2基因工程概述一
《生物技术概论》1基因工程
二、目的DNA片段的获得
（三）DNA片段的化学合成 1.合成引物 2.合成DNA寡核苷酸连杆 3.合成基因片段
第二节 DNA重组
三、DNA片段的连接
（一）DNA连接酶 （二）DNA片段之间的连接 1. 互补黏性末端片段之间的连接 2.平末端DNA片段之间的连接 3.DNA片段末端修饰后进行连接 4. DNA片段加连杆或衔接头后连接
（六）基因可以通过复制把遗传信息传递给下 一代
第一节 基因工程概述
三、基因工程操作的基本技术路线
第一节 基因工程概述
四、基因工程研究最突出的优点
打破了常规育种难以突破的物种之间的界限， 可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物 之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行 相互重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆 菌（E.coli）中表达，细菌的基因可以转移到动 植物中表达。
第二章 基因工程
第一节 基因工程概述
一、基因工程的含义
按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外 DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种 性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创 造出新的生物类型，这就是基因工程的基本含 义。
第一节 基因工程概述
二、基因工程研究的理论依据
（一）不同基因具有相同的物质基础 （二）基因是可以切割的 （三）基因是可以转移的 （四）多肽与基因之间存在对应关系 （五）遗传密码是通用的
质粒基因组、病毒（噬菌体）基因组、线粒体 基因组和叶绿体基因组也有少量的基因
第四节 目的基因的制备
二、分离目的基因的途径
（一）利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离 目的基因
基因工程的主要内容
基因工程的主要内容一、基因工程的概述基因工程是一种通过改变生物体遗传物质的结构和组成，以实现对其性状和功能进行调控的技术。
它涉及到生物学、化学、计算机科学等多个领域，是当今生命科学领域中最为重要的技术之一。
二、基因工程的主要内容1. 基因克隆基因克隆是指将特定基因从一个生物体中分离出来，并将其插入到另一个生物体中。
这样可以使得目标生物体具有某种特定性状或功能。
常用的基因克隆技术包括PCR扩增、限制酶切割、电泳分离等。
2. 基因编辑基因编辑是指通过CRISPR/Cas9等技术直接对目标基因进行修改，以实现对其性状和功能进行调控。
这种方法可以精确地修改目标DNA序列，从而达到精准治疗的效果。
3. 基因表达调控基因表达调控是指通过改变目标基因的转录和翻译过程，以实现对其表达水平和时间的调节。
常用的方法包括转录因子介导的启动子激活、RNA干扰、CRISPRi等。
4. 基因药物开发基因药物是指通过对特定基因进行调控，以实现治疗某些疾病的药物。
常见的基因药物包括基因表达调控剂、基因编辑剂等。
这些药物可以精准地靶向特定的疾病基因，从而达到更好的治疗效果。
5. 基因检测基因检测是指通过对个体DNA序列进行分析，以了解其患某种遗传性疾病的风险。
常用的基因检测方法包括PCR扩增、DNA测序等。
三、应用前景随着生命科学技术的不断发展和进步，基因工程技术在医学、农业、环境保护等领域中得到了广泛应用。
在医学领域中，基因工程技术可以用于治疗癌症、遗传性疾病等；在农业领域中，可以用于改良作物品种、提高产量和抗逆性能；在环境保护领域中，则可以用于生态修复和污染治理等方面。
四、风险和挑战尽管基因工程技术具有广泛的应用前景，但也存在着一些风险和挑战。
首先，基因工程技术可能会引起生态系统的破坏和生物多样性的丧失；其次，基因工程技术可能会导致人类健康和安全方面的问题；最后，基因工程技术还涉及到伦理和道德问题，需要加强监管和规范。
五、结论总之，基因工程技术是一种非常重要的生命科学技术，具有广泛的应用前景。
第一章 基因工程概述
或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基
本元件。
基因工程的基本概念
B 基因工程的基本定义
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，
包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的
是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技
术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模
酶工程
基因工程的基本概念
D 基因工程的基本形式
第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程
第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程
