马铃薯病毒的RT-PCR检测技术评述

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马铃薯的茎尖脱毒、复壮及RT-PCR检测

马铃薯的茎尖脱毒、复壮及RT-PCR检测马铃薯病毒一直是困扰其种植的难题，最有效的方法就是进行马铃薯脱毒。

本文就马铃薯脱毒种薯采取了如下列技术措施：首先将带毒薯在室内催芽、消毒处理，然后在无菌条件下，切取茎尖分生组织，移植于试管中培养，大约4个月后，茎尖分生组织长成试管苗；试管苗经过病毒检测，从大量植株中鉴定出不带病毒的脱毒苗；再经过切段快繁，及温室和网棚内繁殖，获得脱毒微型小薯或原原种；再繁殖即可获得原种，原种再繁殖成一级种薯、二级种薯和三级种薯，经过上述途径获得的种薯一般统称为脱毒种薯。

由于马铃薯脱毒苗茎尖分生组织体积较小（约0.5mm），所以在马铃薯茎尖脱毒的过程中经常存在成苗率低、畸形化严重等问题。

基于这些现象，本试验以新疆农科院核生所提供的马铃薯品系A1、A2、D17、F3为研究对象，对形成茎尖脱毒苗所需的各种培养基类型进行了详细研究，结果表明：MS+0.05mg／L 6-BA+0.5 mg／L NAA+0.1 mg／L GA<sub>3</sub>培养基对处理后的茎尖成活率和成苗率有较大的促进作用。

为了检测所获得的茎尖再生苗是否为脱毒苗，本文利用反转录PCR方法对再生苗进行了检测。

首先用Trizol试剂盒提取植株总RNA，通过设计特异性引物进行反转录PCR，检测在马铃薯再生苗中是否存在PVX、PVY、PVS病毒DNA，最终确定是否获得脱毒苗，以建立检测马铃薯病毒的快速简易的方法。

为了使马铃薯脱毒试管苗生长健壮并在需要时能大量结薯，本文在培养基中添加了植物生长延缓剂B9，研究了其对试管苗生长状况和扦插后的马铃薯微型薯结薯数的影响。

实验结果表明：品系A1和A2在测量范围内都出现了最大值，具体表现为当B9浓度分别为60mg／L和80mg／L时出现了最大的马铃薯微型薯数，品系F3却随B9浓度的增加结薯数有所减少，而品系D17的马铃薯微型薯数则在测量范围内一直出现递增趋势。

马铃薯S病毒的RT-PCR检测

３甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃．
摘
要：根据马铃薯ｓ病毒（Ｖ）Ｐｓ的外壳蛋白基因序列，设计合成了一对寡核苷酸引物。以感染ＰＳ的马铃Ｖ
薯组织和健康的组织为材料，对提取植物总ＲＡ的两种方法进行了比较，并对总ＲＡ的提取方法进行改进。获ＮＮ得了纯度较高，完整性较好的总ＲＡＮ。以此为模板，进行ｃＮＤＡ合成及ＰＲ扩增，从感病组织扩增得到一段长Ｃ
度约６２ｂ４ｐ的特异ＰＲ扩增产物，与理论设计的外壳蛋白基因大小一致，而健康组织无此扩增产物。从而建立Ｃ了检测ＰＳ快速灵敏简便的新方法，在基因水平上为ＰＳ的检测提供了新手段。ＶＶ关键词：马铃薯ｓ病毒；反转录一聚合酶链式反应；病毒检测
吴丽萍Ｉ，王蒂，司怀军，王化俊，路平，贾笑英・ ’ ，一一，２
（．１甘肃农业大学农学院，甘肃兰州７０７：２甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃３００．兰州７０７３００）兰州７０７；３００
ＴＩＯ试剂法提取ＲＡ的具体方法如下：称ＲＺＬＮ取１０ｇ０样品，迅速在液氮中研磨成粉末，ｍ然后加入１ＬＴＩＯ研磨成匀浆组织；倒入１Ｌ．ｍＲＺＬ０．ｍ离５
心管中，室温放置５ｍｉ，４ｃ１００ｒｍｉ－ｎｃ下２０・ｎ，离
本文比较了２种总ＲＡ提取方法及ＰＳ的Ｒ — ＮＶＴ
生产。马铃薯ｓ病毒（Ｖ）ＰＳ是影响马铃薯产量和品质的主要病毒之一，分布广泛，在世界各马铃薯种

加工番茄马铃薯Y病毒一步法RT—PCR检测及CP基因的克隆与序列分析

８０７ｂｐ，ａｎｄｃｏｕｌｄｅｎｃｏｄｅａｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈ２６８ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＣＰｇｅｎｅｏｆＰＶＹｓｔｒａｉｎｗｅｅｒａｎａｌｙｚｅｄｗｉｔｈｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｔｏｏｌｓ，ａｎｄｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｖａｒｉａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｓａｍｏｎｇｄｉｆｅｒｅｎｔＰＶＹｓｔｒａｉｎｓｗｅｅｒｐｒｏｖｅｄｕｐ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｅｅｓｒｕｌｔｓ．ＰＶＹｗｈｉｃｈｉｌｆｅｃｔｅｄｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｔｏｍａｔｏｉｎＸｉｎ —
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｓｔｕｄｙａｎａｌｙｚｅｓｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＹｐｅｖｒａｌｅｎｃｅｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｔｏｍａｔｏｉｎＸｉｎｊｉａｎｇｂｙｔｈｅｏｎｅ・－ｓｔｅｐｅｖｒｅｓｒｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ・－ｐｏｌ・・ｙｍｅａｓｒｅｃｈａｉｎｅａｒｃｔｉｏｎ（ＲＴ－ＰＣＲ），ｔｈｅｅｓｒｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ２５％ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｔｏｍａｔｏｃｏｕｌｄｂｅｉｎｆｅｃｔｄｅｗｉｔｈＰＶＹ．ＴｈｅＣＰｇｅｎｅｉｎｃｌｕｄｅｄ

