白芍总苷对关节炎大鼠骨质破坏及T细胞表达RANKL的影响

Effects of the flavonoids extracted parts on antidepressant activities from Glycyrrhiza uralensisGuo Jia1，Zhao Weihong1，Fan Zizhou1，Cheng Ruifeng1，Zhao Jinying1，Yang Weidong1，Wang Yinhua2，Li Wei3，Peng Xiaodong1（1Department of Pharmacology，School of Basic Medicine，Ningxia Medical University，Yinchuan750004；2Ningxia Institute for Drug Control，Yinchuan750004；3Faculty of Pharmaceutical Sciences，Toho University，Chiba274-8510，Japan）Objective：To study the antidepressant effect of the flavonoids extracted parts（FEPs）from Glycyrrhiza uralensis Fisch．Method：60 male Sprague-Dawley（SD）rats were randomly assigned into6groups as control，model（stress+vehicle，po），fluoxetine group（stress+ fluoxetine3．5mg/kg，po）and3FEPs groups（stress+FEPs30，100，300mg/kg，po）．All rats were exposed to chronic unpredictable mild stress（CUMS）for28consecutive days．Forced Swimming Test，Open Field Test，Tail Suspension Test were applied to assess the anti-depressant efficacy，and the serum corticosterone level was measured by radio immunoassay method．We still performance the locomotor activ-ity test to evaluated the central never system property of the flavonoids by randomly dividing96male Kunming mouse into6groups as normal control group，diazepam group（5mg/kg，po），fluoxetine group（fluoxetine20mg/kg，po）and3FEPs groups（5，30，180mg/kg．po）．Re-sult：The flavonoids extracted parts from Glycyrrhiza uralensis can significantly short the motionless time in Forced Swimming Test（P＜0．05，P＜0．01）and in Tail Suspension Test（P＜0．05，P＜0．01）．In the Open Field Test，the flavonoids can improved the stress behavior performance by increasing rearing times（P＜0．05，P＜0．01）and the horizontal crossing numbers（P＜0．01），and by decreasing the num-ber of number of fecal boli produced（Defecation）（P＜0．01）．Still，the300mg/kg dosage of flavonoids can significantly lower the serum corticosterone level in CUMS rats（P＜0．01）and the flavonoids have no effect on the locomotor activity test in mice．Conclusion：The fla-vonoids extracted parts from Glycyrrhiza uralensis in Ningxia showed the antidepressant effect on CUMS rats and without the central excitatory effect in mice．key words flavonoids of Glycyrrhiza uralensis（甘草总黄酮）；depressant；stress；corticosterone白芍总苷对关节炎大鼠骨质破坏及T细胞表达RANKL的影响贾敏1，张寒2，杨颖3，王多宁3（1西安医学院药理教研室；2西安医学院生药教研室；3西安医学院科研中心，西安710021）摘要目的：观察白芍总苷（白芍总苷）对关节炎大鼠原、继发足肿、关节骨质破坏及其对外周血中T淋巴细胞表达破骨细胞分化因子（RANKL）的影响。

方法：分别制备佐剂型关节炎（AIA）和胶原型关节炎（CIA）大鼠模型，给药自造模第七天始，持续49天。

分别计算各组大鼠足肿胀度，对各组大鼠进行关节摄片观察骨质破坏情况，并检测各组大鼠外周血T细胞表达RANKL的量。

结果：AIA和CIA大鼠原、继发性足肿胀度增加，后肢关节的骨密度降低，关节腔间隙增宽，关节结构破坏，且T细胞RANKL表达率显著高于正常对照组；白芍总苷50mg/kg和100mg/kg剂量可不同程度地改善AIA和CIA大鼠原、继发性足肿胀，减缓后肢关节骨质破坏；同时白芍总苷50和100mg/kg剂量可降低关节炎大鼠外周血中T细胞RANKL的表达量。

结论：白芍总苷可通过抑制T细胞表达RANKL，从而抑制破骨细胞（OC）的分化，减缓关节炎大鼠原、继发性足肿胀度和关节的骨质破坏。

关键词白芍总苷；关节炎大鼠；T细胞；RANKL白芍为毛茛科植物芍药的干燥根，其有效成分主要为一组糖苷类物质，包括芍药苷、羟基芍药苷、芍药花苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷，统称为白芍总苷（total glucosides of peony，白芍总苷）。