第四代基因工程 基因组或染色体的转移
基因组工程
第二节 基因工程的诞生和发展
一、基因
泛基因阶段
孟德尔遗传因子阶段
（如胰岛素）、干扰素、乙肝疫苗等 研制新型疫苗（HIV、霍乱、单纯疱疹病毒等）
生产具有药用价值的生物制剂，如水蛭素等
3. 基因诊断
– 遗传性疾病的分子诊断
– 癌症的分子诊断 – DNA指纹
4. 基因治疗
是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异 常引起的疾病，以达到治疗目的。
3．断裂基因
1个基因被间隔区分成不连续的若干区段，这种编码序列不连续的间断基因被称为 断裂基因。
4．假基因
不能合成出功能蛋白质的失活基因 。
5．重叠基因
不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的 即重叠的。
现代对基因的定义是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列， 是遗传物质的最小功能单位。
二、 基因工程的诞生
顺反子阶段
1957 年，本泽尔（Seymour Benzer）以T4噬菌 体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细结 构，提出了顺反子（cistron）概念。 顺反子是1个遗传功能单位，1个顺反子决定 1条多肽链。
基因工程 电子版
作者：吴乃虎出版社：高等教育出版社第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程一、基因操作与基因工程的关系二、基因工程的诞生与发展第二节基因工程是生物科学发展的必然产物一、基因是基因重组的物质基础二、DNA的结构和功能三、基因操作技术的发展促进基因工程的诞生和发展四、基因工程的内容第三节基因的结构——基因操作的理论基础一、基因的结构组成对基因操作的影响二、基因克隆的通用策略第一篇基因操作原理第二章分子克隆工具酶第一节限制性内切酶一、限制与修饰二、限制酶识别的序列三、限制酶产生的末端四、DNA末端长度对限制酶切割的影响五、位点偏爱六、酶切反应条件七、星星活性八、单链DNA的切割九、酶切位点的引入十、影响酶活性的因素十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性第二节甲基化酶一、甲基化酶的种类二、依赖于甲基化的限制系统三、甲基化对限制酶切的影响第三节DNA聚合酶一、大肠杆菌DNA聚合酶二、KIenow DNA聚合酶三、T4噬菌体DNA聚合酶四、T7噬菌体DNA聚合酶五、耐热DNA聚合酶六、反转录酶七、末端转移酶第四节其他分子克隆工具酶一、依赖于DNA的RNA聚合酶二、连接酶三、T4多核苷酸激酶四、碱性磷酸酶五、核酸酶六、核酸酶抑制剂七、琼脂糖酶八、DNA结合蛋白九、其他酶第三章分子克隆载体第一节质粒载体一、质粒的基本特性二、标记基因三、质粒载体的种类第二节λ噬菌体载体一、λ噬菌体的分子生物学二、λ噬菌体载体的选择标记……第四章人工染色体载体第五章表达载体第六章基因操作中大分子的分离和分析第七章基因芯片技术第八章PCR技术及其应用第九章DNA序列分析第十章DNA诱变第十一章DNA文库的构建和目的基因的筛选第十二章基因组研究技术第二篇基因工程应用第十三章植物基因工程第十四章动物基因工程第十五章酵母基因工程第十六章细菌基因工程第十七章病毒基因工程第十八章医药基因工程第十九章基因工程产品的安全及其管理第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程一、基因操作与基因工程的关系基因操作（gene manipulation）：指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。
1.1基因工程概述(第1课时)
1.1基因工程概述（第1课时）（一）DNA 重组技术的基本工具 编制：张统省 审核：秦磊 校对：王曼【学习目标】1.简述基因工程的诞生过程和发展历程；2.简述基因工程的概念3.举例说出基因工程的工具 【自学质疑】 一、回顾：1．遗传的物质基础是什么？ 2．生物体遗传的基本单位是什么？3．为什么生物界的各种生物间的性状有如此大的差别呢？4．生物的性状是怎样表达的？ 5．各种生物的性状都是基因特异性表达的结果，那么，人类能不能改造基因 呢？使原来本身没有某一性状的生物而具有某个特定的性状呢？ 6．各种生物间的性状千差万别，这是为什么呢？ 二、导学1．基因工程的概念：2. DNA重组技术的基本工具来源：主要从 中分离功能：能够识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列， 限制性内切酶 并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷 （分子手术刀） 酸二酯键断开。
错位切切割方式 平 切黏性末端切割后的DNA 末端： 平末端功能：将切下来的DNA 片段拼接成新的DNA 分子DNA 连接酶 T4 DNA 连接酶：既能“缝合”双链DNA 片段互补的黏性末端， （分子缝合针） 种类 也能“缝合”双链DNA 片段的平末端E ·coli DNA 连接酶：只能将双链DNA 片段互补的黏性末端连接①能在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制条件：②有一个至多个限制酶切点，基因进入受体细胞的载体 ③有特殊的遗传标记基因，便于筛选。
