
body），乃至细胞裂解等。

1、病毒的培养
若标本经过适当稀释进行接
种并辅以染色处理，病毒可
在培养的细胞单层上形成肉
眼可见的局部病损区域，即
蚀斑（plaque）或称空斑。

1、病毒的培养
植物病毒敏感植物叶片产生坏死斑，或称枯斑
四、病毒的培养和纯化
2、病毒纯化
病毒是有感染性的生物体
标准纯化的病毒制备物应保持其感染性病毒具有化学大分子的属性
纯化的病毒制备物的理化性质应具有均一性。