RT-PCR技术及其在马铃薯病毒检测中的应用

南
方
Agricultu re
第1卷第6期
V ol.1 N o .6
2007 年11 月
Nov. 2007
S o u th C h in a
专题论述
同时检测多个目的片段。多重RT-PCR一次反应即可以检测出多个不同的病原物，效率要比普通PCR 高得多。但
保守序列，对于株系间分子变异大的病毒应注意。如对同种病毒的不同株系进行检测，则应选择该株系的特异
专题论述
南
方
农
业
第1 卷第6期
V o l.1 N o .6
2007 年 11 月
Nov . 2007
South China Agriculture
RT-PCR 技术及其在马铃薯病毒检测中的应用
冯众‘ 何建2 聂振朋3，于莉娟‘ ，，桑有顺’ (‘ 成都市农林科学院作物研究所，成都611130; 2 四川省农业科学院园艺研究所
黑条矮缩病毒，结果显示RT-PCR是斑点杂交法灵敏度的10倍。陈建军等[3 ]比较RT-PCR, IC-RT-PCR和DAS究进展很快。吴兴泉[ 1 [ 等利用RT-PCR技术扩增得到了 6
PVX cp基因，并进行序列测定，同时采用RT-PCR 方法 ELISA (Double antibody sandwich enzyme-linked 和核酸斑点杂交(NASH)方法对PVX进行了分子检测， immunosorbent assay) 3种测萄叶毒I 的检葡卷病 II 方建立快速、灵敏、特异的PVX分子鉴定与检测技术。俞法，显示RT-PCR可用来检测病毒含量极低的或其它两键[7等对传统的马铃薯病毒RNA苯酚提取法进行改进， 1 种方法无法检测出的病毒，在灵敏性和可靠性上均为最同时设计优化单管RT-PCR方法，依据PVY和PVS的基佳。唐科志等(4利用一步法RT-PCR技术检测柑橘裂皮因组保守序列设计2套特异性引物， 1 对染病的马铃薯叶病类病毒，经过与生物学鉴定和聚丙烯酞胺凝胶电泳片组织进行检测，结果证明这种新型马铃薯病毒诊断方 (PAGE)方法的比较，表明RT-PCR方法检测周期短、灵法具有可靠、快速、便等简特点。关翠萍 1 [8运用一步法敏度高，有利于对类病毒在春季和冬季浓度低时进行快 RT-PCR对马铃薯和烟草中的PVX, PVY和PLRV进行了速准确的检测。检测，其灵敏度较两步法RT-PCR高100倍左右，建立了

免疫试纸条结合RT-PCR法快速检测马铃薯Y病毒

免疫试纸条结合RT-PCR法快速检测马铃薯Y病毒摘要：利用马铃薯Ｙ病毒免疫试纸条，对ＰＶＹ进行了快速检测，结果表明，试纸在２ｍｉｎ内，可特异性检出ＰＶＹ，而健康的叶片无反应。

刮下试纸条上显示的检测带，进行ＲＴ－ＰＣＲ，能扩增到与预期大小相同的ＤＮＡ条带，是对快速检测试纸条检测结果的验证。

关键词：马铃薯Ｙ病毒；免疫试纸条；ＲＴ－ＰＣＲ中图分类号：Ｓ４３２．４＋１；Ｑ５０３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11405－1056-02ＴｈｅＲａｐｉｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＰｏｔａｔｏＶｉｒｕｓＹｂｙＩｍｍｕｎｏｓｔｒｉｐＡｓｓａｙａｎｄＲＴ－ＰＣＲＺＨＵＹｕｎ－ｆｅｎ１，ＣＨＥＮＧＱｕｎ１，ＳＨＥＮＹａｎ－ｆｅｎ１，ＭＡＺｕｏ－ｊｉａｎｇ１，ＷＡＮＧＥｒ－ｈｕｉ１，ＷＥＩＫａｉ２Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＹｗａｓｒａｐｉｄｌｙｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｓｔｒｉｐaｓｓａｙ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅＰＶＹｃｏｕｌｄｂｅｔｅｓｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｓｔｒｉｐｗｉｔｈｉｎ２ｍｉｎｕｔｅｓａｎｄｎｏ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｒｄｆｏｒｈｅａｌｔｈｙｌｅａｖｅｓ．ＲＴ－ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｕｌｄｐｒｏｄｕｃｅａｓｐｅｃｉｆｉｃＤＮＡｂａｎｄｗｉｔｈａｎｅｘｐｅｃｔｅｄｓｉｚｅ，ｗｈｉｃｈｗａｓａｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｉｍｍｕｎｏｓｔｒｉｐ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＹ；ｉｍｍｕｎｏｓｔｒｉｐ；ＲＴ－ＰＣＲ我国是世界上马铃薯生产第一大国，近年来，马铃薯产业发展迅速，在国民经济增长中占有重要比重，但现阶段马铃薯整体生产水平低于世界平均水平［１］，其主要原因是受马铃薯病毒的影响。

马铃薯为营养体繁殖，病毒在寄主体内随继代繁殖而逐渐积累，导致马铃薯种性退化，产量严重降低，块茎大小、形状、口感等原有品质下降，影响马铃薯的商品性。

实时荧光RT—PCR方法检测马铃薯V病毒

Ｋｉｔ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅｌａＴｉｍｅ）为ＴａＫａＲａ产品；荧光定量ＰＣＲ仪为
ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０Ｉ１型。
人扩散。马铃薯Ｖ病毒可通过生物学接种方法进行检测，如接种在番茄、德氏烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｄｅｂｎｅｙｉ）或马铃薯野生种Ａ
１．１．１供试材料
马铃薯Ｖ病毒、马铃薯Ｙ病毒、马铃薯Ａ
薯表现轻或较重的花叶、叶背生绿斑或环，部分叶脉坏死，对
马铃薯的生产构成严重威胁，被我国政府列为进境检疫性有害生物。随着马铃薯产业的不断发展，我国已成为世界上
病毒、李痘病毒及马铃薯ｘ病毒阳性材料由中国检验检疫科
年来，出现的实时荧光ＲＴ— ＰＣＲ（ｒｅｌ— ａｉｔｍｅｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰＣＲ）
外壳蛋白基因保守序列设计，由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成，扩增产物长度约为１６４ｂｐ，序列如下：马铃薯Ｖ病毒Ｆ：５一ＣＧＧ－ＴＡＴＧＧｒＩＴＩＴｒＧＧ１ＡＧＡＡＡ邢ｃ一３，马铃薯Ｖ病毒Ｒ：
设计引物和ＴａｑＭａｎ探针，通过特异性及灵敏度试验建立该病毒的实时荧光ＲＴ — ＰＣＲ检测方法。该方法检测灵敏度高，至少可检测到３６ｐｇ／的总ＲＮＡ；对马铃薯Ｖ病毒、马铃薯Ｙ病毒、马铃薯Ａ病毒、李痘病毒及马铃薯ｘ病毒具有良好的特异性。该方法快速、灵敏、无需任何ＰＣＲ后处理且交叉污染风险小，可用于马铃薯Ｖ病毒的快速检测。