（分子运输车） 质粒（常用）种类： λ噬菌体的衍生物动植物病毒【质疑讨论】1．什么是基因工程？ 2．、基因工程的工具酶有几种？分别是什么？3．基因的剪刀是什么？有什么作用特点？结果怎么样？ 4．基因的针线是什么？其主要作用是什么？ 5．基因的运输工具是什么？有什么作用？6．运载体必须具备的条件是什么？最常用的运载体是什么？7．质粒的结构是什么？质粒上会存在某些标记基因，这些标记基因有什么用途？8.要想将某个特定基因与质粒相连，需要用几种限制性内切酶和几个DNA 连接酶处理？ 质粒的特点：①质粒是基因工程中最常用的运载体； 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒； ②是细菌染色体外（即拟核DNA 外） 能自我复制的小型环状DNA 分子；质粒 的大小只有普通细菌染色体的1%左右； ③存在于许多细菌及酵母菌等微生物中； 质粒的存在对宿主细胞生存没有决定性 的作用；④质粒的复制只能在宿主细胞内完成。
基因工程概述
第一章 基因工程
第一节 基因工程概述
•主要内容：
（1）基因工程的概念 （2）基因操作的工具 （3）基因操作的基本步骤
一、 基因工程的概念 这种技术是在生物体外，通过对 DNA分子进行人工“剪切” 和“拼接”，对生物的基因进行 改造和重新组合，然后导入受体 细胞内进行无性繁殖，使重组基 因在受体细胞内表达，产生出人 类所需要的基因产物。
三、将目的基因导入受体细胞
大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农 • 常用的受体细胞： 杆菌、酵母菌和动植物细胞等
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
方法
将目的基因导入 ——显微注射法 动物细胞 将目的基因导入 ——感受态细胞 微生物细胞
1、将目的基因导入植物细胞
特点: （1）农杆菌 转化法
1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起 始密码 B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对 mRNA的转录起调控作用 C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因 从而便于筛选 D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同 而有所差别
3、基因的运输工具——运载体 要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物 体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细 胞内去！能将目的基因送入细胞的工具就是运载体。 运载体必须同时满足 三个要求： ①具有多个限制酶切点； ②能进入受体生物细胞并 在受体生物细胞内复制并 表达； 目 ③具有标记基因。 的 基 常用的载体有质粒、 因 插 噬菌体、动植物病毒等； 入 最早用的载体是一种环状 位 点 DNA——质粒。
《基因工程B》复习提纲2020
第一章基因工程概述一、名词解释基因、基因操作、基因工程、重组DNA技术二、思考题1、简述基因工程操作的基本步骤。
2、简述基因工程操作的理论依据。
3、简述基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大发明。
第二章基因工程的工具酶一、名词解释限制性内切酶、同裂酶、同尾酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶二、思考题1、简述限制性内切酶命名的基本原则。
2、影响限制性内切酶活性的因素主要有哪些？3、影响连接反应效率的因素主要有哪些？4、大肠杆菌DNA聚合酶有哪些活性？分别简要说明其主要用途。
5、简述切口平移法标记DNA的原理。
答：首先，在Mg2+存在下利用低限量的DNase I处理双链DNA，随机产生少量切口；然后，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性在切口处向3'端平移去除核苷酸，同时，其5'→3'聚合酶活性则将切口作为引物沿5'→3'方向催化DNA合成；随着反应的进行，5'端核苷酸不断去除，3'端核苷酸不断掺入，导致切口沿着DNA合成方向移动，即切口平移。
如果在反应体系中加入标记dNTP，则这些标记dNTP将取代原有的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子。
6、简述交换（置换）法标记DNA的原理。
答：反应体系中只有一种标记的dNTP存在时，可利用大肠杆菌DNA聚合酶I或T4/T7 DNA 聚合酶的3’→5’外切酶活性从3’端降解DNA，当露出与该标记dNTP互补的碱基时，上述酶的5'→3'聚合酶活性则催化该位置发生合成反应，用标记的dNTP置换原来的核苷酸残基，产生3’端标记的DNA。
