在Lager酵母发酵产生二氧化硫过程中线粒体可能扮演的角色

在Lager酵母发酵产生二氧化硫过程中线粒体可能扮演的角色付臣译自ASBCJ-2012-0828-01摘要：二氧化硫是酿造家寻求控制的Lager酵母主要的代谢产物之一，因为它对Lager啤酒的质量有多重复杂的影响。

酵母细胞当在高葡萄糖麦汁中发酵时，易受影响而产生较高的二氧化硫已经被广泛报道，但是确切的机理仍然没有得到充分的了解，已知当酵母细胞利用葡萄糖作为初始碳源作为生长物质时，这会对线粒体进化产生负面影响，特别是在它的仅有的膜脂，双磷脂酰甘油中。

在本研究中，我们给出了一个用双磷脂酰甘油合成促进剂（L-甲状腺氨酸和甘油）和抑制剂（肌糖），来针对改变双磷脂酰甘油的形成和线粒体进化的培养试验结果，这些结果证实在促进双磷脂酰甘油形成的条件下以适应乙醇产生，有明显低的亚硫酸盐含量（P＜0.05），另外，用呼吸缺陷型突变菌株发酵与其亲代菌株对比，通过测量亚硫酸盐产量与摄入的硫酸盐数量之比，也显示出呼吸缺陷型突变菌株有明显低的亚硫酸盐转化效率（P＜0.05）。

这些发现暗示，这种被忽略的细胞器对亚硫酸盐产生可能有至关重要的作用，我们推测它与一个关键的酶复合体辅基，亚硫酸盐还原酶有关。

这个辅基，也就是[4Fe-4S]铁硫簇，提供了亚硫酸盐还原酶电子的催化部位，以减少二氧化硫变成其它硫化物。

假设线粒体ATP水平的限制，影响了[4Fe-4S]的簇状构造或者由于胞液脱辅基蛋白的变化影响了簇的输出。

关键词：双磷脂酰甘油，铁硫簇，线粒体，亚硫酸盐还原酶，SO2导言二氧化硫（SO2）是酵母在发酵期间形成的一种重要的代谢物，它影响啤酒质量的许多特性，它作为啤酒中一种抗氧化剂的角色已经被证实，但是它在啤酒风味稳定性方面的角色是引起争议的，因为已经证明在发酵期间二氧化硫将键合风味活性羰基形成风味中性的α-羟基磺酸盐，Dufour先生暗示这些化合物在发酵期间不能被酵母还原，但在包装的成品酒中会被释放，如此导致早期的风味败坏。

二氧化硫也提供了一个胶体稳定性的角色，而且众所周知在葡萄酒发酵中作为一个抗氧化剂的作用。

但是，过了一个世纪后，知道通过人类挑战实验，二氧化硫的摄入能导致咽喉刺激、胃与肠刺激及呕吐、头痛、低色指数性贫血和其它方面的影响，因此许多国家的监管机构都制定了一个包装产品中的SO2法定限量。

再者，已经报道二氧化硫与异味有关，因此懂得在酿造过程中二氧化硫形成的控制对酿造者来说是很重要的。

在发酵麦汁中二氧化硫的形成已经被很好的描述过了。

在硫的生物合成期间，包括氨基酸蛋氨酸和半胱氨酸，硫酸盐被主动运输穿过质膜，硫酸盐通过NADPH直接还原成亚硫酸盐是不可能发生的，因为这个反应要吸收很高的能量(ΔG°′= +45.2 kJ/mol)，但是这个反应能够通过ATP硫酸化酶，通过硫酸盐的腺嘌呤基化，使它的电位降低而完成。

图1中给出了相应的步骤，图示说明了酸性亚硫酸盐(HSO3–)如何形成，哪一个是还原HSO3–为硫化物的亚硫酸盐还原酶(SiR)的底物。

尽管酵母对细胞内HSO3–的累积有一个基本的耐受性，但它可能是细胞毒素，因此通过SSU家族基因调节的防护机制存在以便向细胞外泵出有毒中间物。

减少SIR活性将会使发酵麦汁中SO2含量提高已经被提出，目标对准MET基因，尤其是MET1、MET5、MET8和MET10基因的基因控制研究已经证明对亚硫酸盐产生有明显的影响。

