微生物分离培养和菌种保藏
微生物菌种保藏的原理和方法
微生物菌种保藏的原理和方法一、原理：1.休眠状态：微生物菌种在低温下可进入休眠状态，减缓代谢活动，延长存活时间。
2.冷冻保存：通过降低温度到零下或较低的温度，减慢微生物体内化学反应速率，延缓其代谢活动和死亡过程。
3.干燥保存：通过去除菌种周围的水分，降低微生物体内化学反应速率，延缓其代谢活动和死亡过程。
4.冻干保存：先冷冻再干燥保存，通过冷冻降低微生物体内的水分活性，再通过干燥去除冻结水，使菌种能在实验室条件下保存较长时间。
二、方法：1.冷冻保存：（1）使用离心管或培养管制备菌种的蛋白质保护液，可以是细胞培养基、缓冲液等。
（2）将培养物转移到保护液中，使其悬浮均匀。
（3）加入保护剂，如甘油或DMSO（二甲亚砜），提高菌种的冷冻抵抗力。
（4）将混合物分装到小容器或冻存管中。
（5）使用特定的冷冻方案，将菌种快速冷冻，并存储在低温下，通常为零下80℃或更低的温度。
2.干燥保存：（1）用无菌技术转移到无菌条件下的试管中。
（2）将菌种培养在无菌的固体培养基上。
（3）收集培养物，将其平均分布在无菌试管或培养皿中。
（4）将试管或培养皿放在无菌的通风柜中，使培养物在无菌环境下干燥。
（5）将干燥的培养物贮存在干燥无菌容器中。
3.冻干保存：（1）将培养物转移到无菌离心管或培养皿中。
（2）使用细菌培养基将菌种制备为细菌悬浮液。
（3）在细菌悬浮液中加入保护剂，如蔗糖或甘露醇。
（4）将混合物分装到冻干瓶中。
（5）使用低温冷冻机将菌种冷冻为固体，再将其放入冻结干燥机中进行冻干。
（6）将冻干的菌种贮存在密封的冻干瓶中。
4.长期保存：通常，冷冻保存和冻干保存可以实现长期保存，但仍需定期检测和维护保存条件。
在微生物菌种保藏过程中，还需注意以下几点：1.选择合适的保存条件：根据菌种的特性和要求，选择适宜的保存方法和温度。
2.制备合适的保存液：保存液的配方和pH值应与菌种相适应，以保证菌种的存活和精确性。
3.保持无菌操作：在菌种保藏过程中，需保持无菌操作，以防止细菌污染。
水产微生物实验— 微生物的分离、纯培养与菌种保藏
实验四微生物的分离、纯培养与菌种保藏一、基础知识（一）微生物的分离自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。
人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态，也就是说培养物中所有细胞只是微生物的某一个种或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。
使用显微操作器单细胞挑取法可以直接得到纯培养。
稀释涂布平板法、稀释浇注平板法或平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。
后几种方法不需要特殊的仪器设备，一般情况下都能顺利进行，达到好的效果。
微生物的平板分离纯化技术自1880年Koch发明以来已有100多年的历史。
该技术的建立和发展为人类获得丰富的微生物资源以及在工、农、医、环境、动植物细胞培养等方面的应用作出了巨大贡献。
由此可见，一项新的重大的微生物学实验技术的建立会对整个生命科学带来革命性的变化。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有：平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理包括两方面：(1)选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度，温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
(2)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获取单个菌落的方法可通过解释涂面平板或平板划线等技术完成。
值得指出的是从微生物群体中经分离生长在乎板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
（二）微生物的纯培养不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各自特有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一。
了解它们的培养特征、掌握其生长规律对识别、控制和利用微生物具有重要价值。
菌种保藏方法
菌种保藏方法
菌种保藏方法，如下：
1、传代保藏，传代保藏菌种是微生物保存中最常用的方法之一。
很多微生物在低温或者干燥处理时，会很快死亡，为了保存菌种的活性，就要定期不断的进行菌种转接、培养后再保存。
2、斜面低温保藏，将待保藏的菌种接种在合适的斜面培养基上，在相应的条件下培养至得到充足的菌体或者孢子，随后密封试管置于4℃左右保存，具体保存温度按照保存菌种设定。
保藏时间依微生物的种类从1个月到4个月不等。
3、冷冻干燥保藏，冷冻干燥保藏法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，这种方法适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年。
我国大多数生物制品菌种都是采用该法保藏。
4、半固体穿刺保藏，配制半固体培养基，高压湿热灭菌后倒于无菌试管中至约1/3，待培养基凝固，用接种环从平面培养基上挑取单菌落，穿入培养基若干次。
