高中生物选修1优质学案：2.3 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

课题3 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
学习目标
1.能利用选择培养基分离细菌。

2.能运用稀释涂布平板法测定土壤中分解尿素细菌的数量。

|预知概念|
一、研究思路
1.筛选菌株
(1)筛选的原理
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

(2)选择培养基
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

(3)分离分解尿素的细菌的选择培养基
以尿素作为唯一氮源的培养基。

2.统计菌落数目
(1)测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。

(2)稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目
①为了保证结果准确，一般设置至少三个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。

②统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。

3.设置对照
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

二、实验设计
1.操作步骤：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察。

2.土壤取样一般要铲去表层土，因为绝大多数细菌分布于距地表约3～8__cm的
土壤层。

3.样品的稀释：不同的微生物需要稀释的倍数不同，请填写下表：
4.微生物的生长受温度的影响，菌落的数目和特征是观察的主要内容。

三、操作提示
1.无菌操作：取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。

称取土样要在火焰旁进行。

稀释样品要在火焰旁操作。

2.做好标记：要对平板和试管进行标记，尤其进行系列稀释时要按稀释度递增顺序将试管排列成行。

四、课题延伸
分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，使培养基的碱性增强。

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

|过程评价|
1.筛选分解尿素的细菌的培养基以尿素为唯一氮源，且为固体培养基()
2.利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数()
3.统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计()
4.利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数()
5.利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量()
6.培养分解尿素的细菌，培养基的pH值会增大()
[答案] 1.√ 2.× 3.× 4.× 5.× 6.√
|联想·质疑|
★尿素为唯一氮源的培养基
★脲酶的检测
★土壤中分解尿素细菌的分离与计数
如何进一步鉴定选择培养基上的菌落是分解尿素的细菌？
提示：在培养基中添加酚红指示剂，培养基变红则可以初步鉴定为分解尿素的细菌。

科学探究1分解尿素的细菌的分离与鉴定
下面是筛选分解尿素的细菌的培养基的配方，请分析：
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖10.0 g
尿素 1.0 g
琼脂15.0 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
(1)________培养基。

(2)该培养基是如何实现对分解尿素的细菌的筛选的？
(3)如何证明该选择培养基的确起到了筛选作用？
(4)如何证明所用的选择培养基没有受到环境污染？
提示(1)固体选择
(2)该培养基中唯一氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能够分解尿素，而不能合成脲酶的微生物不能分解尿素，会因缺乏氮源而无法生长繁殖，所以用该培养基能够筛选出分解尿素的细菌。

(3)同时设置牛肉膏蛋白胨培养基并进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目；若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，则证明了选择培养基的确起到了筛选作用。

(4)将未接种的上述培养基与接种的上述培养基同时培养，观察是否有菌落的产生；若未接种的培养基无菌落产生，则证明培养基没有受到杂菌污染。

1.三种筛选目的菌株的方法
微生物筛选过程中，除选择培养基外，另外还需设置两组对照培养基，以提高实验的说服力和科学性。

原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此，能够在选择培养基上生长的不一定都是目的菌株。

4.分解尿素的细菌的鉴定原理
分解尿素的细菌能够合成脲酶，脲酶可将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。

因此，在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红，培养分解尿素的细菌时，培养基出现红色。

[探究应用]
1.(2017·全国卷Ⅰ)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。

回答下列问题：
(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________________。

能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是_______________________________________________________，
但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是_____________________________________________________(答出两点即可)。

(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是_____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________。

(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有_____________________________________________________________________ ______________________________________________________(答出两点即可)。

[解析](1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。

能分解尿素的细菌是一种分解者，属于异养型生物，不能以尿素的分解产物CO2作为碳源。

能分解尿素的细菌可以以葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是：一方面可氧化分解为细胞生命活动提供能量，另一方面其代谢中间产物可为多种有机物的合成提供原料。

(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择以尿素作为唯一氮源的选择培养基，而其他两组都含有含氮物质NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3不能起到筛选作用。

(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用：KH2PO4和Na2HPO4构成缓冲液，可维持培养基的pH相对稳定；KH2PO4和Na2HPO4能为微生物生长提供无机盐。

