酶工程综述
酶工程总结
酶工程总结酶工程是一门结合生物学、化学和工程学的交叉学科，旨在研究和应用酶的性质、功能和生产过程。
通过酶工程的技术手段，科学家们可以对酶进行改造和优化，以实现更高效、经济和环保的酶催化反应。
在过去的几十年里，酶工程取得了巨大的发展，并在多个领域展现出其独特的优势和应用前景。
一、酶工程的发展历程酶工程的发展可以追溯到20世纪50年代，当时科学家们开始意识到酶可以用于工业生产。
然而，在当时的条件下，纯化和大规模生产酶仍然是一个挑战。
到了70年代，随着分子生物学和生物工程学的发展，人们可以对酶进行基因工程改造，并通过大规模培养和纯化技术实现酶的工业化生产。
此后，酶工程得到了快速发展，应用范围也越来越广泛。
二、酶的改造和优化通过基因工程技术，科学家们可以对酶的基因序列进行改造，以改变酶的催化性能。
例如，可以通过点突变、插入和删除等手段引入新的功能基团或改变催化位点的亲和力，从而改变酶对底物的识别和催化效率。
此外，也可以通过改变酶的结构、稳定性和热力学性质来优化酶的性能和稳定性。
这些酶的改造和优化工作为酶的工业化应用提供了有力的科学基础。
三、酶的应用领域酶工程的应用领域非常广泛，涵盖了医药、食品、化工等多个行业。
在医药领域，酶工程可以用于生产各类生物药物，如蛋白质药物和抗体药物。
酶工程的技术手段可以提高药物的纯度和效力，减少副作用，并缩短药物研发周期。
在食品工业中，酶工程可用于改善食品的品质和口感，如面包、啤酒和奶制品等。
在化工领域，酶工程可以实现绿色催化，代替传统的化学合成方法，降低能耗和废物排放。
四、酶工程的挑战和前景尽管酶工程在各个领域展现出了广阔的应用前景，但仍面临一些挑战。
首先是酶工程技术的复杂性和不确定性，需要综合运用多个学科的知识和技术手段。
其次是酶的稳定性和失活问题，酶在非生理条件下易受到温度、pH值和底物浓度等因素的影响，从而降低其催化效率。
此外，酶的高成本和低产量也限制了其在工业生产中的应用。
酶工程期末重点总结
酶工程期末重点总结一、酶工程概述酶工程是将酶应用于工业领域的一门科学，通过对酶的研究和改良，可以提高酶的稳定性、催化活力、选择性和产量，以满足工业生产的需求。
酶工程的应用范围广泛，涉及生物技术、医药化学、食品工程等多个领域。
二、酶的产生和分离纯化1. 酶的产生：酶可以通过天然微生物、重组DNA技术等方法进行生产。
天然微生物通过发酵过程产生酶，而重组DNA技术可以将特定基因导入到宿主微生物中，使其产生目标酶。
2. 酶的分离纯化：酶的分离纯化通常包括细胞破碎、组织液处理、沉淀和层析等步骤。
其中，层析是一种常用的分离纯化方法，包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
三、酶的性质和特点1. 酶的性质：酶是一种特殊的蛋白质，具有催化作用。
酶的催化作用是高度选择性的，可以加速化学反应的速率并降低反应的能量活化值。
2. 酶的特点：酶具有高效、低成本、环境友好等特点。
由于酶具有高度选择性，因此可以在温和的条件下催化反应，减少能耗和废弃物产生。
四、酶的改良和优化酶的改良和优化是酶工程的核心内容之一，旨在提高酶的催化活力、选择性和稳定性，以满足工业生产的需求。
1. 酶的改造：通过理性设计和随机突变等手段，改变酶的氨基酸序列，以改善其性质。
常用的改造方法包括点突变、插入突变和删除突变等。
2. 酶的固定化：将酶固定在材料表面或载体上，增加酶的稳定性和重复使用性。
常用的固定化方法包括包埋法、凝胶包覆法和共价固定法等。
3. 酶的进化：通过模拟自然界的进化过程，通过多代选择和酶库筛选等方法，获得具有改良性质的酶。
进化方法包括DNA重组技术、DNA重组酶库和聚合酶链式反应等。
五、酶工程在工业中的应用酶工程在工业中的应用广泛，涉及到生物能源、纺织印染、制药等多个领域。
1. 生物能源：酶可以催化生物质转化为生物能源，如酶解纤维素制备生物乙醇。
2. 纺织印染：酶可以代替传统的化学处理方法，实现更加环保和高效的染色和整理。
3. 制药：酶可以用于合成药物和研发新药，如利用酶合成青霉素等抗生素。
酶工程
名解：酶工程：又叫酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术。
也是酶的生产、改性与应用的技术过程。
自杀性底物：底物经过酶的催化后其潜在的反应基团暴露，再作用于酶而成为酶的不可逆抑制剂，这种底物叫自杀性底物。
别构酶：调节物与酶分子的调节中心结合后，引起酶分子的构象发生变化，从而改变催化中心对底物的亲和力，这种影响被称为别构效应，具有别构效应的酶叫别构酶诱导酶：有些酶在通常的情况下不合成或很少合成，当加入诱导物后就会大量合成，这样的酶叫诱导酶修饰酶：在体外用一定的化学方法将酶和一些试剂进行共价连接后而形成的酶模拟酶：利用有机化学合成的方法合成的比酶结构简单的具有催化作用的非蛋白质分子叫模拟酶。
抗体酶：是一种具有催化作用的免疫球蛋白，属于化学人工酶Mol催化活性：表示在单位时间内，酶分子中每个活性中心转换的分子数目离子交换层析：利用离子交换剂作为载体这些载体在一定条件下带有一定的电荷，当带相反电荷的分子通过时，由于静电引力就会被载体吸附，这种分离方法叫离子交换层析。
固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚于一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶发挥催化作用的酶酶反应器：是利用生物化学原理使酶完成催化作用的装置，他为酶促反应提供合适的场所和最佳的反应条件，使底物最大限度的转化为物。
底物抑制：在酶促反应中，高底物浓度使反应速度降低的现象。
稳定pH：酶在一定的pH范围之内是稳定的，超过这个限度易变性失活，这样的pH范围为此酶的稳定pH产酶动力学：主要研究细胞产酶速率及各种因素对产酶速率的影响，包括宏观产酶动力学和微观产酶动力学。
凝胶过滤：又叫分子排阻层析，分子筛层析，在层析柱中填充分子筛，加入待纯化样品再用适当缓冲液淋洗，样品中的分子经过一定距离的层析柱后，按分子大小先后顺序流出的，彼此分开的层析方法。
非水酶学：通常酶发挥催化作用都是在水相中进行的，研究酶在有机相中的催化机理的学科即为非水酶学液体发酵法：以液体培养基为原料进行微生物的繁殖和产酶的方法，根据通风方法不同又分为液体表层发酵法和液体深层发酵法。
酶工程 重点整理总结
第一章绪论1、何为酶工程，试述其主要内容和任务。
答：（1）酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