单酶法RT—PCR检测马铃薯纺锤块茎类病毒

Ｒａｉ４Ｎｓ５ＵＬ，ｎ（）２止ｄＰ（０ｍｍｏ／，ｐｄＯ和２止Ｍ＿Ｉ（０ｕＬ，７℃ ＮＴｓ１ｌＬ）４ＬｄＨ２Ｍｕ２）３ｖ
水浴１５ｈ７．后０℃ １ｉ终止反应。０ｍｎ（）ｃ２ＰＲ体系为缓冲液２止，反转录产物２止，上游引物１
作者柚介：叶
￣（９６，男，在读博士研究生，主要从事遗传工程研究。＊为责任作者、系人。ｔ一）７联
维普资讯
华
北
农
学
报
１７卷
１２．常规Ｒ－Ｃ．３ＴＰＲ检测Ｐ１Ｓ’ ｖ
（）１反转录反应体系中含有５核酸抽提液，２Ｌ引物（０ｐｏ）４止缓冲液，１ｆ２ｍ１，Ｌｌ
１材料和方法
１１材料．
患病番茄植株（品种Ｒｔｅ）ｕｇｒ的叶子，由天津农科院蔬菜研究所提供；无毒马铃薯试管苗津引薯９号本实验室保存。
１２方法．
１２１ＰＴ．．ＳＶ抽提
参照文献［］进行。６
３，下游引物：５－Ｇ－＇Ｃ
ｍ／１６ｔ，ｄＴＰ１ｎＬ）．ＬＮｓ（０ｍｍｏ／）．．，ｄＩ２１７＊ｌＬ０４ｐＬｄＩ１．５止，Ｔｑ（＂Ｏａ４ｕＬ１２ｋ）．５
加入３Ｌ石蜡油，反应条件：１０２ｍｎ００ ℃ ｉ冰浴２ｍｎｉ之后７２℃５ｍｉ９ｎ４℃ １ｍｉ３ｎ７℃ ２ｍｉ７ｎ２℃ １ｍｉ１ｎ０个循环（转录阶段）反
录阶段退火温度在３ ℃ 、循环数不少于ｌ次的情况下，Ｃ扩增能得到一条相关特异带。经７０ＰＲ

马铃薯三种主要病毒的ELISA和RT-PCR检测技术的研究

马铃薯三种主要病毒的ELISA和RT-PCR检测技术的研究马铃薯是世界上重要的食物作物之一，也是我国主要的经济作物之一。

然而，马铃薯生产中常常受到病毒的威胁。

病毒感染会导致马铃薯产量下降、品质降低甚至全面减产。

因此，准确快速地检测病毒感染对于指导马铃薯的种植和防控病害具有重要意义，可以提供科学依据、减少经济损失和保证农作物的质量安全。

马铃薯主要受到三种病毒的感染，分别是马铃薯病毒Y (Potato Virus Y, PVY)、马铃薯块茎坏死病毒 (PotatoVirus X, PVX)和马铃薯花叶病毒 (Potato Leafroll Virus, PLRV)。

