细菌的锌抗性基因及其在生物修复中的应用

２００８年第２期生物技术通报ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ・综述与专论・收稿日期：２００７－１０－１３基金项目：生物环境科学与技术研究所科研启动项目“纳米生物技术在重金属污染生物修复中应用的研究”（编号：０６Ａ０２）作者简介：刘义（１９８２－），男，湖南衡阳人，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学专业通讯作者：何钢（１９６５－），男，湖南湘潭人，教授，硕士，从事生物技术教学和科研；Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｅｇｏｎｇ２６２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ当前我国农业环境恶化现象十分严重，据统计，我国每年因重金属污染导致的粮食减产超过１０００万ｔ，被重金属污染的粮食多达１２００万ｔ，合计经济损失至少２００亿元。

据农业部环境监测系统近年的调查，当前我国大多数城市土壤都受到了不同程度的污染，污染面积近１０００万ｈｍ２。

锌是一种重要的污染来源［１］。

对锌工业污染的治理，传统的方法有化学沉淀法、电解法、离子交换法和膜技术分离法等，这些方法最突出的缺点在于处理低浓度废水时，操作繁琐，运行费用较高，能耗大，且易造成二次污染。

而以耐锌细菌对锌化合物的特异性转化为基础的生物吸附法却具有经济、高效，无二次污染等优点，尤其适于处理低浓度污染或大面积污染等，促使人们转而分离耐锌菌株，研究抗锌机制，并探索将其应用于生物修复的可行性［２］。

１耐锌菌株的锌抗性机制作为对锌污染全球性蔓延的反应，许多微生物进化出一套耐锌基因系统以适应在含锌环境中的生存，称为锌抗性基因。

其机理为：锌抗性基因编码蛋白－ＡＢＣ（ＡＴＰｂｉｎｄｉｎｇｃａｓｓｅｔｔｅ）蛋白家族以依赖能量的方式而实现对锌的输出，有的输出系统是ＡＴＰ酶，有的是阳离子或质子反向转运体［３］。

ＡＢＣ家族首次在革兰氏阴性菌中发现，到１９９０才在革兰氏阳性菌中发现［３］。

ＡＢＣ家族包括１００多种膜转运体或通道，涉及到许多功能，如有毒物细菌的锌抗性基因及其在生物修复中的应用刘义１，２何钢１，２陈介南１周再魁１王义强１，２（１中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所，长沙４１０００４；２中南林业科技大学生命科学与技术学院，长沙４１０００４）摘要：随着工业时代的发展，人源性排放已成为环境锌污染的主要来源。

这不但破坏了生态系统的稳定，更经食物链富集，对人类健康造成严重威胁。

利用含锌抗性基因的（重组）细菌等进行锌治理是生物修复的途径之一。

阐述了细菌锌抗性基因的结构、表达产物和一些相关的作用机制，展望其在生物修复方面的应用。

关键词：细菌锌抗性基因生物修复Ｚｉｎｃ－ＲｅｓｉｓｔａｎｔＧｅｎｅｏｆＢａｃｔｅｒｉａｉａａｎｄＩｔｓＥｆｆｅｃｔｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｔｏｒａｔｉｏｎＬｉｕＹｉ１，２ＨｅＧａｎｇ１，２ＣｈｅｎＪｉｅｎａｎ１ＺｈｏｕＺａｉｋｕｉ１ＷａｎｇＹｉｑｉａｎｇ１，２（１ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０００４；２ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０００４）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｔｈｅｍａｉｎｒｅｓｏｕｒｃｅｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｚｉｎｃ－ｐｏｌｌｕｔｉｏｎｗａｓｍａｎ’ｓｄｉｓｃｈａｒｇｅ．Ｔｈｉｓｎｏｔｏｎｌｙｄｅｓｔｒｏｙｅｄｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｅｃｏｌｏｇｙｂｕｔａｌｓｏｐｏｓｅｄａｓｅｒｉｏｕｓｔｈｒｅａｔｔｏｍａｎ’ｓｈｅａｌｔｈｂｙｆｏｏｄｃｈａｉｎ．Ｏｎｅｗａｙｔｏｃｏｎｔｒｏｌｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｚｉｎｃ－ｐｏｌｌｕｔｉｏｎｗａｓｔｈｅｕｓｉｎｇｏｆｂａｃｔｅｒｉａｗｉｔｈｚｉｎｃ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅ．Ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｐｒｏｄｕｃｔ、ｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆｚｉｎｃ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅｗｅｒｅｒｅｆｅｒｒｅｄｔｏ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＢａｃｔｅｒｉａＺｉｎｃ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ２００８年第２期质的外排，营养物质的吸收，离子、肽转运和信号传递。

