基因工程与食品产业

2、基因工程的发展概况 、
历史回顾： 历史回顾：
70年代初，DNA已可在体外被随意拼接并转回到细菌体内 70年代初，DNA已可在体外被随意拼接并转回到细菌体内 年代初 今天， 遗传和表达 。今天，人们在超市货价上可以买到保质期 很长的转基因土豆， 多利”克隆绵羊走进实验室， 很长的转基因土豆，“多利”克隆绵羊走进实验室，基 因工程正在使整个人类生活方式发生重大变革。 因工程正在使整个人类生活方式发生重大变革。 2000.6.26宣告人类基因组 工作框架图”绘制完毕。 宣告人类基因组“ 2000.6.26宣告人类基因组“工作框架图”绘制完毕。 目前还有许多有价值的微生物，动物， 目前还有许多有价值的微生物，动物，植物的测序工作 正在进行中。 正在进行中。
(3)选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译 (3)选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译 选择 mRNA 调控原件，强化受体细胞中蛋白的生物合成过程。 调控原件，强化受体细胞中蛋白的生物合成过程。这些涉 及到基因表达调控的分子生物学原理。 基因表达调控的分子生物学原理 及到基因表达调控的分子生物学原理。 (4)基因工程菌（细胞） (4)基因工程菌（细胞）是现代生物工程中的微型生物反应 基因工程菌 在强化并维持其最佳生产效能的基础上， 器，在强化并维持其最佳生产效能的基础上，从工程菌 细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入， （细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微 型生物反应器的增值速度和最终数量， 型生物反应器的增值速度和最终数量，也是提高外源表 达产物产量的主要环节， 达产物产量的主要环节，这里涉及的是生物化学工程学 的基本理论体。 的基本理论体。
2000年 法国科学家利用基因技术“制造” 2000年，法国科学家利用基因技术“制造”出了一只可以 发出绿色荧光的兔子“Alba”。应用了受精卵显微注射技术， 发出绿色荧光的兔子“Alba 。应用了受精卵显微注射技术， 水母身上采集了荧光蛋白，基因改良后， 从水母身上采集了荧光蛋白，基因改良后，使它的发光率 比原先提高了两倍，再将该基因植入到了兔子的受精卵中， 比原先提高了两倍，再将该基因植入到了兔子的受精卵中， 由此培养出了会发光的兔子Alba Alba。 由此培养出了会发光的兔子Alba。
II型限制酶的特点 表2.1 型 识别顺序和酶切位点；（位点特异性酶） 识别顺序和酶切位点；（位点特异性酶） ；（位点特异性酶 识别４ 个相连的核苷酸 个相连的核苷酸； 识别４-8个相连的核苷酸； 富含ＧＣ； 富含ＧＣ； 对称性；（回文结构） ；（回文结构 对称性；（回文结构） 切点大多数在识别顺序之内，也有例外； 切点大多数在识别顺序之内，也有例外； 限制酶切后产生两个末端， 限制酶切后产生两个末端，５’-Ｐ和３’-ＯＨ。 Ｐ ＯＨ。 末端种类： 末端种类： 端突起， 个核苷酸； ① ３’-端突起，个数为２或４个核苷酸； 端突起 个数为２ 端突起， 个核苷酸； ② ５’-端突起，个数为２或４个核苷酸； 端突起 个数为２ 平齐末端。 ③ 平齐末端。
二、工具酶和基因载体
1、基因工程的工具酶
限制性内切酶 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 碱性磷酸酯酶 S1核酸酶 S1核酸酶 逆转录酶
限制性内切酶（RE表示） 限制性内切酶（RE表示） 表示
分类： 分类：
位于染色体上， I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS位于染色体上，三 由三个基因构成， 个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP Mg2+、 ATP、 个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM 腺苷甲硫氨酸）。 （５—腺苷甲硫氨酸）。 II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ. coli中这两 II型 限制与修饰基因产物独立起作用， 种基因位于质粒上。 种基因位于质粒上。 III型 修饰酶与Ｉ型酶相同， III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成 一亚单位，限制酶是独立存在的。 一亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II型限制酶具有相当高的核苷酸识别 上述三个系统中，只有II型限制酶具有相当高的核苷酸识别 II型限制酶 特异性，因而被广泛用于基因工程中。 特异性，因而被广泛用于基因工程中。
