布鲁氏菌试管凝集试验

然后将试验管和对照管充分 混匀后，放于37℃温箱中 20-22小时后取出，在室温 下放置2个小时，以比浊管 为标准判定结果。
结果的判定
判定比浊管的制备:每次试验须配制比浊
管作为判定的标准依据. 配制方法是:取本次试验用的抗原稀释液 （一般1:10）5-10毫升，加入等量的 0.5%石碳酸生理盐水作倍比稀释，按下 表配制比浊管 比浊管的配制
试管凝集试验
1897年莱特氏等(Wright)与其同 事发现患该病的病人血清与马尔 他细菌的培养物产生了凝集现象， 遂称之为莱特氏凝集反应，成了 迄今常用的血清学诊断方法之一。
设备及试剂
试管凝集抗原 被检血清 0.5%的石碳酸生理盐水 吸管 试管 试管架 孵箱

操作步骤
评价
该方法特异性较好，敏感性也高，因此适 用于检疫和临床诊断。 由于该试验有时出现前带现象和封闭现象， 所以有时也出现假阴性结果，必要时和其 它方法联合应用。

抗原抗体反应的特点
抗原抗体结合的特异性
抗原抗体结合的基础是抗原决定簇与抗体 的抗原结合部位之间 的反应.这种反应是专 一性的.例如:布氏杆菌只能与布氏杆菌抗体 相结合,而不能与痢疾杆菌抗体相结合.
评价


此法简便、快速、容易操作，适于基层大面积检 疫； 此法有一定敏感性，检查牛的阳性率稍高于绵羊、 山羊。 因为在酸性环境下IgM活性受抑，该法主要是检 查IgG类凝集抗体，所以特异性较好，与补体结合 试验、二巯基乙醇（2-ME）试验和抗球蛋白 （Coomb’s0）试验有较高的吻合率。 该法受制备抗原时条件影响较大，所以每批制备 抗原应予以检查、标化方可应用。
布鲁氏菌血清学检验
山西省疾病预防控制中心 张秋香
免疫学基础
由于布鲁氏菌培养的营养条
件苛刻而且时间长，所以布 鲁氏菌的血清学诊断越来越 受到重视。
主要是根据相应抗原抗体可以 在体外发生特异性结合并呈现可见 反应的原理,用已知抗原(或抗体)检 测体液中未知的抗体(或抗原).由于 试验时通常是用患者血清作为待检 材料,所以检测抗原抗体的体外试 验又称为血清学试验或血清学反应.
操作步骤


加入抗原:先以0.5%石碳酸生理盐水将抗原原液做 适当稀释（一般是作1:10稀释）,稀释后的抗原加 入各稀释的血清管（第一管不加，作为血清对 照）,每管0.5毫升,混匀。加入抗原后，第二管至 第五管每管总量为1毫升，从第二管起血清稀释度 分别为1:25 1:50 1:100 1:200，从第一管再吸出 0.5毫升，剩1毫升。 对照管的制作: 抗原对照（适当稀释的抗原加石碳酸盐水） 被检血清对照 阴性对照（阴性血清稀释后加抗原） 阳性对照（阳性血清稀释到原有滴度加抗原）

在玻片上加0.03ml被检血清，然后加入虎 红平板抗原0.03ml，充分混匀，在5分钟内 观察结果。
(四) 结果判定




有二种方法，第一种是，出现可见的凝集反应就判为阳 性； 另一种用“+”表示凝集程度按下列标准用加号记录反应 强度： ++++：出现大的凝聚片或小的粒状物，液体完全透明， 100%凝集 +++：有明显的凝聚片，液体几乎完全透明，75%凝集 ++：有可见的凝集片，液体不甚透明，50%凝集 +：液体混浊，只有少量粒状物，25%凝集 -：液体均匀混浊
根据各管中上层液体的清亮程度记录结果， 特别是50%清亮度（++）对判定结果关系 较大，一定要与比浊管对比判定 血清对照为清亮透明无沉淀,抗原对照为均 匀混浊在两种对照管都成立的情况下，才 可判定试验管，否则应重做。对沉淀需要 经验判定。



“++++”完全凝集，上清液100%清亮
“+++” 几乎完全凝集，上清液75%清亮 “++”显著凝集，上清液50%清亮 “+” 微量凝集，液体25%清亮 “-” 无凝集，液体不清亮 确定每份血清滴度是以出现“++”及以上的 凝集现象的最高血清稀释度

被检血清的稀释:一般情况下,每份血清用5支小试 管,第一管加入2.3毫升石碳酸生理盐水,第二管不 加，第三、四、五管各加入0.5毫升.用1毫升吸 管吸取被检血清0.2毫升,加入第一管中,混匀。混 匀后, 以该吸管吸取第一管中血清加入第二和第 三管各0.5毫升，以该吸管将第三管混匀，并吸 取0.5毫升加入第四管,依次稀释到第五管,混匀后 从第五管吸出0.5毫升弃去.如此稀释后,从第二管 起血清稀释度分别为1:12.5 1:25 1:50 1:100
诊断标准

没有进行过菌苗接种的人、畜血清试验的标准是： 人、牛、马、鹿、骆驼等大家畜血清为1： 100( ++)及以上者为阳性，1：50(++)为可疑。 猪、羊(绵羊、山羊)、犬等小家畜血清在1： 50(++)及以上者为阳性，1：25(++)为可疑。 对可疑反应的人和动物应在10-25天内重复检查， 以便进一步确定诊断。
影响试验结果的因素及注意事项