在合适的条件下进行培养至菌体旺盛生长，之后密封试管，根据菌种特点在4 ℃左右或者凉爽干燥处保存。
保存时间至少可以达到
1 年，对于有些菌种甚至能达到20 年之久。
5、液氮超低温保藏，液氮超低温保藏法是菌种长期保藏的最有效最可靠的方法。
液超低温保藏法是把菌种装在含有冷冻保护剂的安瓶瓶内，将该安瓶瓶放人液氮（-196℃）中保藏。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。
传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。
常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。
方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。
保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤（5克）置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基（以含水量为土壤最大持水量的60%为宜），然后高压灭菌。
食品微生物8 微生物分离、纯化与保藏技术
（一）菌种保藏的目的
保持其原有性状和活力的稳定； 确保菌种不死亡、不变异、不被污染；
微生物检验基础技能训练模块 ——
8 微生物分离、纯化和保藏技术
菌种的保藏与菌种管理
（二）菌种保藏依据：
根据菌种的生理、生化特点，人为地创造低温、干燥、 缺氧、缺乏营养条件，使菌种的代谢活动和生长繁殖处 于受抑制的休眠状态。 保藏菌种的选取：选取优良的纯菌种，最好是用其分生孢 子或芽孢等休眠体，在其休眠和停止生长的条件下保藏。
菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
沙土管保藏流程：
菌种 斜面产孢 孢子悬浮液（≥106/ml ） 减压干燥
加入沙土管（ 0.3～0.5ml/管） 密封 4℃低温保藏
微生物检验基础技能训练模块 ——
8 微生物分离、纯化和保藏技术
菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
砂土管保藏法的特点
包藏初期，菌死亡率高，后逐渐减慢，存活下来的孢子在以后 保存期间稳定性较好。 适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌 对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。
(二)通过寄主体进行复壮
对于寄生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体病毒 等，由于长期使用，其毒力下降，导致杀虫效率降低及 衰退现象。 可以用菌种去感染菜青虫幼虫等，然后从致死的虫体上 重新分离，经过几次重复感染与分离，就可以逐步恢复 和提高毒力。
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8 微生物分离、纯化和保藏技术
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
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8 微生物分离、纯化和保藏技术
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8 微生物分离、纯化和保藏技术
微生物的分离培养和菌种保藏
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菌种保藏技术的改进
现有的菌种保藏技术存在一些局限性， 如长期保藏过程中菌种活力的下降等， 如何改进这些技术以提高菌种的保藏 效果是另一个挑战。
培养基和培养条件的优化
不同微生物对培养基和生长条件的需 求各异，如何优化这些条件以适应各 种微生物的生长是一个重要问题。
伦理和法规问题
在微生物分离培养和菌种保藏过程中， 可能涉及到伦理和法规问题，如人类 微生物、病原体和转基因微生物的管 理等。
未来的发展方向
开发新的培养方法和技术
随着技术的发展，未来将开发出更多新的培养方法和技术，以满足各 种微生物的培养需求。
提高菌种保藏效果
未来将致力于改进菌种保藏技术，提高菌种保藏效果，延长菌种寿命。
加强微生物多样性保护
未来将更加重视微生物多样性保护，采取有效措施保护珍贵的微生物 资源。
加强伦理和法规建设
选择性分离法
利用培养基或试剂的选择性抑 制某些微生物的生长，从而分 离出所需的特定微生物。
温度、酸碱度分离法
通过调节培养基的温度、酸碱 度等条件，使适应特定条件的
微生物得到分离。
微生物分离的步骤
1 2
采集样品
根据需要选择合适的微生物样品，如土壤、水、 空气等。
样品处理
将采集的样品进行适当的处理，如稀释、研磨等。
在医学和药学中的应用
抗生素耐药性研究
分离培养耐药性微生物，研究其耐药机制，有助于开发新的抗生 素药物。
疫苗制备
通过分离培养病原微生物，制备疫苗，预防和控制传染病。
药物筛选
生物安全实验室病原微生物菌(毒)种和生物样本的保存(保藏)
生物安全实验室病原微生物菌（毒）种和生物样本的保存（保藏）实验室进行实验活动时，经常需要保存病原微生物菌（毒）种及样本。
无论是短期还是长期保存，都应遵循安全、存活、生物学特性不变以及避免差错等原则。