证明基因与氨基酸之间存在直接对应关系的第一个直接证据
5. 遗传密码是通用的； 遗传密码是通用 通用的
6. 基因可以通过复制把遗传
信息传给下一代。 信息传给下一代。 所谓“中心法则”，是指 所谓“中心法则” 遗传信息在细胞内的生物 大分子之间转移或传递的 基本法则。 基本法则。
第二章 基因工程与食品产业
基因工程载体: 基因工程载体 质粒载体plasmid: pBR322, pUC18/19； ① 质粒载体 ； 噬菌体载体phage: λ, M13, SV40； ② 噬菌体载体 ； 柯斯质粒载体cosmid: 人工组建，兼具 、质粒 人工组建，兼具λ、 ③ 柯斯质粒载体 优点。 优点。
大肠杆菌质粒分子结构
所谓基因工程，就是利用DNA DNA体外重组或扩 所谓基因工程，就是利用DNA体外重组或扩 增技术从供体生物基因组中分离感兴趣的基因 DNA片段 片段， 或DNA片段，或是经过人工合成的方法获得基 然后经过一系列切割，加工修饰， 因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反 应产生重组DNA分子 再将其转入适当的受体 重组DNA分子， 应产生重组DNA分子，再将其转入适当的受体 细胞，以期获得基因表达的过程。 基因表达的过程 细胞，以期获得基因表达的过程。
HindIII HindIII BamHI BamHI PstI PstI SalI SalI ScaI ScaI
r Amp r
pBR322
(4.36 kb)
ori
大肠杆菌载体pBR322结构图 结构图 大肠杆菌载体
三、基因工程理论基础
1、不同基因具有相同的物质基础； 不同基因具有相同的物质基础； 片段。 基因是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段 基因是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。
基因工程(gene engineering)常和以下 基因工程(gene engineering)常和以下 名称混用: 名称混用:
遗传工程(genetic engineering)； 遗传工程 基因克隆(gene cloning); 基因克隆 分子克隆(molecular cloning); 分子克隆 基因操作(gene manipulation); 基因操作 重组DNA技术(recombination DNA technique)； DNA技术 重组DNA技术 克隆(clone): 克隆(clone): 作名词时是指含有某目的DNA片段 的重组DNA分子或含有该重组分子 的无性繁殖系。作动词时是指基 因的分离与重组过程。
2、 基因工程载体 、
载体要求： 载体要求： ①在宿主细胞中能独立自主地复制； 在宿主细胞中能独立自主地复制； ②易从宿主细胞中分离纯化； 易从宿主细胞中分离纯化； ③其分子中有一段不影响自身扩增的非必需区域， 其分子中有一段不影响自身扩增的非必需区域， 插在其中的外源基因可以进行复制和扩增。 插在其中的外源基因可以进行复制和扩增。
Biblioteka Baidu
限制酶切末端特点 5’-突起末端： 突起末端： 突起末端
EcoRI 5’—GAATTC—3’ 3’—CTTAAG—5’ 5’—GOH 3’—CTTAAP
PAATTC—3’ HOG—5’
3’-突起末端： 突起末端： 突起末端
Pst I 5’—CTGCAG—3’ 3’—GACGTC—5’ 5’—CTGCA 3’—G G—3’ ACGTC—5’
限制性内切酶的定义、 限制性内切酶的定义、命名 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指 II型限制酶。 型限制酶。 型限制酶 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、 分离顺序。 号、分离顺序。 例如： 例如：HindⅢ Ⅲ 前三个字母来自于菌种名 表示菌系为ｄ 称H. influenzae，“ｄ” 表示菌系为ｄ型 ， 血清型； 表示分离到的第三种限制酶。 血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三种限制酶。 表示分离到的第三种限制酶
人类基因组计划
这一价值30亿美元的计划旨在对人类基因组进行精确 这一价值30亿美元的计划旨在对人类基因组进行精确 30 测序，发现所有人类基因并确定其在染色体上的位置， 测序，发现所有人类基因并确定其在染色体上的位置， 明确所有基因的结构和功能，破译人类全部遗传信息， 明确所有基因的结构和功能，破译人类全部遗传信息， 使人类能够在分子水平上全面认识自我。 使人类能够在分子水平上全面认识自我。
