基因工程与食品产业总结

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基因工程的基本原理
(1)利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主 复 制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分 子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提 高其宏观表达水平。这里涉及到DNA分子拷贝复制以及 稳定遗传的分子遗传学原理。
(2)筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子 等基因的转录调控原件，并将这些原件与外源基因精 细拼接，通过强化外源基医因学p的pt 转录提高其表达水平。 18
基因工程（gene engineering)：
所谓基因工程，就是利用DNA体外重 组或扩增技术从供体生物基因组中分离 感兴趣的基因或DNA片段，或是经过人 工合成的方法获得基因，然后经过一系 列切割，加工修饰，连接反应产生重组 DNA分子，再将其转入适当的受体细胞， 以期获得基因表达的过程。
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工具酶和基因载体
1、基因工程的工具酶
➢ 限制性内切酶 ➢ DNA连接酶 ➢ DNA聚合酶 ➢ 碱性磷酸酯酶 ➢ S1核酸酶 ➢ 逆转录酶
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来自百度文库
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限制性内切酶（RE表示）
➢ 分类：
I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS位于染色体上，三
个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM （５—腺苷甲硫氨酸）。
EcoRI，HindIII
等。
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3. 基因是可以转移的； 4. 多肽和基因之间存在对应关系；
证明基因与氨基酸之间存在直接对应关系的第一个直接证据
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5. 遗传密码是通用的；
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6. 基因可以通过复制把遗传
信息传给下一代。
所谓“中心法则”，是指 遗传信息在细胞内的生物 大分子之间转移或传递的 基本法则。
4） 切口移位制备探针
其中用途2) 和3)常用大片段
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2、 基因工程载体
➢ 载体要求： ①在宿主细胞中能独立自主地复制； ②易从宿主细胞中分离纯化； ③其分子中有一段不影响自身扩增的非必需区域，
插在其中的外源基因可以进行复制和扩增。
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➢ 基因工程载体:
① 质粒载体plasmid: pBR322, pUC18/19；
中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切
酶活性(大片段亦称为Klenow片段, polIK)
2） 聚合酶活性，5’→3’, 要求3’-OH引物和模板
DNA，其延续性受反应条件的影响
3） 外切酶活性
E.coli polI用途：
1） 除去3’-端突起的单链DNA
2） 补齐5’-突起端
3） 合成第二条cDNA链
Pol I 参与DNA修复 pol II 同上 pol III 参与DNA复制
具3’→5’和5’→3’外切酶活性 具3’→5’外切酶活性 具3’→5’和5’→3’外切酶活性
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➢E.coli polI的特点：
1） 具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋
白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其
II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ. coli中这两
种基因位于质粒上。
III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成
一亚单位，限制酶是独立存在的。
上述三个系统中，只有II型限制酶具有相当高的核苷酸识别
特异性，因而被广泛用于基因工程中。
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➢限制性内切酶的定义、命名
定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指 II型限制酶。
末端种类：
① ３’-端突起，个数为２或４个核苷酸； ② ５’-端突起，个数为２或４个核苷酸； ③ 平齐末端。
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限制酶切末端特点 5’-突起末端：
EcoRI 5’—GAATTC—3’ 3’—CTTAAG—5’
3’-突起末端：
5’—GOH
PAATTC—3’
3’—CTTAAP
HOG—5’
Pst I 5’—CTGCAG—3’ 3’—GACGTC—5’
(3)选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的 翻译
调控原件，强化受体细胞中蛋白的生物合成过程。这些涉
及到基因表达调控的分子生物学原理。
(4)基因工程菌（细胞）是现代生物工程中的微型生物反应 器，在强化并维持其最佳生产效能的基础上，从工程菌 （细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微 型生物反应器的增值速度和最终数量，也是提高外源表 达产物产量的主要环节，这里涉及的是生物化学工程学 的基本理论体。
② 噬菌体载体phage: λ, M13, SV40；
③ 柯斯质粒载体cosmid: 人工组建，兼具λ、质粒 优点。
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三、基因工程理论基础
1、不同基因具有相同的物质基础； 基因是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。
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2. 基因是可切割的；
限制性内切酶 （Restriction Enzyme），如
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DNA 连接酶
➢T4 DNA连接酶
特点：只连接ds -DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基
用途：用于不同DNA分子的连接，形成重组DNA分子 1) 相同或相容粘性末端的连接 2) 平整末端的相连
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DNA聚合酶
➢E.coli 的DNA聚合酶系统
催化5’→3’方向合成DNA
命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编 号、分离顺序。
例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种名 称H. influenzae，“ｄ” 表示菌系为ｄ型 血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三种限制酶。
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➢限制酶的特点
识别顺序和酶切位点； 识别４-8个相连的核苷酸； 富含ＧＣ； 对称性；（回文结构） 切点大多数在识别顺序之内，也有例外； 限制酶切后产生两个末端，５’-Ｐ和３’-ＯＨ。
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基因工程基本技术
➢ 基因工程主要内容
基因工程的实现主要分为四个步骤： 第一步：目的基因的分离或制备：人工分离生物基因组群中
目的基因及内切酶定位切 割或人工酶促合成；
平端：
5’—CTGCA 3’—G
G—3’
ACGTC—5’
SmaI
5’—CCCGGG—3’ 3’—GGGCCC—5’
5’—CCC 3’—GGG
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GGG---3’ CCC—5’
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➢ 限制酶的用途
① DNA重组； ② 限制酶（物理）图谱绘制； ③ 突变分析（RFLP分析）； ④ 限制酶的部分酶切与完全酶切。