一、保藏管理《条例》规定：“国务院卫生主管部门或者兽医主管部门指定的病原微生物菌（毒）种保藏中心或者专业实验室（以下称保藏机构），承担集中储存病原微生物菌（毒）种和样本的任务。
”保藏机构应当依照国务院卫生主管部门或者兽医主管部门的规定，储存实验室送交的病原微生物菌（毒）种和样本，并向实验室提供病原微生物菌（毒）种和样本。
《传染病防治法实施办法》规定："一、二类病原微生物菌（毒）种的供应由国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。
三类菌（毒）种由设有专业实验室的单位或者国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。
”2009年7月16日，卫生部颁布了《人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法》（原卫生部令第68号），《办法》规定保藏机构是指由原卫生部指定的，按照规定接收、检定、集中储存与管理病原微生物菌（毒）种或样本，并能向合法从事病原微生物实验活动的单位提供病原微生物菌（毒）种或样本的非营利性机构。
病原微生物菌（毒）种保藏机构应具有符合要求的生物安全实验室，包括既符合生物安全要求，又能够保证所保藏病原微生物菌（毒）种质量的设施、设备、技术操作人员和规章制度。
《浙江省病原微生物实验室生物安全管理办法（试行）》规定实验室设立单位应建立病原微生物菌（毒）种和样本保藏保管制度，落实安全责任部门和专人进行管理。
有关机构按照规定从事临床诊疗、疾病控制、检验检疫、教学和科研等工作，在确保安全的基础上，可以保管其工作中经常使用的病原微生物菌（毒）种或样本，其保管的病原微生物菌（毒）种或样本名单应当报当地卫生主管部门备案。
重点落实对高致病性病原微生物菌（毒）种和样本的安全保卫措施，加强安全管理与控制，设立专库专柜，单独储存，做好病原微生物菌（毒）种和样本进出和储存的记录，建立档案制度。
(完整word版)微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏实验
实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏一、实验目的和要求1。
了解微生物的分离纯化方法。
2.学习检测水中大肠菌群的方法。
3。
学习微生物的保藏及鉴定方法。
4。
熟悉革兰氏染二、实验原理多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管.乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气.1.初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养,24小时内小套管中有气体形成,并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群,为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
2。
平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。
3.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落,经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、实验器材及试剂1。
水样污水样本2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。
3、器材及耗材：双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等四、实验方法及步骤1。
第一天实验前的准备1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL,并加入产气管.配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。
2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。
于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。
3）称取一定量的液体石蜡,约为锥形瓶的三分之一。
于121℃高温高压灭菌20分钟。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。
菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。
(一)常规保藏方法1 目的1.1 了解菌种保藏的基本原理1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。
2 原理菌种保藏的方法很多。
其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。
使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。
依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。
一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。