第三章基因工程的载体一、名词解释载体、质粒、噬菌体、噬菌体溶菌周期、噬菌体溶原周期、克隆载体、表达载体、穿梭载体、整合载体、表达标签二、思考题1、简述克隆载体具备的基本条件。
2、以大肠杆菌为例，解释利用α互补筛选重组质粒的原理。
第二代基因工程的名词解释
第二代基因工程的名词解释随着科技的不断发展和创新，基因工程已经成为当今社会中备受关注的领域之一。
这一领域的研究和应用极大地推动了生物技术、医学和农业领域的发展，对人类福祉产生了巨大影响。
而在基因工程领域中，第二代基因工程作为一种新型的技术越来越受到关注。
第二代基因工程是指在第一代基因工程的基础上，通过更加精确和高效的科学技术手段实现的一系列新方法。
它具有许多独特的特点，使得基因工程的应用和研究更加全面和深入。
下面我们将详细解释第二代基因工程中常用的一些名词。
1. 基因编辑（Gene Editing）基因编辑是第二代基因工程中最具代表性和引人注目的技术之一。
它指的是利用特定的酶或核酸序列，准确地修改生物体的基因组。
目前最常用的基因编辑技术是CRISPR-Cas9系统。
这一系统通过携带有指定的RNA片段来识别和切割特定的DNA序列，从而实现对基因组的编辑。
2. 基因组学（Genomics）基因组学是第二代基因工程领域的重要组成部分。
基因组学研究的是生物体中包含的全部基因，旨在解析基因组的组织、功能和调控机制。
通过基因组学，科学家们可以更好地理解基因组的结构与功能之间的关系，从而为疾病的预防、诊断和治疗提供更精准的手段。
3. 合成生物学（Synthetic Biology）合成生物学是通过合成或修改生物体中的基因和基因组，来设计和构建具有特定功能的人工生物系统的科学和工程学科。
合成生物学使得科学家们能够创造全新的生物体、合成生物产物以及开发全新的生物工艺流程。
这项技术的出现为医学、农业和工业的发展开辟了全新的道路。
4. 基因组编辑技术（Genome Editing Techniques）在第二代基因工程中，基因组编辑技术是非常重要的科学手段之一。
除了CRISPR-Cas9系统，还有其他一些基因组编辑技术，如Talen和ZFN。
这些技术在基因组编辑的过程中，能够显著提高效率和精确度，为基因疾病的治疗、农业的改良以及生物工业的发展提供更多的可能性。
基因工程的诞生和发展
第一章基因工程概述第一节基因工程的诞生和发展一、基因1．Mendel的遗传因子阶段Mendel . (1822-1884). 1856-1864豌豆杂交实验。
1866年发表论文，提出分离规律和独立分配规律1900年Mendel遗传规律被重新发现遗传学的元年Mendel提出：生物的某种性状是由遗传因子负责传递的。
是颗粒性的，体细胞内成双存在，生殖细胞内成单存在。
遗传因子是决定性状的抽象符号。
2．Morgan的基因阶段1909年丹麦遗传学家Yohannsen (1859-1927)发表了“纯系学说”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel “遗传因子”的概念。
但没有提出基因的物质概念。
1910年以后，Morgan .等提出了基因的连锁遗传规律。
说明了基因是在染色体上占有一定空间的实体。
基因不再是抽象符号，被赋予物质内涵。
3．顺反子阶段1957年，本泽尔（Seymour Benzer）以T4噬菌体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细结构，提出了顺反子（cistron）概念：顺反子是1个遗传功能单位，1个顺反子决定1条多肽链。
4.现代基因阶段（1）操纵子启动基因＋操纵基因＋结构基因（2）跳跃基因指DNA能在有机体的染色体组内从1个地方跳到另一个地方，它们能从1个位点切除，然后插入同一或不同染色体上的另一个位置。
（3）断裂基因1个基因被间隔区分成不连续的若干区段，这种编码序列不连续的间断基因被称为断裂基因。
（4）假基因不能合成出功能蛋白质的失活基因。
（5）重叠基因不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的即重叠的。
现代对基因的定义是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。
二、基因工程的诞生一般认为1973年是基因工程诞生的元年（S. Cohen等获得了卡那霉素和四环素双抗性的转化子菌落)理论上的三大发现和技术上的三大发明对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。
（一）DNA是遗传物质被证实1944年，Avery .利用肺炎双球菌转化实验1944年，美国洛克菲勒研究所的Oswald Avery等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。
基因工程知识点全
第一章基因工程概述1。
什么是基因工程，基因工程的基本流程？基因工程(Genetic engineering）原称遗传工程.从狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。
因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素.1。