（2）主要内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。
（3）主要任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方式使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。
2、酶有哪些显著的催化特性？答：（1）酶催化作用的专一性强（①绝对转移性：一种酶只能催化一种第五进行一种反应；②相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应）；（2）酶催化作用的效率高（107~1013倍）；（3）酶催化作用条件温和。
3、简述影响酶催化作用的主要因素。
答：（1）底物浓度的影响：决定酶催化作用的主要因素。
酶催化反应速度随底物浓度增加现增加在逐步趋向平衡再反而下降。
（2）酶浓度的影响：底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。
（3）温度的影响：适宜温度范围内，酶能进行催化反应，最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。
一般60°C以上易失活，5°C以下活性极低，Taq聚合酶95°C下仍稳定。
（4）PH的影响：适宜PH范围内，酶才能显示其催化活性，最适pH条件下，酶催化反应速度达到最大。
（5）抑制剂的影响：在抑制剂的影响下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能，有竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。
（6）激活剂的影响：在激活剂的作用下，酶的催化活性提高或者由无活性的酶生成有催化活性的酶。
如Ca、Mg、Co、Zn、Mn、等金属离子和Cl等无机负离子。
5、简述酶活力单位的概念和酶活力的测定方法。
答：概念：在特定条件下（温度可采用25°C，pH等条件均采用最适条件），每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位（IU）。
第一节酶工程概述
COOH
C＝ O
丙酮酸羧化酶
CH2 -COOH
2.酶的命名
酶的命名方法有系统命名法和习惯命名法两种。系统命名法是根据 国际生物化学联合会酶学委员会的命名规则进行的命名；习惯命名法常 根据底物名称和反应类型进行命名。 ⑴系统命名 国际酶学委员会规定，酶的名称包括两部分。即： 酶的系统名称 分类编号（4个数字）
三、酶的特点与活性
1.酶的催化特点 问题：
什么是催化剂？
酶作为一种特殊的催化剂，除了与一般催化 剂共同具有：“反应前后其量化学性质不发生改 变”、“改变反应速度”、“不改变化学反应平
⑴催化效率高 酶的催化效率非常高，是其它无机（或有机）催化剂的106-1013 倍。
衡点”外，还具有如下几个方面的特点。
酶的系统名称应包括底物名称、反应类型；若有两种底物，将其名
称列出，并用“：”隔开；若底物之一为水，则可略去。 分类编号为： EC *.*.*.*（4个数字） EC 为国际酶学委员会的英文缩写，前三个数字分别表示酶所属的 大类、亚类、亚亚类，第4个数字表示该酶在亚亚类中占有的位置。 这样，根据这4个数字就可以确定具体的酶。
水解酶类（hydrolases） 裂解酶类（lyases） 异构酶类（isomerases）
合成酶类（synthetases）
⑴氧化还原酶类 氧化还原酶类用于催化氧化还原反应。生物体内的氧化还原反应多以 脱氢、加氢的方式进行。脱氢为氧化，加氢为还原。氧化还原酶类是生物
获取能量的一种重要酶。 例如：葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下氧化成葡萄糖酸。 CH2OH │ 葡萄糖氧化酶 (CHOH)4 + O2 │ CHO 的辅酶NAD还原为NDAH2。 CH3CH2－OH
第七章
第二章 酶工程
（四）发酵方法
1.温度的控制
– 枯草杆菌的最适生长温度为34～37℃，黑曲霉 的最适生长温度为28～32℃。
2.通气和搅拌 – 在发酵过程中必须不断供给氧，一般通过供给 无菌空气来实现；
3. pH值的控制
– 细菌和放线菌的生长最适pH值为6.5～8.0；霉 菌和酵母的生长最适pH值为4～6；植物细胞的 生长最适pH值为5～6。
（3）粘性末端（sticky
ends，cohensive ends）
含有几个核苷酸单链的末端。
分两种类型： ① 5’端凸出（如EcoR I切点）
② 3’端凸出（如Pst I切点）
（4）粘性末端的意义
①连接便利 i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补 就可以连接。这比连接两个平齐末端容易。
ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末 端可以连接成环形分子。
2．酶的特性 （1）酶催化作用的专一性强 （2）酶催化作用的效率高
（3）酶催化作用的条件温和
3. 酶的分类：
氧化还原酶、转移酶、水解酶、 裂解酶、异构酶、合成酶
（二）酶工程
– 狭义：是指在一定的生物反应器中，利用酶的催 化作用，将相应的原料转化成有用物质的技术
– 广义：是指研究酶的生产和应用的一门技术性学 科，它包括酶的发酵生产、酶的固定化、酶的化 学修饰、酶反应器和酶的应用等方面内容。
(2)为提高酶稳定性，常加入下列稳定剂
①底物、抑制剂和辅酶，它们的作用可能是通过降低局部 的能级水平，使酶蛋白处于不稳定状态的扭曲部分转入稳 定状态。 ②对巯基酶．可加入SH—保护剂。如巯基乙醇、GSH(谷 胱甘肽)、DTT（二硫苏糖醇)等。
第四节 分子生物学技术常用的工具酶
核酸酶类是基因工程操作中必不可少的 工具酶，基因克隆的许多DNA分子的制备、 DNA片段的切割与连接、核酸探针的标记 cDNA的合成等，都需要用一系列的功能特 意核酸酶来完成。没有酶就没有基因工程。
酶工程整理
1.酶工程：在一定的生物反应装置里，利用酶的催化作用将相应的原料转化为有关物质的技术。
2.蛋白质工程：是通过对蛋白质已知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特异性地对蛋白质结构基因进行改选，产生具有新的特性的蛋白质技术。
3.酶的改性：是指通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子修饰，酶固定化，酶非水相催化和酶定向进化等。