受检血清应新鲜、无溶血、无污染，存放血清处 温度不能超过10℃，采血后应于3—4日内进行检 查，因放置时间过长可能会导致血清效价降低。 遵守操作规程：所用的器材要清洁、干燥，试剂 的加量一定要正确，放入温箱的温度和时间都要 按要求，否则都影响结果。每份血清和抗原均要 有对照。 高渗盐水作凝集反应，一般浓度在10~12%，一 般切记人血清不能用高渗盐水。
抗原抗体 结合的表面性

抗原抗体的结合仅仅是分子表面的结合， 虽然两者的结合相当稳定，但结合后的抗 原抗体，其本身的结构，生物学活性均未 遭到破坏,并且在一定条件下可解离.即抗原 抗体的结合是可逆的,所以,解离抗原抗体复 合物的方法可用于 提取,纯化抗原或抗体.
抗原抗体结合的适当比例
抗原是多价的(分子表面有多个抗原决定簇)，抗体 一般是双价的，(分子的末端有两个抗原结合部 位)，所以，二者的结合就有一个比例关系问 题．只有抗原抗体比例适当，才能形成较大的， 容易观察的复合物．如若比例不当,就不能形成较 大复合物.所以试验时要根据不同情况对抗原抗体 (甚至两者同时)进行连续稀释,以便更好地提供两 者最适的比例.颗粒性抗原,因其分子较大,形成可 见的凝集物质所需的抗体较少,所以试验时一般把 含有抗体的血清做连续稀释,尽管如此,有时还能在 含有较多抗体的前列试管中,因两者比例不当不呈 现可见反应,这种现象被称为前带现象.



前带现象产生的原因 ① 胶体粒子学说：血清稀释度低所含的胶体粒子 多，它影响抗原抗体的结合，而稀释度高的则含 胶体粒子少，所以出现凝集。 ② 不完全抗体学说：血清中因存在不完全抗体竞 争抗原，所以在低稀释度的管中不凝集。 ③ 抗原抗体比例失调，也就是抗体过剩或血清内 含有过多防腐剂，严重污染可造成前带现象的产 生，封闭抗原的干扰。
血清学试验的对照

由于参加血清学试验的成分和试验过程中可能 出现的影响因素很多，所以需要在正式试验的 同时，在与正式试验完全一致的条件下分别对 抗原，抗体等各种成分做对照检查。这些对照 检查和对照试验对观察和分析试验结果是绝对 必要的。另外，诊断制品一定要在有效期内使 用。
谢谢
试管凝集反应标准比浊管配制

管号 1 2 3 4 5
பைடு நூலகம்
抗原稀释液（ml） 生理盐水（ml） 透明度 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 100% 75% 50% 25% 0%
标记 ++++ +++ ++ ＋ －
结果记录


作凝集反应时，有个别血清会出现前带现象，即 稀释度低的血清管内(或血清量多的格)不发生凝 集，而稀释度高的管内(或血清量少的格)出现凝 集，这叫做前带现象。如果某血清在平板凝集反 应中出现了前带现象，那么做试管反应时应多做 几个管，多采用几个稀释度。 氯化钠的含量增高对血清反应有明显的影响，盐 的浓度越高，反应的敏感性提高，因此在兽医界 为了克服凝集反应中的阻抑抗体的干扰，对羊血 清采用高渗盐水作凝集反应，一般浓度在 10~12%，切记一般人血清不能用高渗盐水。
试验。由于所用的抗原是酸性 （PH3.6—3.9）带色的抗原，该抗原 与被检血清作用时能抑制血清中的IgM 类抗体的凝集活性、检查出的抗体是 IgG类，因此提高了该项反应的特异性。
器材与试剂

虎红平板凝集抗原、被检血清、清洁脱脂 玻片或有凹形孔的玻片、0.1ml吸管或微量 加样器、混合棒或牙签
试验方法
血清学检查既可协助早期诊断，还可
确定是否复发或重复感染。 感染1-2周后，患者血清中出现IgM抗 体，可以用凝集试验或抗人球蛋白试 验检测． 感染３周后，患者血清中出现IgG抗体， 可以用补体结合试验，荧光抗体或 ELISA检测．
虎红平板的凝集反应（RBPT）
原理
该试验又称为班氏孟加拉红平板凝集
抗原抗体结合的阶段性 抗原抗体的结合分为两个阶段 第一阶段:特异性结合阶段,反应快, 只需几秒或几分即可完成.但不出现 肉眼可见的反应. 第二阶段:抗原抗体结合的可见阶段, 这一阶段的反应是可见的,反应较慢, 常需几分钟，几十分钟或更久。
抗原抗体反应的影响因素



电解质；抗原抗体反应必须有适量的电解质参加，否则不 出现可见反应，一般拿0.85化钠溶液做为抗原或抗体的稀 释液。 温度：适当提高温度可以增多抗原与抗体的碰撞机会。促 进反应现象加速出现。一般最适温度范围在0-56之间。在 这个范围内，温度低，对反应的促进作用较小，但生成的 复合物不易解离。温度高，对反应的促进作用较大，但生 成的复合物容易解离。实际工作中，多数反应在37进行。 在试验过程中，一般在加温之前，适度的振摇抗原抗体的 混合液，也能增加两者之间的碰撞机会。 酸碱度：一般以6.0-8.0为宜，若低至3左右，因接近细菌 的等电点，可引起细菌性抗原非特异性的酸凝集，影响试 验结果。