传统的病毒检测方法包括生物学观察法、传统PCR等。

然而，这些方法存在耗时、复杂、低灵敏度等问题。

因此，研究人员对使用ELISA和RT-PCR等技术进行马铃薯病毒检测进行了深入研究。

ELISA法是一种高效的酶联免疫吸附法，利用抗原与特异抗体结合，通过比色反应检测样品中是否存在目标病毒。

ELISA方法具有高度敏感性和特异性，且结果易于观察和分析。

针对马铃薯病毒检测，研究人员首先制备了目标病毒的抗原，并将其与马铃薯样品中的病毒结合，然后添加酶标记的二抗，形成抗原-抗体-酶标记-底物复合物。

最后，通过添加酶底物，观察是否有颜色反应产生。

ELISA法不仅操作简便、检测速度快，而且可以批量检测多个样品。

但是，ELISA法的敏感性对样品前处理和样品质量要求较高。

与ELISA法相比，RT-PCR法可以在基因水平上对目标病毒进行检测。

RT-PCR法首先需要提取马铃薯样品中的总RNA，然后通过反转录将RNA转化为cDNA，再进行聚合酶链反应扩增。

PCR反应中使用特异引物，使得目标病毒的RNA序列扩增得到特异性产物，经过电泳分析可以确定是否存在目标病毒。

RT-PCR法具有快速、准确、高灵敏度和高特异性等优点，可以在较短的时间内对多个样品进行检测。

但是，RT-PCR法技术门槛较高，操作复杂，需要专业的实验室和设备。

马铃薯病毒RT-PCR检测体系的建立

现代农业科技
２１年第２期０１１
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
农业基础科学
马铃薯病毒Ｒ — ＣＴＰＲ检测体系的建立
陈阳婷桑有顺
（川省成都市农林科学院，川成都６１３）四四１１０
摘要依据马铃薯病毒ＰＳＰＸ、ＬＶ、Ｖ的ＣＶ、ＶＰＲＰＡＰ保守序列设计特异性引物，马铃薯病叶组织中提取出病毒总ＲＡ，行ｃＮ从Ｎ进ＤＡ合成和ＰＲ扩增．到了与预期片段长度一致的ＰＲ特异扩增产物，立了能够同步检测ＰＳＰＸ、ＬＶＰＡ的Ｒ — Ｃ多重检测体Ｃ得Ｃ建Ｖ、ＶＰＲ、ＶＴＰＲ系。方法对ＰＳＰＸ、ＬＶ、Ｖ扩增出的靶带大小分别为４５６５２２３０ｐ凝胶电泳易辨另区分。究结果表明，该Ｖ、ＶＰＲＰＡ３、２、２、０ｂ，研该方法特异性好、灵敏度高、速简便。快为马铃薯病毒的高效检测提供了有效手段。关键词马铃薯病毒；ＴＰＲ；测体系；立ＲＣ检建中圈分类号Ｓ３．２：４１３文献标识码Ａ４５３￥ — ０文章编号１０ — ７９２１）１０１ — ３０７５３（０１２ — ０５０
ｓｏｄｔａａｅｉｃｓｎｉｖｅｅｔｇｍｅｈｄａｄｑｉｋｒｓｍｐｅ．ｒｖｄｄａｆｃｉｅｍｅｈｄｏｔｅｄｔｔｎｆｒｏａｏｖｒｓｈｗｅｔｔＳｓｃｆ，ｅｓｉｅｄｔｃｉｔｏｕｃｅ，ｉｌｒｔｏｉｅｎｅｅｔｔｏｈｅｅｉｔｔｉ．ｈｉＷａｐｉｔｎｎＩｐｆｖｆｃｏｏｐｕＫｅｒｓｐｔｔｉｓｓＲＴＰＲ；ｅｅｔｎｓｓｅ；ｓａｌｈｎｙｗｏｄｏａｏｖｒｅ； — Ｃｄｔｃｉｔｍｅｔｂｉｍｅｔｕｏｙｓ

三重RT-PCR快速检测多种马铃薯病毒的研究

ｂ（Ｖ）３ｐＶ）０ｐＶ）２ｐＬＶ大小的扩增片段。结果表明，ｐＰＸ、５（Ｓ、０ｂ（Ａ、２ｂ（Ｒ）４ｂＰ３Ｐ２Ｐ反转录反应中ｄＴｓＮＰ浓度和ＰＲ反应中Ｍ２Ｃｇ对＋整个反应的影响最大；其次是退火温度；循环条件对Ｒ — ＣＴＰＲ影响较小。化的三重Ｒ — Ｃ优ＴＰＲ反应体系为马铃薯病毒的检测提供了一种快速、灵敏、的方法，马铃薯病毒的早期检测和防治提供了有效手段。简便对关键词：马铃薯；ＴＰＲ病毒检测Ｒ—Ｃ；
ａｒｖｒｒｎｃｉｔｎｓｇ（ＴｎｈｔｅｅｓｔｓｒｉｔｅＲ）ａｄｔＭｃｎｅｔｔｎａＰＲｓｇａｒａｉｐｃｏｈｅｃｏｅａｐｏａｅｏｃｎｒｉｔＣｔｅｈｄａｇｅｔｍａｔｎｔｅｄｔｔｎａｏａｅｉ
四川成都６０４；３四川农业大学，１０１．四川雅安６５１）２０４
摘要：依据马铃薯Ｘ病毒、病毒、ＳＡ病毒及卷叶病毒的基因组ＲＡ保守序列设计特异性引物对，从反转录反应中ｄＴｓＮＮＰ浓
度、退火温度、ＣＰＲ反应中Ｍ浓度、循环条件４方面优化三重Ｒ — ＣＴＰＲ反应条件，可以同步扩增出上述４种病毒，分别得到６０２
ＣＨＥＮＹａｇｔｇ，ＮＧｎＺＨＡＮＧｉ。ｎ－ｉ ’ ＮＩｎＨｏｇ，ＭｎｆＩｓｉｔｏ１ｎｔｕ．ｔｅｆＨｏｔｕｔａｃｅｃ，ｈｎｄｃｄｍｇｉｌｒｎｏｓｙＳｉｃｓＣｅｇｕ６０２ＲＣｒｃｌｒｌｉｎｅＣｅｇｕＡａｅｙｏｒｕｔａａｄＦｒｔｃｎｅ，ｈｎｄ１０ＺＰ；ｉｕＳｆＡｃｕｌｅｒｅ２ＳｃｕｎＰａｔｕｒｔｅＳ￣ｉ，ｈｎｄ１０１ＰＣ３ＳｃｕｎＡｒｕｔｒｎｖｒｔＹ＂２０４ＰＣ．ｉａｌａａｉｔｏＣｅｇｕ６０４，Ｒ；．ｉａｇｉｌａＵｉｓｙａａ６５１，Ｒ）ｈｎＱｎｎｎｈｃｕｌｅｉ，ｎ

RT

RT PCR技术对宁夏马铃薯脱毒种薯病毒检测的研究作者：聂峰杰詹红张丽宋玉霞巩檑甘晓燕陈虞超石磊张国辉来源：《植物保护》2016年第05期摘要病毒病是影响马铃薯生产的重要病害，为了解宁夏地区马铃薯种薯生产中的病毒发生情况，在银川市、固原市和西吉县不同种植模式的脱毒种薯生产基地，对不同品种的原原种、原种、一级种在不同生育期随机采集样品，利用RTPCR检测技术对4种马铃薯主要病毒PVX、PVY、PVS、PLRV和类病毒PSTVd进行检测。

结果表明：PVX、PVY、PVS、PLRV在3个基地均有不同程度检出，成熟期病毒检出率分别为35%、28%、35%和34%，未检出PSTVd；4种病毒检出率在马铃薯现蕾期以后呈现显著性增长；病毒检出率随着种薯繁育级别增加差异显著；6个马铃薯品种均为感病品种；大田种植种薯的病毒检出率显著高于防虫网室。

关键词马铃薯；病毒检测； RTPCR病毒病是危害马铃薯生产的重要病害，在全世界马铃薯产区均有分布。

目前，已发现的马铃薯病毒、类病毒有近40种[1]，我国常见的有8种，包括马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y 病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯皱缩花叶病毒（PVM）、马铃薯古巴花叶病毒（PAMV）和马铃薯纺锤形块茎类病毒（PSTVd）[23]。

马铃薯受病毒侵染后主要表现为花叶、卷叶、植株矮小、叶片失绿、块茎变小、龟裂、内部网状坏死等，严重时种薯失去发芽能力，病毒逐代积累引起马铃薯品种退化，产量和品质下降，一般引起减产20%～30%，如果多种病毒混合侵染可造成减产80%以上[45]。