4酶的生产:通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程，主要包括微生物发酵产酶、动植物培养产酶和酶的提取与分离纯化等。
5.酶的应用:通过各种方法获得人们所需的物质或者除去不良物质的技术过程，主要包括酶反应器的选择与设计以及酶在各个领域的应用等。
6.酶的提取：在一定条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中过程，也称酶的抽提。
7.有机溶剂沉淀法:利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。
8.β分段盐析:在一定的盐和离子强度条件下(Ks为常数)，通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法。
9.Ks分段盐析:在一定的温度和pH值条件下（β为常数），通常改变离子浓度，使不同的酶或蛋白质分离的方法。
10盐析沉淀法:简称盐析法，是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。
反胶束:将表面活性分散于非极性溶剂中形成的纳米尺度的一种聚集体自我剪接酶:在一定条件下催化本身RNA分子同时进行剪切和连接反应的R酶。
吸附法:利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法。
易错PCR：从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。
DNA重排技术：又称为DNA改组技术，是从正突变基因文库得到的同源DNA，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术。
酶工程
1、酶工程：是在酶的生产和应用过程中逐步形成并发展起来的学科。
2、阻遏蛋白：是一种由多个亚基组成的变构蛋白，它可以通过与某些小分子效应物的特异结合而改变其结构，从而改变它与操纵基因的结合力。
3、发酵动力学：是研究发酵过程中细胞生长速率，产物生成速率、基质消耗速率以及环境因素对这些速率的影响规律的学科。
4、端粒：是真核生物染色体的末端结构，是由富含G和T的DNA简单重复序列不断重复而成。
5、外植体：指从植株取出，经过预处理后用于植物和细胞培养的植物组织（包括根、茎、叶、花、果实、种子等）片段或小块。
6盐析沉淀法：是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下，溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。
7、分子内交联修饰：采用双功能基因化合物，与在酶分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法称为分子内交联修饰。
8、酶的非水相催化：酶在非水介质中进行的催化作用称为非水相催化。
9、搅拌罐式反应器：是带有搅拌装置的一种罐式反应器。
由反应罐、搅拌器和保温装置组成。
10噬菌体表面展示法：是通过可以锚定在酵母细胞表面的特定蛋白质与某些外源蛋白或多肽形成稳定的复合物，是这些外源蛋白或多肽富集在酵母细胞表面的一种展示技术，是20世纪90年代发展起来的一种基因文库筛选方法。
11、DNA改组（重排）技术：是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。
12、生产强度：是指反应器每小时每升反应液所生产的产物克数。
1、酶有哪些显著的催化特性？答：高效性:酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快；专一性:在一定的条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物；温和性:酶所催化的化学反应一般都在常温、常压、pH近乎中性的条件下进行的；多样性：酶的种类很多，大约有4000多种；易变性，由于大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏。
酶工程总结
第一章绪论1、生物工程：基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程2、酶工程的概念及其研究内容？酶工程是从应用目的出发研究酶，在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用的物质。
是酶的生产和应用的技术过程，它包括酶的生产、酶的分离纯化、酶的改造和酶的应用四个方面。
3、相关知识点（1）利用酒曲中富含维生素和淀粉酶，可治肠胃疾病；（2）麦芽酿造啤酒类饮料，是利用麦芽中存在的丰富的淀粉酶和糖化酶；（3）人类游牧生活时期，利用小牛胃液存在的凝乳蛋白酶制造奶酪；（4）早期皮革制造过程中，需要利用粪便中存在的蛋白酶降解非胶原蛋白来软化皮革；皮革的软化剂—阿鲁朋中的活性成分是蛋白酶；（5）制作豆酱利用蛋白酶水解豆类蛋白；。
（6）第一个发现的酶：淀粉酶（植物中）、胃蛋白酶（动物中）（7）有关酶研究的第二次诺贝尔奖是关于从刀豆中分离到脲酶结晶（8）有关酶研究的第一次诺贝尔奖是关于无酵母的酒精发酵4、酶在工业上应用限制条件：（1）大多数酶脱离其生理环境后不稳定（2）酶分离纯化工艺条件（3）酶制剂成本较高第二章酶抑制剂及反应动力学1、能降低酶催化反应速度的因素（1）失活作用：失活作用是指由于一些物理因素和化学试剂（蛋白变性剂：无选择性）部分或全部破坏了酶的三维结构，即引起酶蛋白变性，导致部分或全部丧失活性。
——破坏三维结构（2）抑制作用：指在酶不变性的情况下，由于抑制剂（具有一定选择性：一种抑制剂只能引起某一种酶或某一类酶活性丧失或降低）导致必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。
——降低酶催化效率（3）去激活作用：某些酶只有在金属离子存在下才有活性，去除金属离子引起这些酶活性的降低或丧失。
——降低底物有效浓度（4）阻遏作用：阻遏作用指某些因素（如激素或药物等）使细胞内酶蛋白的合成减少，反应速度的降低是由于酶分子数量的减少，每分子酶的催化效力并无变化。
——酶合成受阻2、抑制程度的表示方法相对活力分数（残余活力分数）、相对活力百分数（残余活力百分数）抑制分数：指被抑制而失去活力的分数、抑制百分数IC50：酶的活性抑制50%时所需的酶抑制剂浓度。
现代生物技术第五章酶工程汇总.