酿酒酵母的SIR是一个604KDa的蛋白质，它有一个α2β2构造，也包含参与HSO3–还原的辅基，这些基团的其中两个与基于细菌亚硫酸盐还原酶同化力的此反应密切相关。

siroheme（可能叫白亚铁血红素）分子（图2A），一个包含四氢卟啉的铁，和一个由一个[4Fe-4S]五环辛烷组成的硫簇铁(ISC)（图2B）合作，把推挽式的6个电子转移到SIR催化部位的酸性亚硫酸盐键上，这个所推荐的HSO3–完全还原是由Crane等人的研究提供的（图3），对于解释一旦HSO3–键合到催化部位上便没有中间体被释放出来是很重要的。

因此，siroheme（可能叫白亚铁血红素）或ISC的效能和结构的任何改变都能导致SIR活性的降低，似乎是合理的。

图1. 酿造酵母在硫酸盐同化途径过程中，亚硫酸盐的形成和排出。

图2. 亚硫酸盐还原酶复合体的辅基siroheme（可能叫白亚铁血红素）（a）和[4Fe-4S]硫簇铁（b）。

研究者已经证明的一个现象是高葡萄糖含量麦汁的影响导致了亚硫酸盐生成的增加，Gyllang等人建议，较高的亚硫酸盐量是在糖酵解和酒精发酵期间，生成的乙醛和丙酮酸盐在细胞内积累的结果，两者都与亚硫酸盐键合，这就阻止了SIR酶使其减少。

从另一个角度看，通过后来O’Conner-Cox先生及同事对于酿造过程中酵母线粒体角色的开创性研究，知道了当酵母利用葡萄糖作为碳源时，酵母线粒体的发育被束缚，线粒体是包含两个膜的细胞器，内膜和外膜，两者都含有独特的被称作双磷脂酰甘油(1,3-二[1′,2′-二酰-3′磷酰基-sn-甘油]-sn-甘油; CL) 的脂类（图4）。

双磷脂酰甘油的生物合成与三个相继的反应有关（图5），磷脂酰甘油磷酸(PGP)合成酶催化了通过核苷酸胞腚-5′-三磷酸-1，2-二脂酰甘油(CDP-DG)和甘油-3-磷酸转化形成CL的关键步骤，通过PGP磷酸酯酶作用，PGP去磷酸作用形成磷脂酰甘油是中间步骤，最后的步骤与CL合成酶有关，在这个地方发生了磷脂酰基从CDP-DG转移到PG上。

一些最新的证据表明，葡萄糖抑制了双磷脂酰甘油的形成，其它的研究也已经证实肌糖抑制了PGP合成酶的活性，这对于双磷脂酰甘油的形成是一个关键步骤。

许多研究也显示甘油可能通过增强CRD1（结构基因编码CL合成酶）的表达而提高了线粒体的发育，并且甲状腺氨酸（甲状线素）已经显示出在老鼠心脏线粒体中对这些酶的活性起促进作用。

CL和许多键合蛋白质的线粒体膜相互作用，它与呼吸链酶复合体I、III, IV, 和V （ATP合成酶）及腺嘌呤核苷酸转运体（AdN转移酶）相关联，它也在蛋白质进入线粒体过程中起了到关重要的作用。

再者，CL的缺乏会导致线粒体DNA的不稳定、活力减小及在高温下能起作用的呼吸细胞减少。

在最近的研究中，研究的焦点是用改变酵母中CL的含量，产生呼吸缺陷型酵母细胞，评价对发酵的影响来确定线粒体与亚硫酸盐产生的相关性，测定到线粒体起了一个作用，机制与前面提到的一个关键的SIR辅基有关。

图3. Crane等人推荐的酸性亚硫酸盐还原成硫化物的反应。

电子通过[4Fe-4S]簇被传递，siroheme（可能叫白亚铁血红素）键合到底物上，同时质子被转移到释放出的H2O中，氧原子被转移到酸性亚硫酸盐还原的6个电子上形成硫化物。

图4. 图示说明的4个不饱和酰基部分的双磷脂酰甘油（心肌磷脂抗原，CL）结构。

图5. CL生物合成途径材料和方法实验室规模发酵发酵用安装有胶塞并顶部用石蜡膜封口的500ml无菌真空厄伦美厄烧瓶，在15℃冰箱中完成，为了把氧的进入降到最低，橡胶管被连接到另一端浸入水中的真空口上，以允许CO2的逸出及阻止氧气的进入。