目前马铃薯病毒病的防治主要包括生产脱毒种薯、抗病毒品种选育和施用抗病毒药剂，其中生产脱毒种薯是控制马铃薯病毒病最有成效的手段[67]。

但在脱毒种薯生产中，病毒病的发生与马铃薯品种、脱毒种薯级别、种植地区和生产管理等有很大的相关性，病毒的种类和生产环境也密切相关。

马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的RT—PCR检测

纺锤块茎类病毒（ＰＳＴＶｄ）强系减产可达６０％，弱系减产约
究使用韩国ＩＮＴＲＯＮ生物化学制药公司生产的ＰＳＴＶｄ检测试剂盒，旨在通过试验说明使用该试剂盒提取植物ｍＲＮＡ具
有方法简便、省时、灵敏度高等优点，而且可以对不同的马铃
影响其生长。试验结果表明，完全黑暗条件不利于愈伤组织的形成，适宜的光照条件能刺激叶片细胞脱分化，加快愈伤组织的形成，
２０％～３５％，常常因此造成较大的经济损失。马铃薯类病毒是马铃薯种薯检疫规程中的主要检疫对象，具有广泛的传播途径，是唯一不能通过茎尖剥离、组织培养而汰除的病毒，必须通过严格的检测而将其汰除。据报道，控制ＰＳＴＶｄ传染的有效方法仅有依赖于ＰＳＴＶｄ的早期鉴定。目前主要采用指示植物、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术、核酸斑点杂交技术等方法进行检测。随着ＰＣＲ技术的产生，ＲＴ—ＰＣＲ技术已经被越来越广泛地应用在ＲＮＡ病原的鉴定上，应用ＲＴ—ＰＣＲ技术检测植物病原具有快速、灵敏、简便、特异性强等优点，而且可以检测出植物组织中含量极低的病毒ＲＮＡ－４］。本研
１材料与方法
１．１试验材料
感染ＰＳＴＶｄ的马铃薯试管苗、块茎由俄罗斯哈巴农业科学研究院马铃薯研究所提供；健康的马铃薯试管苗、块茎由延
边农业科学研究院提供。

应用三重RT-PCR技术检测三种马铃薯病毒

对田间１５０份马铃薯毒源样品进行检测，两种方法检测结果吻合，三重ＲＴ — ＰＣＲ体系的灵敏度更高、特异性更强，
可以用于马铃薯田间样品检测。关键词：三重ＲＴ — ＰＣＲ；马铃薯；ＰＶＸ；ＰＶＭ；ＰＶＡ；检测
ｏｆＭｇ，ｄＮＴＰｓａｎｄＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｎｄｔｈｅｅｘｐｅ￣ｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆ７１１ｂｐ（ＰＶＸ），５２０ｂｐ（ＰＶＭ）ａｎｄ２７３ｂｐ（ＰＶＡ）ｗｅｅｒ
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｉｒｕｓ — ｆｒｅｅＳｅｅｄｌｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈ，ＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１５００８６，Ｃｈｉｎａ；２．ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｒｏｐＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１５００８６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＸ（ＰＶＸ），ｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＭ（ＰＶＭ）ａｎｄｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＡ（ＰＶＡ）ａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｖｉｒｕｓｅｓｗｈｉｃｈｃａｎｃａｕｓｅ

马铃薯病毒PVY,PVS和PLRV多重RT-PCR检测

马铃薯病毒PVY,PVS和PLRV多重RT-PCR检测黄丹;余琨;陈建斌;蔡红;朱有勇【摘要】病毒是马铃薯生产过程中危害较大的一类病原,为快速检测出云南省马铃薯主要病毒种类,依据病毒外壳蛋白基因序列设计合成了马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)的特异性引物,从退火温度、最低检测浓度、热反应循环条件、病毒间的模板及引物间的最佳组合浓度进行优化,建立了三重RT-PCR反应体系.结果表明:该优化体系可同步扩增出上述3种病毒,分别得到480 bp (PVY)、187 bp (PVS)、336 bp (PLRV)大小的扩增片段.优化的三重RT-PCR反应体系可快速、灵敏、简便的检测到单一或复合侵染的马铃薯病毒,有利于马铃薯病毒病的早期检测和防治,将为云南省马铃薯种苗脱毒、继代、田间植株的高产栽培等有重要实践作用.【期刊名称】《云南农业大学学报》【年(卷),期】2015(030)004【总页数】6页(P535-540)【关键词】马铃薯;病毒;多重RT-PCR检测【作者】黄丹;余琨;陈建斌;蔡红;朱有勇【作者单位】云南农业大学植物病理重点实验室,云南昆明650201;云南省建水县农业技术推广所,云南建水654399;云南农业大学植物病理重点实验室,云南昆明650201;云南农业大学植物病理重点实验室,云南昆明650201;云南农业大学植物病理重点实验室,云南昆明650201【正文语种】中文【中图分类】S435.32马铃薯病毒病是马铃薯非常重要的一类病害，病毒的侵染可引起马铃薯种质退化，导致产量急剧下降[1]。

我国各马铃薯主产区均有马铃薯病毒病发生[2]。

主要的马铃薯病毒种类有马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus，PLRV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、马铃薯A病毒(Potato virus A，PVA)和马铃薯S病毒(Potato virus S，PVS)[3-4]。

