第4章 RNAi

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RNAi 的机制
• 现 已 初 步 阐 明 dsRNA 介 导 的 同 源 性 靶 mRNA降解过程主要分为三步。
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RNAi 的机制
• 第一步（起始阶段），较长ds RNA在
ATP参与下被Dicer酶切割成21~23nt，
由正义和反义链组成，即小干扰RNA
（small interfering RNA，siRNA）。
2006年10月2日 瑞典卡罗林斯卡医学院宣布，将2006年诺
贝尔生理学，医学奖授予两名美国科学家 安德鲁·菲尔和
克雷格·梅洛，以表彰他们发现了RNA干扰现象。
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RNAi广泛存在于自然界
• 1999 年 , Hamilton 等 在 植 物 基 因 沉 默 的 研 究 中 首 次 发
现,21～25nt 的dsRNA的出现对转基因导致基因沉默十分重
第4章：RNA i
CQMU
2013.Sep
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Contents
一 二 三 四 概述
发现过程
机制和特点 应用 实践
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一 概述
• RNAi是植物、果蝇、线虫和很可能包括哺乳动物在
内的许多生物抵抗病毒感染和限制转座子运动的一种
自然存在的防御机制。 • RNAi可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗 传工具，来制备特定基因缺失表型的个体, 从而研究 该基因的功能。它正在功能基因组学领域掀起一场真 正的革命,并将彻底改变这个领域的研究步伐，为此被 SCIENCE评为2002年最重要的科研成果之一。
扩增
பைடு நூலகம்30
RNAi 的特点
转录后水平的基因沉默。针对的是成熟mRNA. 较高的特异性。能够非常特异地降解相应的单
个内源基因的mRNA。 高效性。相对少量的dsRNA就可以使相应的基 因表达受抑制。
作用广泛。RNAi效应可以突破细胞的界限， 在细胞间传递，并可传递给子一代。
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四、RNAi的应用
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• 在哺乳动物细胞中用siRNA (21-23核苷酸长的小
分子干扰ＲＮＡ片段(small interfering RNA，
siRNA，又被称为引导RNA)能高效阻断某个特
定基因的表达，这项技术在疾病的基因治疗上也
有光明的应用前景。特别可以用于阻断某些突变 基因的表达或者由蛋白过量表达引起的疾病。
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体外实验二
• 从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中，Hammond等人
部分纯化了一种能特异切割ｄｓＲＮＡ的ＲＮａｓ ｅⅢ家族的核酸酶(Ｄｉｃｅｒ) ，该核酸酶具有序列 特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序 列的mRNA。
• ＢｅｒｓｔｅｉｎＥｅｔａｌ.Ｎａｔｕｒｅ，2001, 409 (6818): 363—366
• 这与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。该 研究小组一直没能给这个意外以合理解释。
Guo S, Kemphues KJ. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell. 1995 May 19;81(4):611-20.
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RNAi作用的简单模型
切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可识别目的 mRNA。与相关蛋白结合，形成dsRNA-酶的复合物。
• 识别之后，目的mRNA与dsRNA的有义链发生互换， 原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复 合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位 置。
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Discovery of RNAi
Nature 1998 391:806-811
Double-stranded RNA
antisense
sense
Neg. control
Uninjected
inject
C. elegans Antisense RNA dsRNA
Mex-3 mRNA detection in embryos by in 14 situ hybridization
序列/EST同源的序列。 （3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因 需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的 siRNA序列。
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负对照
• 一个完整的siRNA实验应该有负对照。
• 作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相
同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。 • 通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，数据库比 对以保证它和其他基因没有同源性。
要,而在转基因正确表达的植株中则未出现。 • 随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥(Arabidopsis thaliana) 、水螅、涡虫( Planaria) 、锥虫( Trypanosomes) 、 斑马鱼( Zebrafish) 、果蝇(Drosophila) 、大小鼠和人体内等大 多数真核生物中。 • 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。
ds RNA Dicer酶 siRNA
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• 第二步（效应阶段）。siRNA 在ATP参与下被RNA
解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA
诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex， RISC)。RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切 酶、核酸外切酶等多种成分组成。
• 当dsRNA导入细胞后，被一种特异的核酸内切酶识别，
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• 核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又
产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核 从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。
酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，
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Digestion Efficiency Binding
蛋白复合体 siRNA RISC
siRNA解链
活化的RISC
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• 活 化 的 RISC 在 单 链 siRNA 引 导 下 识 别 目 的
mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从
siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割 靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步
降解，从而干扰基因表达。
结合目的mRNA mRNA 活化的RISC
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三、RNAi机制和特点
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体外实验结果的提示
体外实验一
• RNAi反应 中， 加 入的 dsRNA 被切 割为21-23核苷 酸长 的 RNA片段，后者会使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的 片段。 • Ｈ ａ ｎ ｎ ｏ ｎ ｄ Ｓ Ｍ ｅ ｔ ａ ｌ . Ｎ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ ,2000, 404(6775): 293—296 • ＺａｍｏｒｅＰＤｅｔａｌ.Ｃｅｌｌ,2000,101(1):25—33
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RNAi研究的一般技术路线
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• siRNA即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目标并
将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链RNA分子。 • 如何设计有效的siRNA一直是当前RNAi研究的热点， 不同的实验室有不同的结果。
根据所选用序列的不同，可将其分为编码区RNAi和 启动子区RNAi技术。
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1. 一般设计原则
（1）从mRNA 的AUG开始，寻找“AA”二连序列， 并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA 靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左 右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。 （2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或
者小鼠，大鼠等）进行比较，排除那些和其他编码
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RNAi的提出
• 1998，Fire et al • 材料：线虫
• 目的：同上
• 方法： 注射经过纯化的由T4和T7 RNA聚合酶体外转录 得到的ss-RNA; 注射经过纯化后的ds-RNA • 结果：
ss-RNA 引起微弱的抑制作用；
ds-RNA 比前者高两个数量级的抑制效果。
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• 分析： Guo S博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象， 以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是 由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引 起。 该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference， 简称RNAi）。
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二、发现过程
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P35S
色素基因
意外发现一
• 1990, Jorgensen et al,
重组 Ti质粒 ＋色素 基因 转化
• 材料：矮牵牛花 ( petunias)
• 目的：得到紫色更深的花 • 方法：构建强启动子色素基因（苯基苯乙
烯酮合酶）表达载体，导入牵牛花
• 结果：杂色（花变得更白）。 • 分析：所转基因（外源）和同源的内源基 因的表达都被抑制。这个现象称之为共抑制 （co-suppression）
Specificity
Degradation
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• 这种现象至少有3种机制：
• 1、Dicer酶将长dsRNA分子切成短的"初级" 短RNA（siRNA）。
• 2、siRNA在酶作用中，可多次应用，能提供 进一步放大。 • 3、短RNA可作为靶mRNA的引物，产生后代 "次级siRNAs"（靶序列直接扩增），并且这 样启动一个RNA诱导的RNA聚合反应。
繁殖
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意外发现二
• 1995,康乃尔大学Guo Su et al
• 材料：秀丽新小杆线虫（C. elegans）
• 目的：消除线虫第一次分裂的不对称性 • 方法： 反义RNA 特异性地阻断par-1基因的表达； 正义RNA 以期观察到基因表达的增强。