基因工程 转基因动物 转基因植物
基因工程菌
发酵工程
酶 菌体细胞 固定化菌体细胞
酶工程
细胞工程
酶
细胞
酶工程与发酵工程、基因工程、细胞工程的关系
一、酶工程的内容
1.酶工程的分类： （1）化学酶工程：自然酶、化学修饰酶、固 定化酶、化学人工酶的研究和应用。 （2）生物工程酶： ①用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）； ②修饰酶基因产生遗传修饰酶（突变酶）； ③设计新酶基因，合成自然界不曾有的酶 （新酶）。
（4）酶分子改造
酶分子改造可以从两个方面进行： (1)用蛋白质工程技术对酶分子结构基因进行 改造，期望获得一级结构和空间结构较为合 理的具有优良特性、高活性的新酶(突变酶)。 (2)用化学法或酶法改造酶蛋白的一级结构， 或者用化学修饰法对酶分子中侧链基团进行 化学修饰．以便改变酶学性质。这类酶在酶 学基础研究上和医药上特别有用。
（9）酶技术的应用
在医学、食品、发酵、纺织、制革、化学分析、氨 基酸合成、有机酸合成、半合成抗生素合成、能源 开发以及环境工程等方面的应用都很广泛。 ①运用酶技术生产有重要价值的产品。 ②利用酶制剂改进生产工艺，提高产品质量和产率， 降低生产成本。
二、酶工程的意义、发展及展望
1.酶工程的研究意义
（6）酶传感器
又称为酶电极。酶电极是由感受器(如固定 化酶)和换能器(如离子选择性电极)所组成的 一种分析装臵，用于测定混合物溶液中某种 物质的浓度，其研究内容包括：酶电极的种 类、结构与原理；酶电极的制备、性质及应 用。
（7）酶反应器
酶反应器是完成酶促反应的装臵。其研究内 容包括：酶反应器的类型及特性；酶反应器 的设计、制造及选择等。
酶工程综述题
1、工业用酶要求酶具有良好的热稳定性，你如何获得热稳定性较高的酶？答：⑴从极端热环境中筛选耐热微生物，这些微生物可能含有我们所需要的酶；⑵对酶分子进行修饰，提高酶分子的热稳定性；⑶利用定点突变技术改变酶分子的结构，提高酶分子的热稳定性。
⑷改变酶的催化体系中的介质，采用非水相催化。
⑸通过酶的定向进化技术提高酶的热稳定性。
2、固定化细胞发酵产酶有哪些优点？答：（1）细胞流失少，使用寿命长，提高设备利用率（2）细胞密度大，产量大（3）由于载体的保护，细胞的耐受性增强（4）便于条件控制，简化操作，易于自动化生产（5）催化产物少了细胞的干扰，易于分离提纯（6）由于使用周期延长，使成本降低。
3、如何检查一种酶的制剂是否达到了纯的制剂？试用所学过的知识加以论述。
答：要检测酶的制剂是否达到纯的制剂（即不含杂质及杂质酶），可以有以下几种方法：（1）层析法：包括纸层析、凝胶层析、柱层析及亲和层析（2）电泳法：包括SDS凝胶电泳法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法（3）超离心法：不同的酶分子大小不同，在重力场中具有不同的沉降系数，从而可以通过超离心方法分离目的酶与杂质酶。
（4）免疫反应法：由于酶分子可作为一种抗原物质，而抗原与抗体之间具有专一的亲和力，故可选用目的酶的抗体与酶制剂进行免疫扩散或免疫电泳，从而判断酶的制剂是否纯净。
（5）氨基酸序列分析法：采用特定的化学物质从酶的N末端将氨基酸残基逐个水解下来，最终可获知该酶的氨基酸序列，从而也可以判断出酶制剂是否纯净。
4、酶在很多领域有着广泛的应用，请举四例说明。
答：⑴酶在医药方面的应用：测定血清中谷丙转氨酶的活力用于诊断疾病。
⑵酶在食品方面的应用：葡萄糖氧化酶用于食品除氧保鲜。
⑶酶在轻工化工方面的应用：延胡索酸酶用于生产L-苹果酸。
⑷酶在环境保护方面的应用：利用胆碱酯酶测定有机磷农药污染。
⑸酶在生物技术方面的应用：DNA聚合酶用于聚合酶链反应。
5、列出酶分子的侧链基团修饰时酶蛋白上可和修饰剂结合的功能团，并指出相应的功能团来自何种氨基酸。
第四节 酶工程简介
第四节酶工程简介你用过加酶洗衣粉吗？同一般的洗衣粉相比，加酶洗衣粉中含有蛋白酶和脂肪酶等多种通过微生物生产出来的酶，因此，去除汗渍、奶渍和油污的能力比较强。
我们知道，酶作为一类具有生物催化作用的有机物，是在活细胞内产生的。
那么，人们是怎样通过活细胞获得这些酶并且在生产和生活中使用这些酶的呢？这些都是通过酶工程来实现的。
酶工程是指将酶所具有的生物催化功能，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。
概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。
酶制剂的生产活细胞产生的酶都是水溶性的，人们需要根据不同的使用目的将这些酶制成一定的剂型。
所以说，酶制剂是指含有酶的制品。
酶制剂的剂型可以分为液体和固体两大类。
例如，加酶洗衣粉中的蛋白酶和脂肪酶等，就是颗粒状的固体酶制剂。
酶制剂的生产包括酶的生产、提取、分离纯化和固定化等。
酶的生产、提取和分离纯化酶普遍存在于动物、植物和微生物的体内。
人们最早是从动植物的器官和组织中提取酶的。
例如，从胰脏中提取蛋白酶，从麦芽中提取淀粉酶。
随着酶工程日益广泛的应用，现在，生产酶制剂所需要的酶大都来自微生物，这是因为同植物和动物相比，微生物具有容易培养、繁殖速度快和便于进行大规模生产等优点。
人们提供必要的条件，利用微生物发酵来生产酶的过程，叫做酶的生产。
微生物发酵产生的酶种类很多，但是每种酶在细胞培养液中的浓度都很低，因此需要提取。
根据酶在生物体内存在的部位，可以将酶分为两类：一类是存在于活细胞内的酶，叫做胞内酶；另一类是分泌到细胞外的酶，叫做胞外酶。
胞外酶可以直接从细胞培养液中提取，胞内酶则需要将细胞破碎，然后进行提取。
提取液中含有多种酶细胞的代谢产物和细胞碎片等。
为了从提取液中获得所需要的某一种酶，必须将提取液中其他的物质分离，这叫做酶的分离纯化。
经过分离纯化后得到的酶，活性不能降低，因此，分离纯化必须在适宜的条件下进行。
酶的种类很多，不同的酶需要不同的分离纯化方法。
酶工程
二、酶工程简介由酶学与化学工程、基因工程、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。
它从应用目的出发，研究酶的产生、酶的制备与改造、酶反应器以及酶的各方面应用。
（酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程）分为：化学酶工程与生物酶工程。
1.化学酶工程（初级酶工程）酶化学与化学工程技术相结合的产物。
主要研究内容：酶的制备、酶的分离纯化、酶与细胞的固定化技术、酶分子修饰、酶反应器和酶的应用。