3 材料3.1菌株待保藏的适龄菌株斜面3.2培养基肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。
3.3 试剂10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。
3.4 器具用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l 毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。
4 流程斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏5 步骤5.1斜面保藏5.1.1流程标记试管→接种→培养→保藏5.1.2步骤5.1.2.1贴标签取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。
在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。
在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.1.2.2斜面接种将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。
5.1.2.3培养置37恒温箱中培养48小时。
5.1.2.4保藏斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。
这种方法一船可保藏三个月至半年。
5.2半固体穿刺保藏5.2.1流程标记试管→穿刺接种→培养→保藏5.2.2 步骤5.2.2.1贴标签取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.2.2.2穿刺接种用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。
微生物培养及保藏标准操作规程
1. 目的规范微生物使用及保藏的相关操作，避免二次污染。
2. 范围适用于企业内所有微生物的使用及保藏3. 职责微生物保管人员负责保藏，质量监督员监督执行情况。
4. 内容4.1培养基需经验证合格后准许使用，使用前需灭菌。
4.2质检菌种的培养及菌种保藏4.2.1大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌的活化及培养固体平板法：选用适用细菌培养的培养基（如：LB培养基；营养琼脂培养基等）灭菌。
酒精灯旁打开融化的无菌培养基瓶口，在酒精灯火焰上通过2~3次后，打开无菌平皿上盖，在酒精灯火焰上在开口处灼烧2~3次，将培养基到入平皿中，盖上平皿上盖，水平放在超净台上冷却完全凝固后使用。
每次倒平板尽量将培养基到完，并及时放回冰箱4℃保存。
点燃酒精灯，酒精灯外焰灼烧接种针（环），烧至通红，冷却后，在酒精灯旁用接种针（环）轻轻挑取待活化的菌种，进行划线培养。
待长出单菌落，挑取单菌落进行液体振荡培养过夜。
平板制备示意图菌种划线培养示意图4.2.2黑曲霉的培养黑曲霉的培养选择马铃薯葡萄糖培养基，将土豆洗净去皮，切成小块，加入水煮沸20min 后，纱布过滤，清液中加入琼脂粉加热溶解后加入葡萄糖。
待葡萄糖溶解后，分装在试管中，塞上管塞，高压蒸汽灭菌后，将试管摆斜面等凝固后接种使用。
接种时用接种环挑沾取黑曲霉孢子，并在试管斜面上由内向外划波浪线。
接种完毕后塞回试管塞并在霉菌培养箱中进行培养，一般5-7天长出孢子。
孢子长出后，放置在4℃冰箱中保藏。
斜面固体培养基的制备接种环的灼烧示意图试管斜面的接种示意图4.2.3菌种的保藏菌种保藏可分为液体甘油保藏及试管斜面保藏。
大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌都采用甘油菌保藏法。
黑曲霉孢子悬液可做甘油保藏。
甘油保藏：接种环灼烧冷却后，挑取单菌落进行过夜增值培养16-18h。
移液器吸取1ml 新鲜培养物于1.5ml离心管中，4500r/min常温离心5min，弃上清。
中国医学微生物菌种保藏管理办法
中国医学微生物菌种保藏管理办法根据中国微生物菌种保藏委员会管理和组织条例的规定，为了加强医学微生物菌种(以下简称菌种)的保藏管理，特制定本管理办法。
第一条组织及任务在卫生部领导下，在中国微生物菌种保藏委员会指导下，设下列医学微生物菌种保藏管理中心:中国医学真菌菌种保藏管理中心:由中国医学科学院皮肤病防治研究所负责。
中国医学细菌菌种保藏管理中心:由卫生部药品生物制品检定所负责。
中国医学病毒菌种保藏管理中心:由中国预防医学中心病毒学研究所负责。
保藏管理中心的任务是:(一)负责本门类微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应;(二)开展菌种分类、鉴定及保藏管理的研究;(三)组织学术交流和经验交流;(四)办理国内外菌种交换;(五)编制保管的菌种目录。
保藏管理中心下设专业实验室，承担全国性的业务工作。
专业实验室对其直接领导机构和保藏管理中心负责，并定期向管理中心汇报工作情况。
其具体任务是:(一)负责本专业有关微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应;(二)承担本专业有关疑难菌种鉴定;(三)开展有关菌种分类、鉴定、保藏的研究，包括新技术、新方法的研究和应用;(四)办理对外交流和交换菌种。
各专业实验室科研技术人员的编制和经费由所属主管部门负责。
生物制品生产、检定用的菌种按"生物制品生产、检定用菌种、毒种管理规程"执行，统一由卫生部药品生物制品检定所办理。