第二章 基因工程与食品产业
第一节 基因工程概述 第二节 基因工程的原理及基本技术 第三节 基因工程在食品工业中的应用
第二章 基因工程与食品产业
第一节 基因工程概述 第二节 基因工程的原理及基本技术 第三节 基因工程在食品工业中的应用
第一节 基因工程概述
一、基因工程的概念及发展
基因工程（ engineering)： 1、基因工程（gene engineering)：
2. 基因是可切割的； 基因是可切割 可切割的 限制性内切酶 （Restriction Enzyme）， Enzyme），如 ），如 EcoRI，HindIII RI， 等。
3. 基因是可以转移的； 基因是可以转移 转移的 4. 多肽和基因之间存在对应关系； 多肽和基因之间存在对应关系； 对应关系
DNA 连接酶 T4 DNA连接酶 连接酶 特点： 特点：只连接ds -DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基 用途： 用途：用于不同DNA分子的连接，形成重组DNA分子 1) 相同或相容粘性末端的连接 2) 平整末端的相连
DNA聚合酶 聚合酶 E.coli 的DNA聚合酶系统 聚合酶系统 催化5’→3’方向合成DNA 催化 Pol I 参与DNA修复 pol II 同上 pol III 参与DNA复制 具3’→5’和5’→3’外切酶活性 具3’→5’外切酶活性 具3’→5’和5’→3’外切酶活性
平端： 平端：
SmaI 5’—CCCGGG—3’ 3’—GGGCCC—5’ 5’—CCC 3’—GGG GGG---3’ CCC—5’
限制酶的用途
重组； ① DNA重组； 重组 限制酶（物理）图谱绘制； ② 限制酶（物理）图谱绘制； 突变分析（ 分析）； ③ 突变分析（RFLP分析）； 分析 限制酶的部分酶切与完全酶切。 ④ 限制酶的部分酶切与完全酶切。
第一节 基因工程概述 第二节 基因工程的原理及基本技术 第三节 基因工程在食品工业中的应用
第二节
基因工程原理及基本技术
一、基因工程的基本原理
(1)利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复 (1)利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复 利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA 制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分 制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分 子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量， 子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提 高其宏观表达水平 这里涉及到DNA 宏观表达水平。 DNA分子拷贝复制以及 高其宏观表达水平。这里涉及到DNA分子拷贝复制以及 稳定遗传的分子遗传学原理。 稳定遗传的分子遗传学原理。 (2)筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、 (2)筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子 筛选 等基因的转录调控原件， 等基因的转录调控原件，并将这些原件与外源基因精 细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平。 强化外源基因的转录提高其表达水平 细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平。
E.coli polI的特点： 的特点： 的特点 1） 具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋 白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其 中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切 酶活性(大片段亦称为Klenow片段, polIK) 2） 聚合酶活性，5’→3’, 要求3’-OH引物和模板 DNA，其延续性受反应条件的影响 3） 外切酶活性 E.coli polI用途： 用途： 用途 1） 除去3’-端突起的单链DNA 2） 补齐5’-突起端 3） 合成第二条cDNA链 4） 切口移位制备探针 其中用途2) 其中用途 和3)常用大片段 常用大片段