2. 生物酶工程（高级酶工程）在化学酶工程基础上发展起来的、酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。
生物酶工程主要研究内容（1）用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）（2）用蛋白质工程技术定点改变酶结构基因（突变酶）（3）设计新的酶结构基因，生产自然界从未有过的性能稳定、活性更高的新酶。
当前酶工程的主要任务是：研制分解纤维素和木质素的酶、使低分子有机物聚合的酶、检测用酶、能分解有毒物质的酶及废物综合利用酶。
利用基因工程技术开发新酶品种和提高酶产量。
固定化酶和细胞、固定化多酶体系及辅助因子再生体系，特定生物反应的研究和应用。
用微生物和动植物组织研究生物传感器。
非水系统的反应技术，酶分子的修饰与改造以及酶型高效催化剂的人工合成研究。
一、酶的分类（一）根据酶的化学组成可将酶分为：1.单纯蛋白酶类：只含有蛋白质成分2.结合蛋白酶类（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（辅助因子）二）根据酶蛋白结构特点可将酶分为单体酶：以一个独立的三级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。
寡聚酶：以一个独立的四级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。
多酶复合体：由多种酶彼此镶嵌成一个功能完整的具有特定结构的复合体, 它们相互配合依次进行，催化连续的一系列相关反应。
国际酶学委员会（EC）规定，每个酶都有唯一的特定标码，其书写方式是：EC 数字.数字.数字.数字乙醇脱氢酶的编码是： EC1.1.1.1第一个“1”——第1大类，即氧化还原酶类；第二个“1”——第1亚类，供氢体为CHOH；第三个“1”——第1亚亚类，受氢体为NAD+；第四个“1”——在亚亚类中的顺序号。
(生物技术制药)酶工程制药-概述
乳酸脱氢酶 肝癌、急性肝炎、心肌梗塞，活力显著升高；肝硬化，活力 正常
端粒酶
癌细胞中含有端粒酶，正常体细胞内没有端粒酶活性
乳酸脱氢酶同工 心肌梗塞、恶性贫血，LDH1增高；白血病、肌肉萎缩，LDH2
酶 LDH
增高；白血病、淋巴肉瘤、肺癌，LDH3增高；转移性肝癌、
结肠癌，LDH4增高；肝炎、原发性肝癌、脂肪肝、心肌梗塞、
纤维蛋白,从而促使血液凝固，防止微血管出血。 纤维蛋白溶解酶的作用是溶解血块，为目前临床
上最新的一种酶制品,治疗血栓静脉炎、冠状动脉 栓塞等。 抑肽酶作为肽酶抑制剂，广泛应用于体外循环手 术，大剂量抑肽酶可明显减少心脏外科手术后的 渗血，消除因心脏外科手术后渗血而导致的死亡
16
凝血酶
17
栓溶酶类与心血管疾病
五、酶类药物的发展
1987年，第一种重组酶类药物Activase （Genentech公司，栓类药tPA）诞生，治疗由冠状 动脉阻塞引起的心脏病。
AdAgen(腺苷脱氨酶,阿达根)：腺苷脱氨酶缺乏症 患者,T淋巴细胞因代谢产物的累积而死亡,从而引 起免疫功能缺陷。PEG-ADA酵素，可以减少多余腺 苷, 1990年被批准用于治疗缺乏腺苷脱氨酶而造成 的重症联合免疫缺陷病(SCID)。
Activase和AdAgen的批准，标志着酶类药物新时 代的到来，可以补充其他药物的不足。
生物化学反应依赖于催化，酶类药物在血液病、
遗传病、灼伤清除,传染性疾病、癌症等治疗方面
有广泛的前景。
29
1 酶类药物治疗遗传性疾病
AdAgen用于治疗SCID，成为第一种成功治疗遗传性 疾病的酶类药物。
30
目前至少治疗3种黏多糖储积病(MPS)的酶替代治 疗正在研究中及上市。黏多糖储积病是黏多糖代 谢的先天性缺陷，均由于缺乏特异性降解性溶菌 体酶所致，患者多以黏多糖尿、身材矮小及脂肪 软骨营养不良为特征。
酶工程简介
一、什么是酶工程酶工程（英语：Enzyme engineering）又称蛋白质工程学，是指工业上有目的的设置一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在一定条件下催化化学反应，生产人类需要的产品或服务于其它目的的一门应用技术。
研究酶的产生、酶的制备与改造、酶反应器以及酶的各方面应用。
二、原理酶工程就是将酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。
它包括酶制剂的制备，酶的固定化，酶的修饰与改造及酶反应器等方面内容。
酶工程的应用，主要集中于食品工业，轻工业以及医药工业中。
三、催化特性（1）高效率：比非催化高108－1020倍；比非酶催化高107－1013倍（2）高度专一性（3）反应条件温和（4）酶催化是可调控的四、主要内容酶作为为一种生物催化剂，已广泛地应用于轻工业的各个生产领域。
近几十年来，随着酶工程不断的技术性突破，在工业、农业、医药卫生、能源开发及环境工程等方面的应用越来越广泛。
食品加工中的应用酶在食品工业中最大的用途是淀粉加工，其次是乳品加工、果汁加工、酶工程烘烤食品及啤酒发酵。
与之有关的各种酶如淀粉酶、葡萄糖异构酶、乳糖酶、凝乳酶、蛋白酶等占酶制剂市场的一半以上。
帮助和促进食物消化的酶成为食品市场发展的主要方向，包括促进蛋白质消化的酶（菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等），促进纤维素消化的酶（纤维素酶、聚糖酶等），促进乳糖消化的酶（乳糖酶）和促进脂肪消化的酶（脂肪酶、酯酶）等。
轻化工业中的应用酶工程在轻化工业中的用途主要包括：洗涤剂制造（增强去垢能力）、毛皮工业、明胶制造、胶原纤维制造（粘接剂）牙膏和化妆品的生产、造纸、感光材料生产、废水废物处理和饲料加工等。
医药上的应用重组DNA技术促进了各种有医疗价值的酶的大规模生产。
用于临床的各类酶品种逐渐增加。
酶除了用作常规治疗外，还可作为医学工程的某些组成部分而发挥医疗作用。
酶工程要点总结
酶工程要点1、酶：具有生物催化功能的生物大分子。
酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。
从应用目的出发，研究酶的产生、酶的制备与改造、酶反应器以及酶的各方面应用。
2、酶的活性中心：①指酶与底物结合并之反应的区域，一般位于酶分子表面的裂缝或凹槽，往往是疏水区，可容纳一个或多个小分子底物或大分子底物的一部分。
②酶的必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异地结合，并将底物转化为产物，这一区域称为酶的活性中心。