所有发酵都是控制可发酵性糖90%是葡萄糖，10%是麦芽糖，没有麦芽三糖的17°P麦汁。

发酵10天后，取样分析，所有样品都立即在温度4℃，3,300 ×g速度下离心30min以去除酵母。

离心后，嫩啤酒样品转入另一容器立即冷藏直到分析，如果进行H2S分析，样品冷贮需要在24小时内分析。

呼吸缺陷型酵母培养呼吸缺陷型（RD）酵母突变菌株收集自我们的常规酵母质量研究室RD平皿分析，标准琼脂培养基用于在30℃下有氧培养酵母96小时，双倍的带有琼脂的磷酸缓冲液(6.1 g 的NaH2PO4, 5.8 g的Na2HPO4,15.0 g 的琼脂同500 mL 的DI 水混合)和双倍的颜色指示剂(1.0 g 的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）同500ml DI水混合）混合成等份的无菌混合物，倾倒在平皿上，平皿在室温下面向上培养4小时，包含TTC(2.0 g/L)的溶化的软琼脂用做颜色指示剂覆盖物。

用无菌环从TTC覆盖的与RD相关的显示白色形态的两个菌落中挑取酵母，接种到培养烧瓶中，用于培养的麦汁初始体积是50ml。

麦汁和酵母被转移到一个无菌的塑料厄伦美厄烧瓶中，放在一个轨道振荡器中振荡24小时，培养温度要准确控制在25℃，酵母要在同样的条件下使用250ml和1000ml更大规模的分别培养48小时和72小时，一旦足够的酵母数量产生，酵母就要再接种三次，以便增殖有氧生长的突变体，从每三次培养中收集啤酒样品，分析酒精、外观发酵度、CO2和残余的蛋氨酸和硫酸盐。

RD酵母实验在添加酵母之前，收自于生产初始状态一系列控制发酵的健康新鲜酵母（活力97.2%）以与RD酵母进行对比，RD酵母和控制酵母菌落的细胞浓度用血球计分析以测定接种比例，目标是细胞浓度达到19.0 ×106个细胞/mL，麦汁用一个无菌气体分散装置充气，使氧气达到饱和度(8–10 mg/L)，使用简单的完全随机化的设计，使每一个酵母实验都被接种三次。

CL变更实验为了改变CL的形成，酵母在三个不同条件下培养，酵母泥以7ml的等分部分用上述讨论的各种处理方式在40ml的无菌水中培养18小时，以改变双磷脂酰甘油的形成：肌糖（1 mg/mL）、甘油（40%体积）、15.0 µg/mL的甲状腺素、和无菌水。

培养的酵母泥添加到氧气含量为12.0mg/L的麦汁中。

肌糖购买于本地的小卖部，甘油从Sigma-Aldrich公司获得（纯度99.5%光谱测量级），甲状腺素（左旋甲状腺氨酸钠）药片从Virbac AH有限责任公司获得，作为完全的随机化设计，所有的实验都被接种三次。

H2S分析啤酒中的硫化氢含量用气相色谱（GC）（安捷伦6890A）测量，气相色谱柱是一个MXT-1（100%二甲基聚硅氧烷交联），60m，0.53mmID，7 µm膜厚度，编目号#70193，一个安捷伦顶空自动进样器（安捷伦G1888）用于净化和分离样品，一个Sievers 355硫化学发光检测器（SCD）用于区分硫种类，发酵结束后离心的样品被冷贮（大约6℃）在干净的40ml的玻璃小瓶中（安捷伦顶空螺旋盖）直至分析。

气相色谱灶温条件如下：初始温度50℃，以10℃/min的升温速率升到80℃，接着以10℃/min的升温速率220℃，运行9min。

氨基酸用带有可编程荧光检测器和有柱前衍生化的四个一组泵的安捷伦1100系列的高效液相色谱仪（HPLC）测定氨基酸，首先用苯二醛和3-巯基丙酸控制伯氨基酸的衍生，然后仲氨基酸用9-荧光尼龙甲氧氯甲酸酯衍生，然后衍生物在一个反相Zorbax Eclipse AAA柱（安捷伦分析柱，4.6 ×150 mm, 3.5 µm)上分离，并且用安捷伦1100系列可编程荧光检测器进行荧光检测，蛋氨酸是令人感兴趣的伯氨基酸，半胱氨酸不能用这个方法检测。