马铃薯S病毒RT-PCR检测技术的研究

薯产业也得到快速发展，０８年，国马铃薯种植２０我
面积超过８０８０万亩，占世界总面积的１４／。但单产
分ｊ存在着假阳性或假阴性现象，且只是检测，而了病毒的外壳蛋白（Ｐ，Ｃ）其遗传信息量只占整个病
１２主要试剂与耗材．
般不作为最终鉴定。在血清学鉴定中以ＥＩＡ应ＬＳ
收稿日期：００— ９— ４２１００
ＴＩＯＲＺＬ提取试剂盒， —ＭＬｅｅｓｒｎＭＶＲｖｒＴａ．ｅ
ｓｒｔｅＯｉｄｐｉｅｃｉａ，ｌｏ（Ｔ）ｒｒ购自Ｐｏｅａ公司；ｐｓｇｍｒｍｇＴｑＮａＤＡ聚合酶，ＮＰＭｉｕｅ１０ｐＤＡｌｄｒｄＴｘｒ，０ｂＮａｅ，ｔｄ
～
定同源性的病毒类型。随着分子生物学的发
展，聚合酶链式反应（Ｃ得到了迅速而广泛的应ＰＲ）
用。应用此项技术检测植物病毒具有快速、敏、灵简
便、特异性强等优点，且可检测出植物组织中含量而
５０％＿Ｊ严重时达２
，
８％以上，重制约了马铃薯０严
的生产。
极低的病毒ＲＡ＿，能检测到休眠种薯或含量极Ｎ５』
少的韧皮部病毒，灵敏度是ＥＩＡ的ｌ其ＬＳ０倍Ｊ适，
马铃薯ｓ病毒是马铃薯重要病毒之一，９８首１４次发现和报道于荷兰，在许多种植马铃薯的地区皆

马铃薯病毒RTPCR检测体系的建立______

马铃薯是世界上第四大粮食作物,具有广适性好、薯块产量高、淀粉含量丰富、种植经济效益较高等特点。

随着农业产业结构的调整和国内外马铃薯加工业的不断发展扩大,市场对马铃薯的需求也逐渐增多[1]。

马铃薯也是许多病虫害的广普寄主,许多病虫害均可引起马铃薯品质和产量的降低甚至绝收以及种薯的退化[2]。

马铃薯是无性繁殖作物,马铃薯病毒病是马铃薯退化的主要原因,如果连年种植无毒的种薯,借助蚜虫在田间传播病毒,也会感染马铃薯病毒病;连续种植带毒的马铃薯,由于马铃薯病毒的累积效应,该病会使马铃薯严重退化,最终造成了马铃薯产量迅速下降[3]。

为了使马铃薯产业安全高效,持续健康地发展,应当繁育和推广优质脱毒种薯。

因此,保证马铃薯病毒检测技术体系的灵敏、快速、准确,可以有利于确保脱毒种薯生产质量。

分子生物学检测法是目前发展最快、最有发展前景的病毒检测技术。

该方法特异性强、灵敏度高,从核酸水平检测病毒,可以进行大批量的样本检测,且克服血清学及其他检测方法中的一些缺点。

目前,我国常采用单重RT-PCR 检测病毒,如需检测复合感染样品,操作步骤繁琐,因为其局限是在1个反应管中只能检测1种病毒,已不能满足现代生产的需求。

复合感染样品检测需要进行数次RT-PCR 反应,耗时长、成本高、易造成交叉污染。

针对侵染马铃薯的主要病原病毒PVS 、PVX 、PLRV 和PVA ,本研究建立了高效RT-PCR 检测体系,应用于检测四川省发生的马铃薯病毒病。

该体系可以在同一反应管中同步检测4种病毒,提高了检测的准确性和检测效率,为培育和筛选马铃薯无病毒原种材料、种薯调运的检疫检验、实施病毒病害有效的防治措施提供一定的理论指导。

1材料与方法1.1试验材料供试材料为来四川省主要马铃薯生产区的试管苗、种薯、田间及网室植株共134个样品,从成都市各区、市、县和彭山、洪雅、雅安、简阳等共24个采样点,大田随机采集明显有花叶、皱缩、矮化等症状的马铃薯植株,通过DAS-ELISA 检测后,筛选出单独或复合感染PVX 、PVS 、PVA 和PLRV 的植株叶片作为供试材料。

马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的RT-PCR检测

马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的RT-PCR检测李永俊;赵希子;郭相和;全英姬;李平;金松爱【摘要】以马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)检测试剂盒提取的2种不同材料的mRNA为模板,进行cDNA合成及PCR扩增,从感病组织中扩增得到一段长360 bp的特异PCR扩增产物,而健康的试管苗中则无此扩增产物.以感染PSTVd的马铃薯试管苗、块茎和健康的马铃薯试管苗、块茎为材料,用韩国INTRON生物化学制药公司生产的PSTVd检测试剂盒提取试管苗、块茎这2种不同材料中的mRNA.结果表明,试剂法可对马铃薯不同材料进行PSTVd检测,60 min内即可分离出mRNA,整个诊断时间为4h,方法简便、快捷、灵敏度高,因此可以作为马铃薯种薯生产早期PSTVd诊断及品种引进的快速、有效的检测手段.【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2013(041)009【总页数】2页(P26-27)【关键词】马铃薯纺锤块茎类病毒;RT-PCR;mRNA【作者】李永俊;赵希子;郭相和;全英姬;李平;金松爱【作者单位】延边职业技术学院,吉林廷吉133001;延边职业技术学院,吉林廷吉133001;延边职业技术学院,吉林廷吉133001;延边职业技术学院,吉林廷吉133001;延边职业技术学院,吉林廷吉133001;吉林省敦化市农业技术推广中心,吉林敦化133700【正文语种】中文【中图分类】S435.32马铃薯纺锤块茎病害是由类病毒引起的，是危害我国北方马铃薯生产和实生种子品质的重大病害。

据报道，马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)强系减产可达60%，弱系减产约20%～35%，常常因此造成较大的经济损失[1]。