3、酶的必需基团：①包含结合基团和催化基团；结合基团具有与底物特异结合的作用，催化基团则直接参与催化，可使底物敏感键断裂。
两者组成酶的活性中心。
②酶分子中氨基酸残基的侧链由不同的化学基团组成，其中一些与酶的活性密切相关的一类化学基团称为酶分子的必需基团。
4、辅酶(coenzyme):与酶蛋白结合疏松(不形成共价键，能通过透析、超滤方法去除)。
5、辅基(prosthetic group):与酶蛋白结合紧密(以共价键相连，不能通过透析、超滤方法去除) 辅酶与辅基无严格区别。
7、酶催化作用的特点：（1）专一性；（2）高效性；（3）作用条件温和；（4）酶活受到很多因素影响。
8、酶的专一性：（1）绝对专一性：酶只作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物；（2）相对专一性：酶作用于一类结构相似的化合物进行某种相同类型的反应；分为1）键专一性：有的酶只作用于一定的键，而对键两端的基团并无严格要求；2）基团专一性：另一些酶，除要求作用于一定的键以外，对键两端的基团还有一定要求，往往是对其中一个基团要求严格，对另一个基团则要求不严格。
（3）立体结构专一性：酶仅作用于立体异构体中的一种。
9、影响酶催化作用的主要因素：（1）底物；（2）酶浓度；（3）温度；（4）pH；（5）抑制剂；（6）激活剂10、抑制剂：凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的抑制剂。
酶工程简介概述
酶
溶液 状态
载体（海藻酸钙、琼脂、 卡拉胶、壳聚糖）
固定化（吸附、共价 结合、交联、包埋）
固定化优点： 稳定性提高，酶易于分离重复使用。
吸附法：使酶被吸附于惰性固体的 表面，或吸附于离子交换剂上。
包埋法：使酶包埋在凝胶的格子中 或聚合物半透膜小胶囊中。
偶联法：使酶通过共价键连接于适 当的不溶于水的载体上 交联法：使酶分子依靠双功能基团 试剂交联聚合成“网状”结构
B 交联反应： 用双功能试剂使酶分子间或分子
内发生交联反应，经过交联后的酶 对热变性和蛋白质水解酶的稳定性 增加。
C 大分子修饰作用：
可溶性高分子化合物如肝素、葡聚糖、聚 乙二醇可修饰酶蛋白的侧链，提高酶的稳 定性，改变酶的一些重要性质。
（2） 固定化酶
酶的固定化是把水溶性酶经物理 （吸附法与包埋法）或化学方法（共 价偶联法与交联法）处理后，使酶与 惰性载体结合或将酶包埋起来成为一 种不溶于水的状态。
酶工程：酶制剂在工业上的大规模生产及应用。
普通酶工程、化学酶工程、生物酶工程
• 普通酶工程— 单纯生物提取 化学酶工程
1、微生物发酵得到粗酶 2、对天然酶进行化学修饰、固定化处理，
利用化学合成等手段来改善酶性能。
（1）化学修饰酶
A 修饰酶的功能基团： 亲核的Ser、Cys、Thr、Lys、His， 亲电的Tyr、Trp 可氧化的Tyr、Trp、Met ——经过修饰的酶稳定性好。
固定化葡萄糖异构酶
葡萄糖
果糖
42%高果糖玉米糖浆：215万吨/年 55%高果糖玉米糖浆：145万吨/年
（3）化学合成酶：
难度大，产品活性低，发展缓慢。
外源基因
生物体中存在的酶基因 克隆酶
酶工程的一些概念总结
酶工程的一些概念总结一，酶工程基础酶工程是将酶，细胞或细胞器等置于特定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会科学的一门科学技术。
二、催化作用及影响因素共价调节酶蛋白分子上的某些残基，在另一种酶的催化下进行可逆的共价修饰，从而使酶在活性和非活性之间相互转变的过程。
别构调节某些小分子物质与酶的非活化性部位或别位特异性的结合引起酶蛋白构象的变化从而改变酶的活性。
协同效应一个效应物分子与酶的别构中心结合后，对第二个效应物分子的影响称为协同。
酶活力的单位U在特定条件下(25°C，最适底物浓度，最适T，pH和离子强度)，美发每分钟内能转化1umol底物反应或催化1umol产物形成所需的酶量，称为1个酶活力的单位。
催量kat在最适条件下每秒钟能使1mol/L底物转化为产物所需的酶量。
1kat=6×10^(7)U酶的比活力在特定条件下，单位质量pr或RNA 所拥有的酶活力单位数。
既=酶活力(单位)/mg(Pr或RNA)酶的转换数(分子活性或摩尔催化活性) 单位时间内，酶分子的每个活性中心或每个分子酶所能转化的底物分子数，单位min-。
摩尔催化活性=n×催化中心活性。
酶的催化周期酶进行一次催化所需要的时间。
与转换数互为倒数。
六大类酶水解，裂合，连接，转移，氧化还原酶，异构。
按组成分类单体酶，寡聚酶，多酶复合体(—多种酶彼此嵌合形成复合体，可催化连续反应。
)邻近效应酶与底物之间具有亲和性，底物有向酶活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，底物在酶的活性中心的有效浓度大大增加的效应叫做邻近效应。
定向效应底物向酶的活性中心靠近，诱导酶分子构象发生改变，使酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列，同时使反应基团间的分子轨道以正确方向严格正确定位使酶促反应易于进行。
酶的生产通过人工操作获得所需酶的技术过程。
(以下为三种方法)提取分离法采用各种提取分离纯化技术，从动植物组织器官细胞或微生物细胞中将酶提取出来再进行分离纯。
酶工程总结
酶工程：酶的生产，改性与应用的技术过程。
酶的命名：氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂和酶，异构酶，合成酶。
酶的生产方法：提取分离法，生物合成法，化学合成法。
胞外酶：大多数水解酶是微生物为了利用细胞外的大分子而释放到细胞外的酶。
胞内酶：合成后仍留在细胞内发挥作用的酶。
易受到中间产物和终产物的调控。
组成酶：细胞内一直存在的酶，它的合成仅受遗传物质控制。
诱导酶：在环境中有诱导物（底物）存在时，微生物因诱导物的存在而产生的酶。
酶活力：一定条件下，酶所催化的反应初速度。
酶的比活力：是酶纯度的一个标准，是指在特定条件下，单位质量（mg ）蛋白质或RNA 所具有的酶活力单位数。
酶的转换数：Kcat,又称摩尔催化活性，指每个酶分子每分钟催化底物转换的分子数。
酶的催化周期：酶的转换数的倒数。
指酶进行一次催化所需的时间。