[答案](1)脲酶分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物为
细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料(2) 尿素其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用(3)为细菌生长提供无机盐离子，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
2.在分解尿素菌的分离和鉴定中，对先后用到的两种培养基，叙述正确的是()
A.加入酚红指示剂作为选择培养基，再加入唯一碳源作为鉴别培养基
B.加入唯一氮源作为鉴别培养基，再加入酚红指示剂作为选择培养基
C.加入唯一氮源作为选择培养基，再加入酚红指示剂作为鉴别培养基
D.加入酚红指示剂作为选择培养基，再加入唯一碳源作为鉴别培养基
[解析]在分解尿素菌的分离和鉴定中，应该先加入尿素作为分解尿素菌的唯一氮源，因其合成脲酶，分解尿素，产生氨，氨呈碱性，则再加入酚红指示剂培养细菌，呈红色。

[答案] C
科学探究2微生物数量的统计
下面是土壤中微生物的分离与计数的实验流程示意图。

分析回答：
(1)图示统计菌落数目的方法是____________________，利用该法统计的菌落数往往比活菌的实际数目________，原因是________________________________。

(2)分离不同的微生物要采用不同的稀释度，原因是_________________________ _____________________________________________________________________；
稀释操作成功的标准是____________________________________________。

(3)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。

在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。

①甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果
是否真实可靠？为什么？
②乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。

该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？
(4)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到了以下数据，试计算1 g样品的活菌数。

平板
稀释度
平板1 平板2 平板3 104
菌落数太多，难以
计数
菌落数太多，难以
计数
菌落数太多，难以
计数
105212 234 287
10621 23 18
提示(1)稀释涂布平板法少当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
(2)土壤中各种微生物的数量是不同的得到2个或2个以上菌落数在30～300的平板
(3)①不真实。

为增强实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布3个平板，统计结果后计算平均值。

②不合理。

微生物计数时，如果实验中出现重复实验结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，需重新实验，而不能简单地舍弃。

(4)105的稀释度下取0.1 mL涂布的三个平板的菌落数在30～300，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244。

进一步可以换算出1g样品中活菌数为(244÷0.1)×105＝2.44×108。

测定微生物数量的方法的比较
测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法(活菌计数法)和显微镜直接计数法。

二者的比较如下：
注：表中400和10 000都是常数。

[探究应用]
1.(2018·全国卷Ⅰ，37)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。

在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M 培养基。

回答下列问题：
(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制________的生长，加入了链霉素的培养基属于________培养基。

(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有________(答出两点即可)。

氮源进入细胞后，可参与合成的生物
大分子有________(答出两点即可)。

(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。

加入的显色剂是________，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是_____________________________________ ____________________________________________________________________。

(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。

有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是
____________________________________________________________________。

[解析](1)在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

若M培养基是用于真菌的筛选，则应加入链霉素以抑制细菌的生长，其属于选择培养基。

(2)马铃薯浸出液中含有淀粉、蛋白质、脂质、无机盐、水等多种物质，因此，除氮源外其中还有微生物生长所需要的碳源、无机盐等营养要素。

进入细胞的氮源可参与合成蛋白质、核酸(DNA、RNA)等含氮的生物大分子。

(3)加入显色剂碘液后，淀粉遇碘变蓝，而淀粉的水解产物则不发生这种反应。

若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，土壤中能产生淀粉酶的微生物可将淀粉分解，菌落周围就会出现透明圈，这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选能产淀粉酶的微生物了。

(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，结果的重复性太差，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。

[答案](1)细菌选择(2)碳源、无机盐蛋白质、核酸
(3)碘液淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈
(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差
2.下列说法错误的是()
A.因为土壤中各类微生物的数量不同，所以为获得不同类型的微生物，要按不同的稀释倍数进行分离
B.测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同
C.只有得到了3个或3个以上菌落数目在30～300的平板，才说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数
D.牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落
[解析]样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数目，土壤中各类微生物数量不同，含量最多的是细菌，大约占70%～90%，其次是放线菌，最少是真菌，所以为获得不同类型的微生物，要按不同的稀释倍数进行分离；在同一稀释度下只要得到两个或两个以上的菌落数目在30～300的平板，就说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数；验证选择培养基是否具有选择作用，需设立牛肉膏蛋白胨固体培养基作为对照，若后者的菌落数明显大于前者，说明前者具有筛选作用。