广泛存在细菌、植物、动物中［４］。

ＡＢＣ家族转运体结构包括４个核心区域，一般这４个核心区域都是作为一个独立的多肽而被编码，而且，这４个区域彼此分离，推测有一个区域具有这个转运体的全部功能［５］（图１）。

ＡＢＣ转运蛋白（图２）是在进化过程中非常保守，其中ＮＢＤｓ在各种有机体中，高度保守［６］。

大多数细菌利用带有溶质结合蛋白的ＡＢＣ转运体而实现对Ｚｎ２＋的高吸收。

２锌抗性基因的结构和表达２．１位于质粒上的锌抗性基因结构和表达革兰氏阴性细菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ．ｅｕｔｒｏｐｈａ是锌抗性基因位于质粒上的主要代表，同时也是兼性化能无机营养菌的代表。

这种营养菌适应性很强，对重金属离子具有很高的抗性水平。

该菌种一般都携带抗锌质粒：ｐＭＯＬ３０。

抗锌ｃｚｃ操纵元位于ｐＭＯＬ３０质粒上。

Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ有很多金属抗性系统：３个锌抗性系统，一个铬酸盐抗性系统，两个二价阳离子抗性系统。

其中阳离子抗性系统包括一个抗锌的ｃｚｃ基因抗性系统和一个抗Ｎｉ和Ｃｏ的ｃｎｒ基因抗性系统。

２．１．１Ｒａｌｓｔｏｎｉａ．ｅｕｔｒｏｐｈａ锌抗性基因ｃｚｃＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａｃｚｃＮＩＣＢＡＤＲＳ抗锌基因家族包括８个ＯＲＦ编码多肽ＣｚｃＮ，ＣｚｃＩ，ＣｚｃＣ，ＣｚｃＢ，ＣｚｃＡ，Ｃｚ，ＣｚｃＲ和ＣｚｃＳ。

ＣｚｃＣ、ＣｚｃＢ和ＣｚｃＡ蛋白构成一种含３个组成部分的化学渗透的反向转运体输出系统，这种输出系统可以实现离子输出，并导致细胞膜外的碱性增强，最终形成金属碳酸盐沉淀。

生产上已经利用这个特点来处理工业废水［８］。

２．１．２锌抗性基因表达蛋白ＣｚｃＣｚｃ输出泵由内膜（ＣｚｃＡ）、外膜（ＣｚｃＣ）和跨膜（ＣｚｃＣ）组成，它们共同发挥作用运送细胞外（图３）。

其中ＣｚｃＡ是一个中心蛋白和质子泵，属于一种阳离子反向转运体。

ＣｚｃＢ是离子结合亚基，ＣｚｃＣ是一种修饰蛋白，这种修饰蛋白能决定结合金属底物的特异性。

ｃｚｃＮ和ｃｚｃＩ是ｃｚｃ操纵元的上游调节序列，ｃｚ，ｃｚｃＲ和ｃｚｃＳ是ｃｚｃ操纵元的下游调节序列［９］。

２．２位于染色体上的锌抗性基因结构和表达革兰氏阴性细菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ原称绿脓杆菌，是锌抗性基因位于染色体上的主要代图１ＡＢＣ转运体的结构［５］ＡＢＣ蛋白包含一个由ＴＭＤｓ（ｔｗｏｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｃｅｄｏｍａｉｎｓ）形成的水孔，该水孔在细胞膜外侧形成一个很大的开口；ＮＢＤｓ（（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｓ蓝色部分）在细胞膜内侧靠近ＴＭＤｓ并有部分镶嵌在细胞膜内图２ＡＢＣ蛋白转运底物［７］①没有结合的ＡＢＣ蛋白识别底物②结合ＡＴＰ③结合的ＡＴＰ促使底物进入膜内通道，这个过程伴随快速的ＡＴＰ水解反应④ＡＢＣ同源二聚体分离，回到原始状态图３Ｃｚｃ模型［８］质子／阳离子反向转运体由内膜（ＣｚｃＡ）、外膜（ＣｚｃＣ）和跨膜（ＣｚｃＣ）组成３６２００８年第２期表。