催化基团接触残基 结合基团酶活性中心的组成 辅助残基结果残基非必须残基产酶微生物的基本要求：1、无致病性2、发酵周期短3、易于培养，营养要求低4、遗传稳定，不易变异退化5、产胞外酶更好常见产酶微生物：大肠杆菌、醋酸杆菌、枯草芽孢杆菌、根霉、曲霉操纵子包括哪些结构? 调节基因、启动子、操纵基因、结构基因酶合成的调节机制：1乳糖操纵 酶的诱导2 Trp 操纵 酶的阻遏（末端产物调控）衰减子调控 Trp-Trna3 分解代谢物阻遏培养基设计原则：1选择合适的培养物质2营养物浓度和配比3物理化学条件4 优化设计提高产酶的措施：1 添加诱导物2 控制阻遏物浓度 3 添加表面活性剂（增大细胞膜穿透性）4 添加产酶促进剂酶合成的模式1同步合成型 微生物生长便产生酶，进入生长期，酶大量产生，进入平衡期，酶生成停止。
2 中期合成型 大部分为诱导型酶3 延续合成型 （最理想模式）µ 比生长浓度 x 细胞浓度 Rx 细胞生长速率宏观产酶动力学：研究群体细胞的产酶速率及其影响因素。
微观产酶动力学：研究细胞中酶合成速率及其影响因素。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酶工程综述胰蛋白酶一摘要胰蛋白酶为蛋白酶的一种，在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。
在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。
它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。
是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。
在生物体内，胰蛋白酶抑制剂可以调控很多重要的生理过程，在疾病的临床诊断、治疗等方面都有广阔的应用前景。
二胰蛋白酶的简介胰蛋白酶为蛋白酶的一种，在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。
在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。
作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。
它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。
是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。
在生物体内，胰蛋白酶抑制剂可以调控很多重要的生理过程，在疾病的临床诊断、治疗等方面都有广阔的应用前景。
广泛的应用于急性胰腺炎、外科手术、脑血管疾病、妇产科疾病、休克以及抗肿瘤治疗中新型药物的开发。
牛的胰蛋白酶氨基酸残基223个，分子量为23300，活性部位的丝氨酸残基是不可缺少的丝氨酸蛋白酶。
除存在于脊椎动物外，还存在于蚕、海盘车、蝲姑、放线菌等范围广泛的生物体中。
另外与高等动物的血液凝固和炎症等有关的凝血酶、纤溶酶、舒血管素等蛋白酶在化学结构和特异性等方面与胰蛋白酶具有密切的关系，可以认为这些酶是从共同的祖先酶在进化过程中分化而来的。
胰糜蛋白酶与弹性蛋白酶在结构和催化机制方面也具有密切关系，但其特异性则完全不同。
胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶。
中国药品标准规定按干燥品计算，每1mg 的效价不得少于2500单位。
由牛、羊、猪胰脏提取而得的一种肽链内切酶，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。
白色或米黄色结晶性粉末。
溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。
分子量24 000，pI 10.5，最适pH值7.8～8.5左右。
pH>9.0不可逆失活。
Ca2+对酶活性有稳定作用；重金属离子、有机磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性有强烈抑制。
临床用于抗炎消肿，工业上用于皮革制造、生丝处理、食品加工等。
三胰蛋白酶的作用胰蛋白酶为蛋白质水解酶，能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变性蛋质，对未变性的蛋白质无作用，因此，能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。
临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。
喷雾吸入，用于呼吸道疾病。
也可用于治疗毒蛇咬伤。
还常用于动物细胞培养前对组织的处理。
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。
不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 pH 为 8.0 、温度为37℃ 时，胰酶溶液的作用能力最强。
使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。
因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ，如： D-Hanks 液。
终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
三胰蛋白酶的制备从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶和弹性蛋白酶同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶等组分。
收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。
一般经过2～3次结晶后，可获得相当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到8000～10000BAEE单位/毫克蛋白，或更高。
试剂和器材1．试剂（1）pH2.5乙酸酸化水。
（2）2.5mol/L H2SO4。
（3）5 mol/L NaOH。
（4）2 mol/L NaOH。
（5）2mol/L HCl。
（6）0.001M HCl。
（7）硫酸铵。
（8）氯化钙。
（9）0.8 mol/L pH9.0硼酸缓冲液：取20ml 0.8 mol/L硼酸溶液，加80ml 0.2 mol/L四硼酸钠溶液，混合后，用pH计检查校正。
（10）0.4 mol/L pH9.0硼酸缓冲液（用0.8 mol/L稀释1倍即可）；（11）0.2 mol/L pH8.0硼酸缓冲液：取70ml 0.2 mol/L硼酸溶液，加30ml 0.5 mol/L四硼酸钠溶液，混合后，用pH计校正。