马铃薯类病毒是马铃薯种薯检疫规程中的主要检疫对象，具有广泛的传播途径，是唯一不能通过茎尖剥离、组织培养而汰除的病毒，必须通过严格的检测而将其汰除。

据报道，控制PSTVd传染的有效方法仅有依赖于PSTVd的早期鉴定[2]。

陕北地区马铃薯Y病毒的RT-PCR检测及其序列分析

陕北地区马铃薯Y病毒的RT-PCR检测及其序列分析冯光惠;杜虎平;李夏隆;亢福仁【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2014(042)009【摘要】以陕北地区8个县(区)种植2～3代疑似带毒的马铃薯叶片为材料,Trizol 法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯Y病毒外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列设计1对特异引物,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增目的DNA片段,1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物.回收纯化CP基因片段并进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列一致性.结果显示,所有马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的、长度为400 bp的目的片段,表明这些马铃薯均感染了Y病毒;陕北8个县(区)马铃薯Y病毒CP基因与国内外其他地区12个样品之间的序列一致性为88.4％～99.8％,表明马铃薯Y病毒的CP基因序列比较保守,不易发生变异.RT-PCR方法可快速、准确地检测马铃薯Y病毒,从而为马铃薯茎尖剥离脱毒生产脱毒种苗(薯)提供依据.【总页数】5页(P941-944,967)【作者】冯光惠;杜虎平;李夏隆;亢福仁【作者单位】榆林学院生命科学学院,陕西榆林719000;榆林学院生命科学学院,陕西榆林719000;榆林学院生命科学学院,陕西榆林719000;榆林学院生命科学学院,陕西榆林719000【正文语种】中文【中图分类】S435.32【相关文献】1.陕北地区马铃薯X病毒CP基因的RT-PCR检测及其序列分析 [J], 冯光惠;杜虎平;李夏隆;亢福仁2.加工番茄马铃薯Y病毒一步法RT-PCR检测及CP基因的克隆与序列分析 [J], 梁学超;向本春;程朝玲;苏海娣;郑银英3.陕北地区马铃薯卷叶病毒的RT-PCR检测与序列分析 [J], 冯光惠;杜虎平;李夏隆;亢福仁4.榆林地区马铃薯纺锤块茎类病毒的RT-PCR检测与序列分析 [J], 冯光惠;杜虎平;李夏隆;亢福仁5.2007-2010年江苏地区猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测及部分Nsp2基因序列分析 [J], 钱琨;顾丙泉;王明珍;金文杰;秦爱建因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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马铃薯病毒病是马铃薯上非常重要的一类病害，
马铃薯病毒检测的方法主要是酶联免疫吸附法（ＬＳ，虽然ＥＩＡ比传统的生物学检测方法灵ＥＩＡ）ＬＳ
分布于世界各马铃薯种植区，病毒的侵染除直接引起马铃薯病毒病外，更重要的是导致种质退化，引起产量的急剧下降。在我国各马铃薯主产区均有马铃薯病毒病的发生，成为制约马铃薯生产的主要因素之一。目前已报道的感染马铃薯的病毒多达３５种，类病毒１，以马铃薯命名的病毒就有１种。种５
关键词：马铃薯病毒；Ｒ－Ｃ；ＴＰＲ检测；问题与对策
ＲＴ— ＰＣＲｔｃｉｎＴｅｈｏｏｙｆｒｔｔｒｓｓＤｅｅｔｃｎｌｇｏａｏＶｉｅｏＰｏｕ
ＷＵＸｉｇａ仙，ｎｑｕｎＳＨＩｎ，Ｙａ ’ＹＡＮＧｎｄｎＬｉｇＱｉｇｏｇ，ＩＧｕｌ ’ ｉｎ
（．ｏ￣ｅｏｉｔｃｎｌｇ，ｅａｎｖｒｉｆｅｈｏｏｙＺｅｇｈｕＨｎｎ４００，ｉａ２ＧｒａｏｔｅｎＷｉｅｎｓｏａｏ１ＣｌｆｏｅｈｏｏｙＨｎｎＵｉｓｙｏｃｎｌｇ，ｈｎｚｏ．ｅａ５０１Ｃｈｎ；．ｅｔｒｒｌｒｅｓＰｔｔＢｅｔＴＮｈｄ
率，而且降低检测成本，因此ＨＲ－Ｃ卜ＴＰＲ技术将是Ｒ－ＣＴＰＲ检测技术真正投入实际应用的发展方向。
铃薯样本带毒，反之，为健康样本，从而完成对待测样本带毒情况的判断。马铃薯病毒的常规Ｒ — ＣＴＰＲ检测一般包括：待测马铃薯样本中病毒ＲＡ的提取、反转录合成ＮｃＮ、ＰＲ扩增靶ｃＮＤＡＣＤＡ片段和ＰＲ产物的电泳Ｃ
１马铃薯病毒Ｒ－ＣＴＰＲ检测技术的原理及其
病毒进行了检测。
在病毒检测中的应用
１常规Ｒ－Ｃ．１ＴＰＲ检测技术ＰＲ技术可以从一个复杂的ＤＡ混合物中大ＣＮ
由于马铃薯病毒在田间经常出现复合侵染，同一个马铃薯样本可能同时携带多种病毒，因此