分离目的基因2。
限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞，进行扩增培养5。
选择、筛选含目的基因的克隆6。
培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？➢具有对受体细胞的可转移性或亲和性。
➢具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
➢具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。
➢具有合适的筛选标记.➢分子量小，拷贝数多.➢具有安全性。
2。
质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1。
克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4。
穿梭质粒5.探针质粒6。
表达质粒3。
质粒的构建(1）删除不必要的 DNA 区域，尽量缩小质粒的分子量,以提高外源 DNA 片段的装载量.一般来说，大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定.(2)灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因，杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数（3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。
（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列，即多克隆接头（Polylinker)，便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点,使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。
（5)根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。
基因工程的概述
基因工程的概述定义：狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因；广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。
如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品；将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物；用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。
基因工程又被称为基因拼接技术或者DNA重组技术，可分为微生物基因工程、动物基因工程和植物基因工程三种生物转基因技术。
其主要特点是通过人工转移的方式，将一种生物的基因转移到另外一个受体细胞中，并使该转移基因在受体细胞中表达，从而获得全新的具有生物活性的产物。
基因工程技术为遗传物质研究和医药研究提供了重要的技术支撑。
动物基因工程技术利用先进的生物技术手段对动物基因进行编辑和改造，以达到揭示基因功能和利用基因治疗疾病等目的。
常见的动物基因工程技术包括基因敲除、基因敲入、基因编辑和转基因技术等。
通过使用基因编辑工具精确地切割和删除目标基因的特定区域，使该基因在动物个体中的表达缺失，可以揭示该基因在特定生理过程中的功能和调控机制。
基因治疗能够通过修复或替换患有遗传性疾病的动物个体的缺陷基因来达到治疗和预防遗传疾病的目的。
如利用基因编辑技术可以修复猫头鹰视网膜变性等遗传性视网膜疾病，从而改善视力。
微生物具有结构简单、迅速繁殖的特性，在其繁殖发展中应用生物基因工程技术能取得显著的效果。
将外源基因转入微生物中表达，使微生物能够生产人所需要的产品，如抗体和药用蛋白质等。
利用基因工程技术开发的重组亚单位疫苗、重组活载体疫苗及基因疫苗，有利于打破传统疫苗的局限性。
植物细胞具有全能性，在特定环境下，植物组织或者细胞能够生长出完整的植株。
所以，可以将药物基因组合到植物细胞内，通过分别培养，得到具有药物基因的植株。
植物独特的稳定遗传特性为医药领域的发展提供了充足而良好的条件。
目前，借助植物基因工程制造的药物有纯化的血清蛋白、干扰素与脑啡肽等。
基因工程习题集
《基因工程》习题集第一章基因工程概述1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？2.基因工程诞生的条件与标志分别是什么？3.简述基因工程的发展简史。
4.基因工程有哪些主要应用？5.通过本章的学习，请举两个基因工程应用的具体例子并加以简单说明。