[答案] C
1.分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是()
①加尿素②不加尿素③加琼脂④不加琼脂⑤加葡萄糖⑥不加葡萄糖
⑦加硝酸盐⑧不加硝酸盐
A.①③⑤⑦
B.②④⑥⑧
C.①③⑤⑧
D.①④⑥⑦
[解析]要分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中尿素应是唯一的氮源，不能加硝酸盐；在固体培养基上形成菌落，要加琼脂作凝固剂；分解尿素的细菌是异养生物，要加有机碳源(如葡萄糖)。

[答案] C
2.下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是()
A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上
C.将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48 h
D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300 以上的实验组平板进行计数
[解析]检测细菌总数，用蒸馏水配制培养基，常用高压蒸汽灭菌法灭菌后，取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，将实验组和对照组放置在适宜条件下培养，在确定对照组无菌后，选择菌落在30～300的平板为代表进行计数，D错误；A是培养基的灭菌方法，B设置了一系列对照实验，C是细菌的培养方法。

[答案] D
3.下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验”的叙述，正确的是()
A.分解尿素的细菌能产生脲酶，将尿素分解产生氮气
B.用选择培养基选择出分解尿素的细菌，杀死其他微生物
C.统计尿素分解菌的数目时，以菌落数在300以上的平板进行计数
D.用尿素为唯一氮源、加有酚红指示剂的培养基培养尿素分解菌，指示剂变红[解析]分解尿素的细菌能产生脲酶，将尿素分解为氨和CO2，A错误；用含尿素的选择培养基选择出分解尿素的细菌，目的是淘汰不能分解利用尿素的其他微
生物，B错误；统计尿素分解菌的数目时，以菌落数在30～300之间的平板进行计数，求其平均值，C错误；用尿素为唯一氮源、加有酚红指示剂的培养基培养尿素分解菌，指示剂变红，D正确。

[答案] D
4.如图是从土壤中筛选分解尿素的细菌的过程，请回答下列问题：
(1)图中选择培养基应以____________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加____________作指示剂，分解尿素的细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。

(2)土壤中的细菌将尿素分解为__________之后，才能被植物利用，土壤中的细菌之所以能将尿素分解，是因为细菌能合成____________。

(3)制备实验所需的培养基时，在各成分都溶化后和分装前，要进行的是________和灭菌，对培养基进行灭菌的常用方法是__________________。

倒平板时要待平板冷凝后，将平板倒置，其主要原因是____________________。

(4)在3个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为191、173和182。

该过程采取的接种方法是________________________，每克土壤样品中的细菌数量为____________________个；与血细胞计数板相比，此计数方法测得的细菌数目较__________(填“多”或“少”)。

[解析](1)能合成脲酶的细菌才能分解尿素。

配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。

分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强。

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。

(2)分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨。

(3)制备实验所需的培养基时，在各成分都溶化后和分装前，要进行的是调整pH和灭菌，培养基用高压蒸汽进行灭菌。

倒平板
时防止培养皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染，因此要待平板冷凝后，将平板倒置。

(4)用于计数细菌菌落数的常用方法是稀释涂布平板法，统计的菌落数应介于30～300之间，故选择细菌菌落数为191、173和182的平板计数。

每克该土壤样品中的菌落数对应的应该是每毫升菌液中的细菌数目，所以每克该土壤样品中的菌落数为(191＋173＋182)/3÷0.1×105＝1.82×108个。

由于两个或多个细菌连接在一起时，往往统计的是一个菌落，所以用此计数方法测得的细菌数较少。

[答案](1)尿素酚红红(2)氨脲酶(3)调整pH高压蒸汽灭菌防止培养皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染(4)稀释涂布平板法 1.82×108少。