Ｒ－Ｃ方法来说不是最佳的￣４ＦＴＰＲ：完成检测任务。－１免疫捕捉一ＴＰＲ检测技术．４Ｒ —Ｃ免疫捕捉一ＴＰＲ（ＣＲ — Ｃ是免疫学技Ｒ — ＣＩ— ＴＰＲ）
术与Ｒ —ＣＴＰＲ技术相结合பைடு நூலகம்建立起来的检测方法。Ｎｌｃｏａｏ等［ｓ９１该方法对马铃薯病毒进行了检测。利用Ｉ— ＴＰＲ操作流程：病毒粒体经特异性抗体免ＣＲ —Ｃ疫捕捉后，进行热变性，然后进行Ｒ — ＣＴＰＲ扩增
其中分布广泛、危害严重的马铃薯病毒有马铃薯ｘ
病毒（Ｖ）ＰＸ、马铃薯Ｙ病毒（Ｖ）ＰＹ、马铃薯Ｓ病毒
敏度提高了许多，但仍然存在不易检测含量极少的韧皮部病毒等缺陷。因此，人们在马铃薯病毒的分子检测技术方面进行了大量的研究工作，其中以反
吴兴泉ｐ，时妍・，杨庆东，李桂玲，
（１河南工业大学生物工程学院，河南．郑州４００；２北大荒薯业集团公司九三分公司，黑龙江５０１．嫩江１１４６４１）
摘
要：对应用于马铃薯病毒检测中９种不同形式的Ｒ－ＣＴＰＲ检测技术进行评述，重点讨论常规Ｒ－Ｃ、多重ＴＰＲ
法相同的特异性和灵敏度，但该方法可以在对常规
检测等４个步骤。在一个ＰＲ反应中只加入一对针Ｃ对某种病毒的特异性引物，完成一种病毒的检测。随着分子生物学实验技术的提高，常规Ｒ — Ｔ
ＰＲ检测技术也在不断的得到改进，主要集中在ＣＲ — Ｃ的反应程序和反应体系、病毒ＲＡ的提ＴＰＲＮ取、ＰＲ产物的检测、ＰＲ检测特异性的提高等ＣＣ
和电泳检测。此方法检测灵敏度与常规Ｒ — ＣＴＰＲ
方面，形成了如下一系列的新方法。１一步Ｒ — Ｃ．２ＴＰＲ检测技术
一
’
步ＲＰＲ检测技术将常规Ｒ－Ｃ１ＣＴＰＲ反应程
收稿日期：２１— ４００ｌｏ—６
近年来在马铃薯病毒检测中应用的Ｒ — ＣＴＰＲ技术
及以其为基础衍生出来的一些分子生物技术进行评述，以期为进一步的深入研究提供参考。
基金项目：河南省教育厅自然科学基础研究项目（０６１０３；２０２００）河南工业大学校科研基金项目０ＸＣ０）（７ＪＯ８。
渐发展成为一类具有多种功能的检验技术。本文对
（Ｖ）、马铃薯Ａ病毒（Ｖ）、马铃薯卷叶病毒ＰＳＰＡ（ＬＶ、马铃薯Ｍ病毒（ｖ等。ＰＲ）ＰＭ）
当前马铃薯病毒病的防治主要是利用脱毒种薯，在脱毒种薯生产过程中，对病毒进行快速、准确地检测是保证种薯质量的关键。目前应用于
在进行病毒检测时，对同一个马铃薯样本必须进行
多种病毒的检测才能确定其是否带毒。在马铃薯脱毒种薯生产中，依照国家标准的要求必须确保种薯不含ＰＹ、ＰＸ、ＰＲＶＶＬＶ、ＰＳＳＶＶ、ＰＴｄ等４种病毒和１种类病毒，因此对一个马铃薯待测样本需要进行５次ＰＲＣ检测才能确定其是否合格，如果有大量
时，必须采用Ｒ — ＣＴＰＲ技术。以马铃薯块茎或叶片等组织的总ＲＡ为模板，进行反转录后，利用Ｎ针对病毒的特异性引物进行ＰＲ，扩增病毒的某Ｃ段基因，如果能够扩增获得病毒的基因，说明该马
待测样本就需要很大的工作量和试剂耗费。如果采用ｍ— ＴＰＲ则可通过一个ＰＲ反应完成对一个Ｒ —ＣＣ待测样本的多种病毒的同时检测，不但提高检测效
ＩｄｓｒｏｐＣｏＬｄ，ｉｓｎＢａｃ，ｅｊｎ，ｅｌｎｊｎ６４１ＣｈｎｎｕｔＧｒｕ．ｔ．ＪｕａｒｎｈＮｎｉｇＨｉｇｉｇ１１４，ｉａ）ｙａｏａ
Ａｈ由＿ｃ：Ｎｉｅｋｎｓｏｏａｏｖｒｓ－ｌｎｉｄｆｐｔｔｉｅＲＴＰＣＲｅｅｔｎｍｅｈｄｕｄｔｃｉｔｏｓｗｅｒｅｉｗｅ，ｄｔｅｃｎｅｔｎｌｏｅｒｖｅｄａｎｈｏｖｎｉａｏＲＴ —ＰＣＲ，ｈｔｅｍｕｔｌ－ｌｐｅＲＴＰＣＲｎａ－ｍｅＲＰＣＲｒｓｕｓｄｉｅａｌ．ｈｅｔｃｔｎｅｅｔｆｉａｄｒｌｅｔＴ－ｉｗｅｅｄｉｃｓｅｄｔｉＴｅｉｎｉａｉｆｃｎｓｄｉｆｏｏＲＴ－ＣＲｎｄｆｒｔｔａｎｆＰｏｉｅｅｎｒｉｓｏｓｏｅｖｒｓａｄｐｏｌｍｓｏｅｐｙｏｅｎｔｅｏｓｒｃｉｎｗｅｅａａｙｅ．ｅｐｏｌｍｓｉｏａｏｖｒｓＲＴＰＣＲｄｔｃｉｎｎｉｎｒｂｅｆｈｈｌｇｅｉｔｅｃｎｔｕｔｒｎｌｚｄＴｈｒｂｅｐｔｔｉ－ｕｔｃｒｏｎｕｅｅｔｏｔｃｎｌｇｒｌｏａａｙｅ，ｎｏｏｎｅｍｅｓｒｓｆｒｍｐｏｉｇｗｅｕｒｒｃｏｄｎｌ．ｅｈｏｏｙｗｅｅａｓｎｌｚｄａｄｓｍｅｃｕｔｒａｕｅｒｖｎｒｐｔｏｗａｄａｃｒｉｇｙｏｉｅｆＫｏｄ：ｔｔｉ；－ｅｙＷｒｓｐａｏｖｒＲＴＰＣＲ；ｅｅｔｎｐｏｌｍｎｏｎｅｍｅｓｒｏｕｓｄｔｃｉ；ｒｂｅａｄｃｕｔｒａｕｅｏ
Ｒ－Ｃ、ＲａｔｅＴＰＲ等方法。分析了Ｒ－ＣＴＰＲｅｌｉＲ－Ｃ－ｍＴＰＲ在同种病毒不同株系鉴定中的应用效果及建立系统进化树时应注意的问题。对Ｒ．Ｃ１ＰＲ技术在马铃薯病毒检测中可能出现的问题也进行了分析，并提出了应对策略。－
作者简介：吴兴泉（９０）１７－，男，教授，博士，研究方向为植物病毒学与分子生物学。
通信作者（ｏｒｓｏｄｎｕｈｒ：吴兴泉，ＥｍｉｗｘＴ＠１６ｔｍ。Ｃｒｐｎｉｇａｔｏ）ｅ — ａｌｕｑＯ２．：ｏ
中国马铃薯，第２卷，第４，２１５期０１
量复制某段特定的ＤＡ片段，在扩增目标ＤＡ片ＮＮ段时必须以ＤＡ为模板。如果利用该技术扩增ＮＲＡ基因，则须先将ＲＡ反转录（Ｔ为ｃＮＮＮＲ）ＤＡ