第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？3. 噬菌体载体有哪些？携带能力分别有多大？4. 什么是人工微小染色体？有哪些类型？5. 什么是穿梭载体？6. 表达载体应该具备什么条件？7. 限制性内切核酸酶的特点与使用注意事项有哪些？8. DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用？9. DNA连接酶在什么情况下使用？如何将不同DNA分子末端进行连接？10. 碱性磷酸酶有什么作用？11. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用？12. 在基因工程研究和应用中，为什么必须使用载体来克隆外源DNA片段？13. 分析影响限制性内切核酸酶酶切的因素有哪些？14. 举例说明大肠杆菌DNA聚合酶Ι在基因工程中的应用。
15. 请描述用载体pUC18来克隆DNA片段的过程。
在这个克隆实验中，你怎样选择含有克隆片段的重组子？第三章基因工程的常规技术1. 琼脂糖凝胶电泳的原理是什么2. 琼脂糖凝胶电泳的影响因素有哪些？3. 探针有哪些类型？探针标记有哪些方法？4. 探针的间接标记有什么优点？什么是ABC荧光（显色酶）标记法？5. Southern杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？6. Northern杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？7. Western杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？8. 菌落（嗜菌斑）原位杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？9. 简述PCR技术的基本原理。
10. PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的？11. 提高PCR反应特异性的因素有哪些？12. 什么是逆转录PCR？13. 什么是反向PCR?14. 什么是多重PCR？15. 什么是荧光定量PCR？16. 什么是基因芯片技术？17. DNA芯片有哪些主要的应用？18. 什么是蛋白质芯片？19. 什么是基因组文库？其构建方法是怎样的？20. 什么是cDNA文库？它的构建流程是什么？21. 构建cDNA文库需要用到哪些工具酶？22. 合成cDNA第二条链有哪些方法？23. 简述酵母双杂交系统的基本原理。
基因工程基础知识
第一章基因工程第一节基因工程概述由于基因工程是在DNA分子水平上进行操作,因此又叫做重组DNA技术。
二．基因工程的基本工具（一）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（简称限制酶）1．来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
2．功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
3．结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（二）“分子针线”——DNA连接酶1．分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类2．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。
(三)“分子运输车”——载体1.载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存；②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
2.基因工程常用的载体有：质粒、噬菌体和动、植物病毒等。
最早应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。
三．基因工程的基本过程(一) 获得目的基因（目的基因的获取）1.获取方法主要有两种：①从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因文库中获取。
②用人工的方法合成。
★获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。
★人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。
2.利用PCR技术扩增目的基因（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
（2）目的：获取大量的目的基因（3）原理：DNA双链复制（4）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链；第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。
什么是基因工程
1.什么是基因工程的定义和概念？基因工程是一门利用分子生物学和遗传学技术对生物体的基因进行操作和改变的科学领域。
它涉及将外源基因导入到目标生物体中，或者对目标生物体的内源基因进行修改，以实现特定的目标。
基因工程的目的是通过改变生物体的基因组来增强其特定性状，或者为人类社会的需要创造新的生物体。
这种改变可以包括插入、删除或修改基因序列，以改变生物体的特征、功能或表达。
基因工程的概念基于对基因的理解和技术的发展。