第二条菌种的分类菌种的分类根据其危险性决定(包括实验室感染的可能性，感染后发病的可能性，症状轻重及愈后情况，有无致命危险及有效的防止实验室感染方法，用一般的微生物操作方法能否防止实验室感染、我国有否此种菌种及曾否引起流行、人群免疫力等情况)。
依其危险程度的大小，我国的菌种分为四类。
一类:实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌种。
实验六七食品微生物培养基的制备和灭菌微生物的分离培养和菌种保藏
实验六微生物培养基的制备和灭菌实验项目性质：综合实验所属课程名称：《微生物学实验》实验计划学时：5学时一、实验目的1.了解并掌握培养基的配制、分装方法；2.掌握各种实验室灭菌方法及技术。
二、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。
另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。
加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。
但多次反复融化，其凝固性降低。
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。
一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
三、实验材料1、器皿及材料天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。
2、药品试剂蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。
3、流程称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。
四、实验步骤1 培养基的制备1.1 称量药品根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。
蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
1.2 溶解用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。
待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。
中国医学微生物菌种保藏管理办法
病原微生物菌（毒）种和样本的重要性段丽莉. 菌种保管应有专人负责，保存于冰箱中，房门专人加锁，确保菌种安全。
保管人员变动时，必须严格交接手续。
2、菌种应有严格的登记，包括形态，分离日期，鉴定日期，签发者，主要鉴定性能（包括形态、染色、抗原结构、动物致病力等），并注明使用、转移、销毁情况及原因。
3、各种菌种应按规定时间接种，一般在接种三次后作一次全面的鉴定，注意菌种有无污染及变异，如发现变异时，应及时更换。
4、菌种保存范围及向外单位转移，应按国家卫生部规定执行。
5、所有存在菌种应具备清单。
编写：审核：批准：批准日期：主要内容病原微生物菌（毒）种和样本是国家重要生物资源，是保障生物安全和国家经济安全与稳定的重要战略资源。
是人类传染病预防、诊断和治疗以及医学科研和教学事业的基础和重要支撑条件，也是保障食品安全、生物安全以及抵御生物恐怖袭击的前提条件。
病原微生物菌（毒）种和样本病原微生物菌（毒）种和样本由于其本身所具有的特殊性，在其采集、携带、运输、保藏管理和使用过程中必须强调生物安全，必须符合国家传染病防治、医学微生物菌（毒）种管理有关法规的规定。
其管理不仅强调在硬件设备上要符合微生物安全防护的要求，更重要的是强调所有管理人员、工作人员在日常工作中要有常备不懈的防护意识和守法观念。
菌（毒）种分类按照微生物结构、组成分为三大类：原核细胞型微生物：细菌、支原体、立克次体、衣原体、螺旋体和放线菌。
真核细胞型微生物：真菌非细胞型微生物：病毒中国医学微生物菌种保藏管理办法第二条菌种的分类菌（毒）种的分类根据其危险性决定的对实验室感染的可能性；人体感染后发病的可能性；发病后症状轻重及愈后情况；有无致命危险及有效的防止实验室感染方法；用一般的微生物操作方法能否防止实验室污染；我国有否此种菌种及曾否引起流行人群免疫力等情况。
依其危险程度的大小，我国的菌(毒)种分为四类。
中国医学微生物菌种保藏管理办法第二条菌种的分类一类：实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌（毒）种。
微生物菌种选育技术和保藏
矿物盐、丙酸钠、硫胺素（M3 琼脂）
链霉菌，微单孢菌 马杜拉放线菌、小双孢菌、
链孢囊菌 诺卡氏菌
红球菌、小单孢菌
广泛应用的选择培养基。
①、几丁质培养基： 分离土壤和水中放线菌。 但测试过的500株链霉菌和其他放线菌中，只有
25％的菌种具有强的水解几丁质的能力。 许多放线菌生长在能利用几丁质的可作为放线菌
接种已富集的培养物到固体培养基，可将优势微生物分离 出来。
方法的原理是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生 长或不利于其他菌型生长的条件。
移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。