白芍总苷的药理及临床研究发现，其具有多途径抑制自身免疫反应，对类风湿性关节炎（RA）有确切疗效。

而在Lewis［1］佐剂关节炎大鼠模型中分离得到的活化T细胞，发现其表面有RANKL的表达，提示类风湿关节炎的骨质破坏与过度活跃的T淋巴细胞的作用密切相关，因此我们观察了白芍总苷对关节炎大鼠T淋巴细胞表达RANKL的影响。

1材料与方法1．1试验药物白芍总苷冻干粉，由西安医学院科研中心提供，批号：20100423，淡黄色粉末，由亳白芍干燥根部经乙醇回流提取，AD-8型大孔吸附树脂分离纯化，芍药苷含量达76．63%。

1．2动物SD大鼠，SPF级，雄性，由第四军医大学动物中心提供，合格证号：SCXK（陕）2008-002。

1．3试剂卡介苗（BCG）：卫生部上海生物制品研究所，批号：20091121；无水羊毛脂：上海市松江县新桥化工厂出品批号：20081123。

液体石蜡：宝山县大场化工厂，批号：20091011。

牛Ⅱ型胶原（CⅡ）：Sigma公司，批号：622234。

红细胞裂解液：Becton Dickinson产品；Fluorescein isothiocyanate（FITC）anti-rat CD3、Phycoerythrin（PE）anti-rat RANKL：eBioscience公司。

1．4仪器MS-18型X光摄片机：通用电气华伦医疗设备有限公司产品；Facscalibur流式细胞仪：Becton Dickinson产品。

1．5方法参照文献［2］制备AIA大鼠模型：将BCG（灭活）：液体石蜡：羊毛脂按75（mg）：4（ml）：6（ml）比例配成CFA（其中含BCG7．5mg/ml）；参照文献［3］制备CIA大鼠模型：将牛Ⅱ型胶原（CⅡ）以0．1M的冰乙酸助溶，4ħ冰箱过夜，PBS稀释，与等量的CFA充分混合乳化，CⅡ终浓度为4mg/ml。

1．5．1白芍总苷对AIA和CIA关节炎模型大鼠骨质破坏的影响60只大鼠200ʃ20g，按体重随机分成6组，即：①正常对照；②模型；③阳性对照：雷公藤多苷片7．5mg/kg；④白芍总苷：25mg/kg；⑤白芍总苷：50mg/kg；⑥白芍总苷：100mg/kg。

除正常对照组外，其余各组大鼠右后足跖皮内注射CFA0．05ml 每只（其中含BCG7．5mg/ml），正常对照组以等体积生理盐水同部位注射。

给药自第7天开始，各组按10ml/kg连续灌胃给药49天，正常对照组和模型组给等体积生理盐水。

同法应用60只大鼠制备足跖皮内注射胶原蛋白乳化剂0．1ml每只，制备CIA模型。

用容积法测定致炎前及致炎后1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h致炎侧即右后足容积，以致炎前后足跖容积之差为肿胀度，测定原发足肿度。

用容积法测定致炎前及致炎后第8、10、12、16、20、24、28天致炎侧对侧即左后足容积，以致炎前后足跖容积之差为肿胀度，测定继发足肿度。

各组随机取6只大鼠以水合氯醛麻醉，X光摄片观察关节骨质破坏情况。

摄片条件［4］：峰值30KV，3mA，10s曝光时间，射线管与胶片之间距离为45cm。

计算各大鼠放射学指数（ra-diological index，RI）。

评分标准0－4：0：关节结构正常；1：关节软组织轻度肿胀，轻度骨密度减低，无明显关节腔改变和骨质破坏；2：关节软组织中度肿胀，骨密度中度减低，有轻度关节腔改变和骨质破坏；3：关节软组织严重肿胀，骨密度严重减低，中度关节腔改变和骨质破坏；4：关节软组织严重肿胀，骨密度严重减低，严重关节腔改变和骨质破坏。

1．5．2白芍总苷对AIA和CIA关节炎模型大鼠外周血中T细胞表面RANKL的影响同前造模分组给药，末次给药后，眼眶静脉丛静脉血0．5ml，肝素抗凝，取抗凝血50μl，分别加入羊抗鼠CD3-FITC10μl和RANKL-PE3μl，室温避光反应20min后加入红细胞裂解液2ml，充分振荡混匀后室温避光10min，1500rpm 离心5min，弃上清，加入2ml PBS平衡盐溶液振荡混匀，1500rpm 离心5min，弃上清，加入300μl PBS平衡盐溶液混匀后，用FACS Calibur流式细胞仪检测，计数20000个细胞，Cell quest软件分析。