基因是生物体遗传信息的基本单位，它决定了生物体的遗传特征和功能。
通过基因工程，科学家可以精确操作基因，使得生物体具有特定的性状或功能。
基因工程在农业、医学、工业等领域具有广泛的应用。
在农业上，基因工程可以改良作物，使其具有抗病虫害、耐逆性和提高产量等性状。
在医学上，基因工程可以用于治疗遗传性疾病，生产重组蛋白药物以及开发基因诊断和基因治疗等领域。
在工业上，基因工程可以用于生产生物燃料、酶和其他生物化学品。
然而，基因工程也引发了一些伦理和安全问题，例如对环境和健康的潜在影响，以及基因编辑的道德和法律考量。
因此，基因工程的发展需要平衡科学发展、社会需求和伦理原则之间的关系。
总之，基因工程是一门重要的科学领域，它通过改变生物体的基因组来实现特定目标，具有广泛的应用前景和深远的影响。
2.基因工程的历史和发展背景是什么？基因工程是现代生物技术领域中的重要分支，它的发展可以追溯到20世纪中叶。
以下是基因工程的历史和发展背景的概述：发现DNA结构和基因的本质：在20世纪的早期，科学家们开始对生物遗传的本质进行研究。
1953年，詹姆斯∙沃森和弗朗西西斯∙克里克发现了DNA的双螺旋结构，揭示了基因的分子组成和遗传信息的传递方式。
这一发现奠定了基因工程的理论基础。
重组DNA技术的出现：1972年，保罗∙伯戈和斯坦利∙科恩等科学家首次成功地使用限制性内切酶切割DNA，并将来自不同来源的DNA片段重新组合，形成了重组DNA技术的基础。
《基因工程概述》一节教学设计与实践
这不仅为攻克人类重大疾病带来希望 ， 而且也是 医学 理念 的
重大突破。当前 ， 基因工程已成为 医学 院探究性的语言启发 “ 在这样 的分子水平操作 中， 还会遇到哪些难题？又如何 解决 这些难
同生物体的基 因连接起来 ， 从而改 变生物的性状。在肯定学
生 的同 时 ， 幻灯 片给 出科 学 准确 的概 念 。前 面 有 了视 频 的铺
子船” 必须是一种小分子 、 自由进出细胞 ， 能 而且在装载外来 的 Ｄ Ａ片段后仍能照样复制的运载工具。紧接着 向同学们 Ｎ 介绍常用的基 因载体病毒和质粒 。这样 ， 在基 因工程视 频这 个大背景下 ， 因工程所需的工具就一一 出场并被学生熟悉 基
学生的头脑 中具有一定 的印象 ， 以基 因操作步骤对 于学生 所
来说不是硬梆梆的条条框框 。但是考虑到学生的实际情况 ， 改变常规一步步详细讲解步骤的方式 ， 利用一个转基因抗盐
包括 四步骤 ： ①切取“ 需基 因” ②将 “ 所 ； 所需基因 ” 与运载体
连接 ； ③运载体把“ 所需基 因” 运送到细胞 里； ④筛选 出带有
视频在教学 中往往带给学生最直观的印象和最深刻的记忆 。
运送到受体细胞 中去？继 续反 问学生临床上 外科手术 的缝 合线用 于基 因的缝合可行 吗？在学生求知兴趣高涨 的时候 ，
引入被称为 “ 分子缝针 ” Ｄ Ａ连接 酶 ， 的 Ｎ 介绍 它的发现和作 用 。打针和输液体 等方法能完成将装配好 的 Ｄ Ａ目的基 因 Ｎ 运送到受体细胞中去吗？显然是不行 的 ， 这就需要有装载基 因的运载工具—— “ 分子船” 将 基 因送 入细胞 中去 。这 “ ， 分
基因工程简介(1)
02
在肿瘤治疗方面，基因治疗已经成为一种非常有效的手段。一些基因治疗药物 已经被批准用于临床治疗，例如用于治疗慢性粒细胞性白血病的Gleevec。
03
除了肿瘤治疗，基因治疗还被广泛应用于其他疾病的治疗，例如遗传性疾病、 心血管疾病等。目前，许多基因治疗药物正在进行临床试验，为未来治疗各种 疾病提供了新的希望。
理废水、废气等。
生物修复
02
利用基因工程培育能够降解污染物的微生物，用于土壤修复、
水体净化等。
生态恢复
03
通过基因工程培育适合当地环境的植物和动物，促进生态恢复
和生物多样性保护。
04
基因工程的研究进展
基因治疗研究
01
基因治疗是指通过改变人类基因来治疗各种疾病的一种方法。近年来，随着基 因技术的不断发展，基因治疗在很多领域都取得了重要的进展。
基因克隆技术将会为濒危物种的保护提供更多的选择和机会。通 过克隆技术可以复制出濒危物种的个体或种群，增强其生存能力 和繁殖能力，维护生物多样性和生态平衡。
06
相关案例介绍
案例一：基因治疗在肿瘤治疗中的应用
总结词
基因治疗在肿瘤治疗中应用广泛，为肿瘤患者提供了新的治疗途径 。
详细描述
通过基因工程技术将外源基因导入肿瘤细胞，增强肿瘤细胞的免疫 原性，诱导宿主免疫系统攻击肿瘤细胞，从而起到抗肿瘤作用。
除了治疗遗传性疾病，基因编辑技术还可以用于研究人类基因的功能和 进化。通过编辑人类基因，可以了解人类基因在不同情况下的表现和作 用，从而更好地理解人类生命和进化的奥秘。
基因克隆技术
基因克隆是指通过人工方法将一个或多个基因片段连接到载体上，并在宿主细胞中进行复制 和表达的一种技术。
生物技术概论_基因工程
PvuII等酶切产生的平末端
5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’
3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’
PvuII 37℃
5’…G-C-T-C-A-G-OH 3’…C-G-A-G-T-C-P
P-C-T-G-G-A-G…3’ HO-G-A-C-C-T-C…5’