例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。 但应注意的是，所需类型的菌种生长的结果有时 会改变培养基的性质，从而改变选择压力，使其 他微生物也能生长。通过把富集培养物接种到新 鲜的同一培养基可以重新建立选择压力。
菌种选育是一门应用科学技术，其理论基础是微生物遗 传学、生物化学等，而其研究目的是微生物产品的高产优质 和发展新品种，为生产不断地提供优良菌种，从而促进生产 发展。所以，育种工作者要充分掌握微生物学、生物化学、 遗传学的基本原理和国内外有关的先进科学技术，灵活而巧 妙地将其运用到育种中去，使菌种选育技术不断更新和发展。
用涂石蜡的棒置于碳源 培养基中 花粉 蛇皮 人的头发
水、土壤、粪 肥
土壤、根土
水
海水、污泥 发霉的稻草
土壤 土壤
土壤 土壤 土壤 土壤
分离出的菌体
嗜粪红球、小单孢菌 属等
链霉菌属、马拉杜菌 属、小双孢菌属
小Байду номын сангаас孢菌属、内孢高 温放线菌 链霉菌属 嗜热放线菌
链霉菌属 链霉菌属
诺卡氏菌 游动放线菌属
菌种保藏操作规程
菌种保藏操作规程目的：规范微生物学标准菌种和野生菌种的保藏。
职责：微生物检验员负责菌种的保藏、确认、传代、使用等。
范围：本规程适用于标准菌种的管理和实验过程中分离纯化的野生菌种。
编制依据：1.实验室生物安全通用要求(GB19489-2008)2.实验室质量控制规范食品微生物检测(GB/T 27405-2008)；3.中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供的菌种保藏方法；4.《微生物学实验(第四版)》沈萍、陈向东主编，高等教育出版社；5.《食品微生物实验技术》，牛天贵主编，中国农业大学出版社；本中心主要采用斜面定期移植法、液体石蜡法、甘油冷冻保藏法、瓷珠保藏法四种方法对各类型标准菌种或野生菌种进行保藏，其详细操作如下：1斜面定期移植法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4-6C进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1.1试剂、培养基种类a.营养肉汤或BHI培养基适用于所有细菌(除真菌外)的增菌；b.营养琼脂平板适用大肠杆菌，枯草芽抱杆菌，金黄色葡萄球菌等的培养；c.沙氏葡萄糖液体培养基适用于酵母、霉菌的增菌。
沙氏葡萄糖琼脂培养基适用于酵母、霉菌的培养。
1.2试剂、培养基制备a.按照说明书要求溶解培养基并调pH值。
b.将配好的培养基趁热分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一（4-5mL）,穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
c.将试管加硅胶塞，外面包扎一层牛皮纸并注明培养基名称及配制日期。
根据要求将培养基灭菌，高压蒸汽灭菌121C, 15-20min0d.斜面摆放：灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
e.无菌检查：将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30C培养1-3天。
无菌检查合格后将其保存于4C下备用。
1.3接种a.点接：把菌种点接在斜面中部偏下方处。
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用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。倒置于28～ 300C条件下培养6～7d，观察放线菌菌落形态及计数菌落， 并计算出每g土壤中放线菌的数量（方法同上）。
挑取单个菌落，接种于相应的斜面培养基上，如果不纯，再 移植纯化，至最后得到纯培养为止。
微生物分离培养和菌种保藏
实验程序7
（微生物的分离—平板涂抹法）
微生物分离培养和菌种保藏
实验程序8
（微生物的分离—平板划线法）
每组取无菌培养皿2付，在皿底贴上标签，注明事项。取已熔化 的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿，制成平板。
凝固后，用接种环取相应的 菌液一环（10－5或10－6）在平板上 划线（教师作示范）。 1.连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续 划线（图－5）。完毕后，倒置于28～300C温室培养。 2.分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在 培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约600C 角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作 第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线（见图－5）。 划线完毕，盖上皿盖，倒置于28～300C温室培养。
将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指和掌心 将两支试管的棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中，然 后让试管口缓缓过火焰。
将已灼烧过的接种环伸入外侧的菌种试管内。先冷却， 而后再用环沾取一定量的菌苔，将沾有菌苔的接种环抽 出试管。
微生物分离培养和菌种保藏