（12）0.05 mol/L pH8.0 Tris－HCl 缓冲液：取50mL 0.1 mol/LTris加29.2 mL mol/L HCl 加水定容至100mL。
（13）底物溶液的配制：即每毫升0.05 mol/L pH8.0 Tris－HCl 缓冲液中加0.34mgBAEE和2.22mg的氯化钙。
2、器材（1）新鲜或冰冻猪胰脏（2）食品加工机和高速分散器。
（3）研钵。
（4）大玻璃漏斗。
（5）布氏漏斗。
（6）抽滤瓶。
（7）纱布。
（8）恒温水浴。
（9）紫外分光光度计。
（10）秒表。
（11）pH试纸。
操作方法1．猪胰蛋白酶制备（1）猪胰蛋白酶原的提取猪胰脏1.0Kg（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎。
加入2倍体积预冷的乙酸酸化水（pH2.5）于10～15℃搅拌提取24小时，四层纱布过滤得乳白色滤液，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后用折迭滤纸过滤得黄色透明滤液（约1.5L）。
加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492克）放置过夜后抽滤（挤压干），得猪胰蛋白酶原粗制品。
（2）胰蛋白酶原激活向胰蛋白酶原粗制品滤饼分次加入10倍体积（按饼重计）冷的蒸馏水，使滤饼溶解，得胰蛋白酶原溶液。
将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计），使Ca2+与SO42-结合后，边加边搅拌均匀，边加边搅拌，使溶液中最终仍含有0.1M CaCl2。
用5M NaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg）轻轻搅拌，于室温下活化8～10h，（2～3小时取样一次，并用0.001M HCl稀释），测定酶活性增加的情况。
活化完成（比活约3500～4000BAEE单位）后，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，抽滤除去CaSO4沉淀。
（3）胰蛋白酶的分离将已激活的胰蛋白酶溶液按242g/L加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到0.4饱和度，放置数小时后，抽滤，弃去滤饼。
2．滤液按250g/L加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到0.75，放置数小时，抽滤，弃去滤液。
（4）胰蛋白酶的结晶将上述胰蛋白酶滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解。
用2M NaOH调pH至8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。
放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的1/4～1/5的pH8.0的0.2M硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。
放置2～5天可得到大量胰蛋白酶结晶，待结晶析出完全时，抽滤，母液回收。
（5）胰蛋白酶的重结晶将第一次结晶的胰蛋白酶产物进行重结晶：用约1倍的0.025M HCl，使上述结晶分散，加入约1.0～1.5倍体积的pH9.0 的0.8M硼酸缓冲液，至结晶酶全部溶解，取样后，用2M NaOH调溶液pH至8.0（准确）（体积过大，很难结晶），冰箱放置1～2天，可将大量结晶抽滤得第二次结晶产物(母液回收)，冰冻干燥后得重结晶的猪胰蛋白酶。
2．胰蛋白酶活性的测定以苯甲酰L—精氨酸乙酯（英文缩写为BAEE）为底物，用紫外吸收法进行测定。
苯甲酰L—精氨酸乙酯在波长253nm下的紫外吸收远远弱于苯甲酰L—精氨酸（英文缩写为BA）。
在胰蛋白酶的催化下，随着酯键的水解，苯甲酰L—精氨酸逐渐增多，反应体系的紫外吸收宜随之相应增加。
取2个光程为1厘米的带盖石英比色杯，分别加入25℃予热过的2.8ml底物溶液。
向一只比色杯中加入0.2ml 0.001mol/L HCl，作为空白，校正仪器的253nm处光吸收零点。
再在另一比色杯中加入0.2ml待测酶液（用量一般为10微克结晶的胰蛋白酶），立即混匀并记时，每半分钟读数一次，共读3～4min。
控制DA253/min 在0.05 ～ 0.100左右为宜。
绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出反应起始点吸光度随时间的变化率（即初速度）DA253/min。
胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以BAEE为底物反应液pH8.0，25℃，反应体积3.0ml，光径1厘米的条件下，测定DA253，每分钟使DA253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单位。
临床应用在生物体内，胰蛋白酶抑制剂可以调控很多重要的生理过程，在疾病的临床诊断、治疗等方面都有广阔的应用前景。
广泛的应用于急性胰腺炎、外科手术、脑血管疾病、妇产科疾病、休克以及抗肿瘤治疗中新型药物的开发。
1、治疗急性胰腺炎(Acute Pancrititis，AP) AP的发病机制与蛋白酶级联反应、血液循环障碍、白细胞过度激活产生的细胞因子和炎症介质有关。
AP发病时多种酶在胰腺内过度积累，引起胰腺本身的炎症及缺血性坏死，炎性介质进一步的释放可以导致全身性的炎性反应综合征，严重时导致患者全身器官衰竭而死。
UTI可以抑制AP的蛋白酶活性，通过抑制钙离子内流来抑制血管平滑肌的收缩，增加胰腺的血流量，保护血管内皮细胞免受氧自由基等的损伤，防止微血栓形成，改善胰腺的血液循环；能有效地减少炎症介质的释放。
TI在临床上的最早应用就是应用于治疗急性胰腺炎，日本早在20世纪80年代中期做的一系列有效实验证明了TI治疗急性胰腺炎的有效性和安全性。
目前很多临床上应用的胰蛋白酶抑制剂都对AP有显著的疗效。
近年，有人采用生长抑素和尿胰蛋白酶抑制剂联合治疗重症胰腺炎起到比单独使用时好的疗效。
2、外科手术中的应用虽然通过外科手术可以解决很多患者的病痛，但手术尤其是大型的手术后，机体处于一种非生理状态，物质代谢亢进，免疫力下降，同时伴有缺血、缺氧和各种酶、炎性介质、自由基的释放，经常会导致术后器官功能衰竭的发生。