4、限制性内切核酸酶反应系统 反应底物 内切酶 反应缓冲液 适当的温度
5、酶切方法
单酶切方法
一个酶切反应体系 （20μ L）： 离心2S→保温1-3h（30 度或37度） →终止反应
无菌重蒸水：13μ L， 缓冲液（10×）：2μ L 底物DNA： 4μ L
（65水浴中保温1015min，或乙醇沉淀处 理，或者先用酚处理后再
（2）T4噬菌体的连接酶：连接粘性末端、齐 平末端
功用：DNA重组中促使载体与DNA连接
具互补粘性末端片段之间的连接
具平末端DNA片段之间的连接
DNA片段末端修饰后进行连接
DNA片段加连杆后或加衔接头连接
二、 基因克隆载体
基因克隆载体的含义
能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以相对稳定维持
什么是限制性内切酶？
命名原则？
由1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统 由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
1、用属名的第一个字母（大写，斜体）和种名的头两个字母 （小写，斜体）组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。
（二）基因工程研究的理论依据（为何可对基因进行
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• 基因工程：是指在体外通过人工“剪切” 和 “拼接”等方法，对生物的基因进行改 造和重新组合，然后导入受体细胞，并使 重组基因在受体细胞中表达，产生人类需 要的基因产物的技术。
• 2、1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋 结构模型
• 3、1957年美国科学家科恩伯格及其合作者 首次在大肠杆菌中发现了DNA聚合酶，可 催化体外合成DNA。（PCR）
• 4、1958年，梅塞尔森和斯塔尔发现了DNA 半保留复制机理，同年，克里克提出中心 法则。
• 5、1961—1966年尼伦伯格和霍拉纳成功 破译64种遗传密码。（RNA核苷酸=？蛋白 质氨基酸）
• 6、基因工程是指在 体外 通过人工“ 剪切” • “ 拼接 ” 等方法，对生物的 基因进行改造
和重新组合，然后 导入 受体细胞，并使
• 重组基因 在受体细胞中表达，产生人类需 要的 基因产物的技术。又称 DNA重技组术。
• 2．现代生物科学的三大基石是细胞学说、生物 进化论和遗传理论。
• 3．人类基因组计划的完成标志着生物科学新时 代的开始。
• 4．评价一篇科学论文水平和价值的指标是发表 这篇论文的刊物的水平。
• 5．21世纪生物科学的发展趋势是对生命现象及 其本质的研究不断深入和扩大，并向着微观与宏 观、基础理论与开发应用等方面全方位发展
• 又称为DNA重组技术。
• 1976年，博耶将生长抑制素释放因子的基 因转入大肠杆菌并成功表达。企业家与之 合作，1977年生产出治疗肢端肥大症的生 长抑制素释放因子。
• 1982年，美国帕米特等人采用显微注射法 将带有大鼠生长激素基因的重组DNA分子 转入小鼠受精卵内，并将早期胚胎植入小 鼠体内妊娠得到巨型小鼠
• 1983年美国科学家通过农杆菌转化法，培 育出了世界上首例转基因植物----转基因烟 草。
• 从此后，基因工程兴起。
练习
• 1、DNA双螺旋的结构模型是谁提出的？
沃森与克里克
• 2、DNA聚合酶是否可以体外催化？
可以
• 3、DNA半保留复制机理揭示了基因所以代 代相传且准确保留的分子本质。
• 4、尼伦伯格等破译的64种遗传密码
基因工程概述
基因工程发展历程
学习目标
• 1、概述20世纪50—70年代分子遗传学的基 本原理的提出与重要发现（基因工程的理 论和技术基础的提出与发现）；
• 2、了解DNA的体外重组与基因工程的开创； • 3、概述基因工程的概念； • 4、了解基因工程的应用发展。
绪论回顾
• 1 ．现代生物技术开始兴起的标志是重组DNA技 术的建立。
• 以上的原理的提出和发现，为基因工程 的 创立于发展奠定了强有力的理论与技术基 础。
基因工程的开创
• 1972年，美国斯坦福大学科学家伯格等完 成了世界上首次DNA分子的体外重组
• 1973年科恩将两种大肠杆菌质粒用同一种 限制酶切割，再用连接酶连接并转化大肠 杆菌，得到既抗卡那霉素又抗四环素的大 肠杆菌。
• 6、1967年，罗思和赫林斯基发现细菌质粒 能自我复制，还能在细菌细胞之间转移， 同年，科学家在大肠杆菌细胞中发现DNA 连接酶。
• 7、1970年，美国科学家特明和巴尔的摩在 RNA病毒中发现逆转录酶
• 8、同年，史密斯等人从流感嗜血杆菌中分 离得到特异性很强的限制性核酸内切酶。
• 9、1977年，英国科学家桑格测定了噬菌体 ϕ X174的基因组序列。（首次测序）
• 位于mRNA上，共64中，
• 将 RNA分子上的核苷酸顺序 与蛋白质 肽链中的氨基酸顺序联系起来 。
5 、质粒是什么？DNA连接酶与DNA聚合酶 作用相同吗？你认为它们有什么区别？ 细菌拟核之外的小型DNA，
不脱具转氧同有移核，自。苷连我酸接复成酶制新连能子接力链两，个并DN能A在片细段菌，细聚胞合间酶进聚行合