实验程序13
（微生物的接种方法—斜面接种法）
微生物分离培养和菌种保藏
试验程序11
（微生物的接种方法—斜面接种法）
微生物分离培养和菌种保藏
实验程序12
（微生物的接种方法—斜面接种法）
左手平托两支试管，拇指按住试管底部。外侧使是菌种 试管，内侧是待接的空白斜面。（两支试管的斜面同时 向上），右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。
右手拿接种环，在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有 可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。
0.5％重铬酸钾液
微生物分离培养和菌种保藏
实验程序
微生物的分离 微生物的接种方法（示范） 微生物培养中的氧气条件 微生物的菌种保藏方法 四大类微生物菌落形态的比较和识别
微生物分离培养和菌种保藏
实验程序1
（微生物的分离）
用稀释平板法（又名混菌法）从土壤中分离真 菌。
用平板涂抹法分离土壤中的放线菌（土壤稀释 液制备同上）。
实验七
微生物的分离、培养和菌种保藏
微生物分离培养和菌种保藏
微生物的分离、培养和菌种保藏
目的要求 实验材料 试验程序 思考题
微生物分离培养和菌种保藏
目的要求
初步掌握微生物的分离、培养和菌种保藏 的基本方法。
练习微生物接种、移植和培养的基本技术， 掌握无菌操作技术。
微生物分离培养和菌种保藏
实验材料
样品：新鲜土壤。 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、淀粉琼脂培养
基、马铃薯蔗糖培养基（10mL装）。 无菌水：带有玻璃珠装有45mL无菌水三角瓶、装有9mL
无菌水的试管。 其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、台天平、
记号笔、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、胶水、水浴锅。 试剂：5000U/mL链霉素液
挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最
后得到纯培养。
微生物分离培养和菌种保藏
实验程序9
（微生物的分离—平板划线法）
微生物分离培养和菌种保藏
实验程序10
（微生物的接种方法）ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、 试管深层固体培养基的穿刺接种法。
接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种 铲或接种锄、玻璃涂棒等（见图－6）。 图－6
微生物分离培养和菌种保藏
实验程序3
（微生物的分离—稀释平板法）
图－1 土壤稀释液的制备和稀释液的取样
微生物分离培养和菌种保藏
实验程序4
（微生物的分离—稀释平板法）
涂平板：每组取培养皿2付，即每个同学做一只。 1.先在无菌培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、 班级。 2.另取一吸管，以无菌操作法吸取10－4或10－5土壤稀释液1mL， 加在无菌培养皿的一边，在皿的另一边加入2滴5000U/mL的链 霉素液。此时两液严防相混。 3.取已熔化的在水浴锅中保温500C左右的马铃薯蔗糖培养基2管， 分别倒入上述培养皿中（见图－2），轻轻转动培养皿，使菌液、 链霉素液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后， 倒置于28～300C恒温培养5～6d。观察真菌菌落形态以及计数 菌落。并计算出每g土壤中真菌的数量。即用某一培养皿内真菌 的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即得。
挑取单个菌落，接种到斜面培养基上作纯化和性能测定，若不纯， 需要继续分离。
微生物分离培养和菌种保藏
实验程序5
（微生物的分离—稀释平板法）
微生物分离培养和菌种保藏
实验程序6
（微生物的分离—平板涂抹法）
每组取无菌培养皿2付（每个同学做一只）。在皿底贴上标签， 注明分离菌名、稀释度、组别、班级。
以无菌操作法先在培养皿中加入0.5％重铬酸钾溶液2滴，取 已熔化的淀粉琼脂培养基2管，分别倒入培养皿，使培养基与 重铬酸钾充分混匀，铺平，制成平板。
用平板划线法分离土壤中的细菌（土壤稀释液 的制备同上）。
微生物分离培养和菌种保藏
实验程序2
（微生物的分离—稀释平板法）
制备土壤稀释液：(无菌操作过程见教师示范） 1. 称取土壤5g，放入45mL无菌水的三角瓶中，振荡 10min，即为稀释10－1的土壤悬液。 2. 另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10－2、10 －3、10－4、10－5、10－6。取已稀释成10－1的土壤液，振 荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10－2 的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混 匀，即成10－2土壤稀释液。同法依次连续稀释至10－4 10－5 10－6土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，应用一支吸管由浓到稀，稀释到底，稀 释方法见图-1。