在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。

对重金属离子也具有很高的抗性水平。

其抗锌基因编码蛋白与Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ中ｃｚｃ基因编码的蛋白很相似。

为了区别，有时也称Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ中抗锌基因为ｃｚｒ基因。

２．２．１Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ锌抗性基因ｃｚｒｃｚｒ基因包括５个：ｃｚｒＳ，ｃｚｒＲ，ｃｚｒＣ，ｃｚｒＢ，ｃｚｒＡ（图４）。

约长１２．８ｋｂ。

预测基因ｃｚｒＳ、ｃｚｒＲ编码蛋白与传感调节蛋白ＣｏｐＳ／ＣｏｐＲ和ＰｃｏＳ／ＰｃｏＲ（由质粒上的抗Ｃｕ基因编码）具有明显的相似性。

克隆的ｃｚｒ序列包含ｃｚｒＣＢＡ下游的ＯＲＦ序列，其预测基因产物涉及到芳香族化合物的分解作用。

ｃｚｒ基因有很强的保守性，且定位于菌株Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ染色体上２４００ｋｂ和２５５０ｋｂ之间。

２．２．２锌抗性基因表达蛋白ＣｚｒＣｚｒＣ蛋白与Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ的ＣｚｃＣ、Ｃｎｒ和Ｎｃｃ蛋白功能非常相似，所以也与代谢产物或有毒物质输出的外层膜因子有高度的同源性。

最明显的特征是ＣｚｒＣ的氨基酸序列的Ｎ端有一个脂蛋白信号肽剪接位点［１０］。

ＣｚｒＢ显示了与细菌膜融合蛋白（有助于阳离子、有毒物质、代谢产物等转运输出）有非常明显的同源性。

ＣｚｒＢ的Ｎ端更短，这样就缺失了锌结合位点的富集Ｈｉｓ的单元，但是，这些富集Ｈｉｓ的单元并不是必须的［１１］。

ＣｚｒＳ和ＣｚｒＲ蛋白与云南烟草野火病病原细菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ质粒编码的Ｃｕ抗性蛋白ＣｏｐＳ和ＣｏｐＲ、Ｅ．ｃｏｌｉ中ＰｃｏＳ和ＰｃｏＲ的Ｃｕ抗性蛋白、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ－ｌｉｋｅＣＨ３４的有非常高的相似性。

ｃｚｒＳ和ｃｚｒＲ基因在ｃｚｒＣ基因上游５００ｂｐ处，预测编码蛋白有２２４和４７２个氨基酸，与细菌两种自磷酸化成份有明显的相似性。

通过分析ＣｚｒＲ氨基酸序列，发现其具有保守的调节天冬氨酸活性的自磷酸化位点。

第６种ＯＲＦ编码的蛋白，在ｃｚｒＡ基因的下游，与Ｅ．ｃｏｌｉ转录促进子家族Ｘｙ１Ｓ蛋白有６２％￣７４％的相似性，这种苯甲酸甲苯金属剪接途径的转录激活因子被不同的ＴＯＬ质粒编码。

第７种ＯＲＦ，是从第６个ＯＲＦ下游的２０ｂｐ处开始，并显示了与检测苯甲酸甲苯的ｘｙｌＸ和ｂｅｎＡ基因有很高的相似性。

ｃｚｒＳＲ基因的下游和边缘序列，是ＯＲＦ８的一部分，预测ＯＲＦ８编码蛋白的氨基酸序列与Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＰＡＯ１有毒物质排出系统的ＯｐｒＭ有很高的相似性。

ｏｒｆ７和ｏｒｆ９，目前没有发现与之有相似性的ＯＲＦ。

Ｏｒｆ８和ｏｒｆ９转录方向与ｃｚｒＳＲ基因相反［１２］。

ｃｚｒ系统和上述ｃｚｃ，ｃｏｐ和ｐｃｏ系统最主要的区别在于调节基因的位置和转录的起始方向。

在Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ中，ｃｚｒＳＲ处于ｃｚｒＣＢＡ基因的上游，而且是从相反的方向开始转录，而ｃｏｐＲＳ，ｐｃｏＲＳ和ｃｚｃＲＳ被定位于金属抗性基因的下游，两个基因同方向并由一个相同的启动子起始转录。

３锌抗性基因的转移虽然目前已分离到的耐锌菌不少，但真正能够大规模直接用于生物治理的却不多，比如有些菌营养要求较高或增殖周期长，有些菌降解能力偏低不能满足实际应用等。

随着近年来分子生物学技术的飞速发展，人们已能按自己的意愿，运用基因工程技术构建具有超强锌富集能力及高选择性的基因重组植物及微生物。